Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

L'objectif général de cette nouvelle méthode de criblage pharmacologique par fluorométrie est de déterminer l'affinité de liaison de petites molécules médicamenteuses à une protéine cible, en formant des nano-amas fluorescents d'or au sein d'un moule protéique chargé en médicament. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments ciblant les protéines, notamment comment la force de liaison des molécules médicamenteuses peut influencer la stabilité des protéines vis-à-vis du dépliage, conduisant ainsi à la formation de nano-amas fluorescents d'or dont l'intensité varie. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de transformer une protéine cible en un biocapteur fluorescent, permettant ainsi un criblage rapide de petits médicaments moléculaires, sans nécessiter d'instrument sophistiqué ni d'étapes fastidieuses de marquage.

La combinaison de mes propres connaissances ainsi que de la découverte de la coauteure, qui a révélé que la protéine li a un effet de stabilisation distinct sur les nanoparticules plasmoniques, a inspiré l'idée de cette méthode. Commencez cette procédure par la préparation des réactifs chimiques pour le criblage médicamenteux, comme décrit dans le protocole écrit, afin de préparer les nanoagglomérats d'or templatisés par l'albumine humaine ou HSA : placez deux vials en verre, chacun contenant une barre magnétique microscopique