Utilisation des morpholinos pour désactiver l'expression génique
Morpholino-mediated gene silencing est une technique courante utilisée pour étudier les rôles des gènes spécifiques au cours du développement. Les mor…
Gène silencieux techniques sont couramment utilisés dans le domaine de la biologie du développement. Approches morpholino-knockdown régulièrement aux chercheurs à la fois identifier et caractériser des gènes impliqués dans les processus cellulaires importants. Antisens morpholinos sont maintenant très populaires dans de nombreux systèmes de modèle, y compris la souris, poussins et le poisson-zèbre, en raison de leur grande efficacité, une spécificité élevée et faible coût.
Cette vidéo donnera un aperçu des mécanismes morpholino et stratégies de microinjection, principaux contrôles expérimentaux et comment les morpholinos sont utilisés dans les laboratoires aujourd'hui pour étudier le développement des vertébrés.
Les morpholinos ont été développés tout d’abord comme un moyen d’inhiber la traduction des ARN transcrits dans les cellules vivantes et les organismes. Généralement, les morpholinos sont des molécules synthétiques, composés de 25 oligonucléotides reliés par une colonne vertébrale neutres chargée.
Mais bien que les morpholinos peuvent ressembler beaucoup à ADN, ils contiennent des anneaux de morpholine en lieu et place des groupes de sucre retrouvées dans phosphate sucre squelette. Cette conversion simple augmente la stabilité morpholino dans les cellules et réduit leur coût de production.
À l’intérieur des cellules, les morpholinos sont ciblés à l’ARN d’intérêt par appariement de base complémentaires. L’emplacement de l’ARN où le morpholino s’hybride détermine son mécanisme d’action spécifique.
Épissure bloquant les morpholinos se lient aux jonctions spécifiques et inhiber la transcription correcte transformation, alors que les morpholinos blocage traduction lier au sein de la région non traduite en 5' du gène près du lieu de départ et qu’assemblage du ribosome. Les deux types de morpholinos réduisent l’expression de protéines cibles fonctionnelles.
Lorsque vous planifiez une expérience utilisant les morpholinos, il y a quelques considérations importantes à garder à l’esprit. Les morpholinos peut être utilisés dans plusieurs systèmes de modèle, il est donc important de choisir un modèle qui est en mesure d’aborder la question biologique à portée de main.
Les morpholinos sont synthétisées dans le commerce et assistance conception professionnelle est disponible sans frais aux chercheurs, mais parce qu’ils sont des séquences spécifiques, information génétique pour toutes les cibles spécifiques morpholino devrait être d’origine avant de concevoir.
Dans le système de modèle de poisson-zèbre, il y a souvent deux copies de gènes unique qu’on retrouve chez d’autres vertébrés, en raison d’un événement de duplication du génome entier qui est survenue dans un ancêtre évolutionnaire du poisson-zèbre. Par conséquent, précipitation des deux gènes de poisson-zèbre peut être nécessaire avec succès les lacunes de protéine modèle dans le développement humain.
Conception de bons contrôles expérimentaux est tout aussi importante que de concevoir votre morpholinos ciblées. Toute donnée morpholino peut lier à des séquences spécifiques sur différents gènes. Il est conseillé d’utiliser les morpholinos indépendants, non-cumul complémentaires du même gène, afin d’assurer un changement phénotypique observé en raison de la précipitation de votre gène d’intérêt.
Maintenant que nous avons adressée morpholino expérimental, ayons Regardez comment les morpholinos sont introduits de poisson-zèbre.
Ici, nous allons décrire morpholino microinjection dans poisson zèbre. Pour plus de perspicacité et d’instructions sur les détails de la microinjection, s’il vous plaît référence le JoVE Science Education vidéo intitulé « Techniques de Microinjection de Zebrafish. »
Les morpholinos sont généralement injectés dans des embryons de poisson-zèbre entre le stade unicellulaire et quatre-, dans le jaune ou le cytoplasme de cellules. Des connexions cytoplasmiques entre cellules embryonnaires permettent une diffusion rapide et livraison omniprésent des morpholinos soluble dans l’eau tout au long de l’organisme. Les morpholinos sont stables dans les cellules, l’embryon de poisson zèbre étant déclenché à 28,5 ° C.
Volumes et concentrations d’injection optimale doivent être testés empiriquement pour chaque morpholino. En règle générale, la dose la plus faible au cours de laquelle il y a un phénotype fiable défini dans au moins 50-75 % des embryons injectées est utilisée afin d’éviter la létalité embryonnaire ou hors-cible des effets indésirables.
La plupart morpholino zebrafish phénotypes sont identifiés dans la première fécondation après trois jours, et de silençage génique est généralement efficace par le biais de cinq jours. Dans le cas de blocage d’épissage morpholinos, RT-PCR permet d’identifier les quantités relatives des transcriptions natives et altérées. Pour blocage traduction morpholinos, ordres de gène peuvent être évaluées par Western blot.
Le rapid développement externe et la transparence des embryons de poisson-zèbre permet une observation facile de nombreux processus biologiques précoces. Phénotypes morpholino peuvent généralement être marqués en analysant la morphologie microscope à fond clair ou la fluorescence, ainsi qu’en évaluant le comportement.
Après avoir défini le phénotype morpholino, sauvetage de RNA peut être effectuée pour démontrer la spécificité de cible. Après morpholino knockdown de l’ARNm endogène, ARNm synthétique est injecté, qui code la protéine même, mais ne contient pas la séquence cible morpholino. Si cet ARN injecté est en mesure de restaurer le phénotype sauvage de l’organisme, alors nous pouvons conclure que le phénotype observé morpholino est précisément à cause du gène cible se renversé.
Maintenant que vous avez une idée pour que les morpholinos sont et comment contrôlé morpholino expériences peuvent être effectuées, nous allons étudier comment les morpholinos sont appliquées dans les laboratoires de biologie aujourd'hui.
En biologie cellulaire, les morpholinos sont utilisés pour comprendre les processus de développement précoces. Écoulement de fluide cils généré dans la vésicule de Kupffer est un exemple, qui contrôle la structuration de la gauche-droite chez le poisson zèbre. Écoulement des fluides s’exécute dans le sens antihoraire dans des embryons de contrôle à injection, alors que le silence d’un gène qui régule l’organisation de cellules ciliées perturbe la direction et la vitesse de fluide.
Les morpholinos sont également très adaptées rapidement et sûrement modéliser des maladies génétiques humaines. Phénotypes de la perte de fonction peuvent être facilement reproduits en manipulant l’expression de la protéine, comme on le voit dans un modèle de poisson-zèbre de dysplasie humaine affichant des kystes rénaux, péricardique œdème et une queue enroulée. En outre, mutations pathogènes peuvent être rapidement dosées in vivo à l’aide d’ARNm sauvage ou mutant pour secourir les phénotypes maladies morpholino.
Étant donné que les morpholinos peuvent être introduits dans les cellules vivantes de différentes façons, ils sont très appréciés dans l’étude de développement et la régénération de l’orgue. Microinjection suivie d’une stimulation électrique des morpholinos dans des tissus spécifiques a permis aux chercheurs d’étudier la croissance de nageoire et la formation de la rétine chez le poisson zèbre adulte.
Vous avez juste regardé introduction de JoVE de silençage génique avec morpholinos. Dans cette vidéo, nous avons discuté de la structure et le mécanisme des morpholinos, applications courantes d’utilisation et des moyens importants pour évaluer l’efficacité et les effets de silençage génique ciblée. Parce qu’ils sont faciles à conception, très spécifiques et rentables, les morpholinos restera un acteur important dans le domaine de la génétique inverse, aidant à analyser sur le plan fonctionnel des gènes impliqués dans la maladie et le développement. Merci de regarder !
Gène silencieux techniques sont couramment utilisés dans le domaine de la biologie du développement. Approches morpholino-knockdown régulièrement aux chercheurs à la fois identifier et caractériser des gènes impliqués dans les processus cellulaires importants. Antisens morpholinos sont maintenant très populaires dans de nombreux systèmes de modèle, y compris la souris, poussins et le poisson-zèbre, en raison de leur grande efficacité, une spécificité élevée et faible coût.
Cette vidéo donnera un aperçu des mécanismes morpholino et stratégies de microinjection, principaux contrôles expérimentaux et comment les morpholinos sont utilisés dans les laboratoires aujourd'hui pour étudier le développement des vertébrés.
Les morpholinos ont été développés tout d’abord comme un moyen d’inhiber la traduction des ARN transcrits dans les cellules vivantes et les organismes. Généralement, les morpholinos sont des molécules synthétiques, composés de 25 oligonucléotides reliés par une colonne vertébrale neutres chargée.
Mais bien que les morpholinos peuvent ressembler beaucoup à ADN, ils contiennent des anneaux de morpholine en lieu et place des groupes de sucre retrouvées dans phosphate sucre squelette. Cette conversion simple augmente la stabilité morpholino dans les cellules et réduit leur coût de production.
À l’intérieur des cellules, les morpholinos sont ciblés à l’ARN d’intérêt par appariement de base complémentaires. L’emplacement de l’ARN où le morpholino s’hybride détermine son mécanisme d’action spécifique.
Épissure bloquant les morpholinos se lient aux jonctions spécifiques et inhiber la transcription correcte transformation, alors que les morpholinos blocage traduction lier au sein de la région non traduite en 5' du gène près du lieu de départ et qu’assemblage du ribosome. Les deux types de morpholinos réduisent l’expression de protéines cibles fonctionnelles.
Lorsque vous planifiez une expérience utilisant les morpholinos, il y a quelques considérations importantes à garder à l’esprit. Les morpholinos peut être utilisés dans plusieurs systèmes de modèle, il est donc important de choisir un modèle qui est en mesure d’aborder la question biologique à portée de main.
Les morpholinos sont synthétisées dans le commerce et assistance conception professionnelle est disponible sans frais aux chercheurs, mais parce qu’ils sont des séquences spécifiques, information génétique pour toutes les cibles spécifiques morpholino devrait être d’origine avant de concevoir.
Dans le système de modèle de poisson-zèbre, il y a souvent deux copies de gènes unique qu’on retrouve chez d’autres vertébrés, en raison d’un événement de duplication du génome entier qui est survenue dans un ancêtre évolutionnaire du poisson-zèbre. Par conséquent, précipitation des deux gènes de poisson-zèbre peut être nécessaire avec succès les lacunes de protéine modèle dans le développement humain.
Conception de bons contrôles expérimentaux est tout aussi importante que de concevoir votre morpholinos ciblées. Toute donnée morpholino peut lier à des séquences spécifiques sur différents gènes. Il est conseillé d’utiliser les morpholinos indépendants, non-cumul complémentaires du même gène, afin d’assurer un changement phénotypique observé en raison de la précipitation de votre gène d’intérêt.
Maintenant que nous avons adressée morpholino expérimental, ayons Regardez comment les morpholinos sont introduits de poisson-zèbre.
Ici, nous allons décrire morpholino microinjection dans poisson zèbre. Pour plus de perspicacité et d’instructions sur les détails de la microinjection, s’il vous plaît référence le JoVE Science Education vidéo intitulé « Techniques de Microinjection de Zebrafish. »
Les morpholinos sont généralement injectés dans des embryons de poisson-zèbre entre le stade unicellulaire et quatre-, dans le jaune ou le cytoplasme de cellules. Des connexions cytoplasmiques entre cellules embryonnaires permettent une diffusion rapide et livraison omniprésent des morpholinos soluble dans l’eau tout au long de l’organisme. Les morpholinos sont stables dans les cellules, l’embryon de poisson zèbre étant déclenché à 28,5 ° C.
Volumes et concentrations d’injection optimale doivent être testés empiriquement pour chaque morpholino. En règle générale, la dose la plus faible au cours de laquelle il y a un phénotype fiable défini dans au moins 50-75 % des embryons injectées est utilisée afin d’éviter la létalité embryonnaire ou hors-cible des effets indésirables.
La plupart morpholino zebrafish phénotypes sont identifiés dans la première fécondation après trois jours, et de silençage génique est généralement efficace par le biais de cinq jours. Dans le cas de blocage d’épissage morpholinos, RT-PCR permet d’identifier les quantités relatives des transcriptions natives et altérées. Pour blocage traduction morpholinos, ordres de gène peuvent être évaluées par Western blot.
Le rapid développement externe et la transparence des embryons de poisson-zèbre permet une observation facile de nombreux processus biologiques précoces. Phénotypes morpholino peuvent généralement être marqués en analysant la morphologie microscope à fond clair ou la fluorescence, ainsi qu’en évaluant le comportement.
Après avoir défini le phénotype morpholino, sauvetage de RNA peut être effectuée pour démontrer la spécificité de cible. Après morpholino knockdown de l’ARNm endogène, ARNm synthétique est injecté, qui code la protéine même, mais ne contient pas la séquence cible morpholino. Si cet ARN injecté est en mesure de restaurer le phénotype sauvage de l’organisme, alors nous pouvons conclure que le phénotype observé morpholino est précisément à cause du gène cible se renversé.
Maintenant que vous avez une idée pour que les morpholinos sont et comment contrôlé morpholino expériences peuvent être effectuées, nous allons étudier comment les morpholinos sont appliquées dans les laboratoires de biologie aujourd'hui.
En biologie cellulaire, les morpholinos sont utilisés pour comprendre les processus de développement précoces. Écoulement de fluide cils généré dans la vésicule de Kupffer est un exemple, qui contrôle la structuration de la gauche-droite chez le poisson zèbre. Écoulement des fluides s’exécute dans le sens antihoraire dans des embryons de contrôle à injection, alors que le silence d’un gène qui régule l’organisation de cellules ciliées perturbe la direction et la vitesse de fluide.
Les morpholinos sont également très adaptées rapidement et sûrement modéliser des maladies génétiques humaines. Phénotypes de la perte de fonction peuvent être facilement reproduits en manipulant l’expression de la protéine, comme on le voit dans un modèle de poisson-zèbre de dysplasie humaine affichant des kystes rénaux, péricardique œdème et une queue enroulée. En outre, mutations pathogènes peuvent être rapidement dosées in vivo à l’aide d’ARNm sauvage ou mutant pour secourir les phénotypes maladies morpholino.
Étant donné que les morpholinos peuvent être introduits dans les cellules vivantes de différentes façons, ils sont très appréciés dans l’étude de développement et la régénération de l’orgue. Microinjection suivie d’une stimulation électrique des morpholinos dans des tissus spécifiques a permis aux chercheurs d’étudier la croissance de nageoire et la formation de la rétine chez le poisson zèbre adulte.
Vous avez juste regardé introduction de JoVE de silençage génique avec morpholinos. Dans cette vidéo, nous avons discuté de la structure et le mécanisme des morpholinos, applications courantes d’utilisation et des moyens importants pour évaluer l’efficacité et les effets de silençage génique ciblée. Parce qu’ils sont faciles à conception, très spécifiques et rentables, les morpholinos restera un acteur important dans le domaine de la génétique inverse, aidant à analyser sur le plan fonctionnel des gènes impliqués dans la maladie et le développement. Merci de regarder !
Q1: What are morpholinos and how do they differ from DNA?
Morpholinos are synthetic molecules made up of 25 oligonucleotides connected by a neutrally charged backbone. Unlike DNA, morpholinos contain morpholine rings in place of sugar groups found in the phosphate sugar backbone. This structural difference increases morpholino stability in cells and lowers their production cost, making them cost-effective tools for gene silencing in developmental research.
Q2: How do splice-blocking and translation-blocking morpholinos work differently?
Splice-blocking morpholinos bind to specific junctions and inhibit proper transcript processing, while translation-blocking morpholinos bind within the 5' untranslated region near the translational start site and prevent ribosome assembly. Both types reduce expression of functional target proteins, but they achieve gene silencing through distinct molecular mechanisms targeting different stages of gene expression.
Q3: Why is using independent morpholinos important for experimental design?
Independent, non-overlapping morpholinos complementary to the same gene ensure that observed phenotypic changes are due to knockdown of your target gene, not off-target effects. Since any given morpholino can bind to specific sequences on different genes, using multiple morpholinos confirms specificity and strengthens the validity of your developmental genetics techniques and applications.
Q4: When and where are morpholinos typically injected into zebrafish embryos?
Morpholinos are typically injected into zebrafish embryos between the one- and four-cell stage, into the yolk or cell cytoplasm. Cytoplasmic connections between embryonic cells allow for rapid diffusion and ubiquitous delivery of water-soluble morpholinos throughout the organism. The lowest dose producing a defined reliable phenotype in 50-75% of injected embryos is used to avoid lethality or unwanted off-target effects.
Q5: How is RNA rescue used to confirm morpholino target specificity?
Following morpholino knockdown of endogenous mRNA, synthetic mRNA encoding the same protein but lacking the morpholino target sequence is injected. If this injected RNA restores the wild-type phenotype, the observed morpholino phenotype is specifically due to target gene knockdown. This validation step confirms that the gene silencing effect is genuine and not caused by off-target interactions.
Q6: What are practical applications of morpholinos in studying vertebrate development?
Morpholinos are used to study early developmental processes like cilia-generated fluid flow in Kupffer's vesicle, which controls left-right patterning in zebrafish. They also model human genetic diseases by reproducing loss-of-function phenotypes and rapidly assaying pathogenic mutations. Additionally, microinjection of morpholinos into specific tissues enables researchers to study tissue regeneration with somatic stem cells and organ formation in adult zebrafish.
Q7: Why are zebrafish particularly suitable for morpholino-based gene silencing studies?
Zebrafish are ideal for morpholino research due to their rapid external development, transparency, and ease of observation using brightfield or fluorescence microscopy. Morpholino phenotypes are typically identified within the first three days post-fertilization and remain effective through day five. Additionally, zebrafish often have two gene copies from a whole-genome duplication event, requiring knockdown of both genes to model human protein deficiencies.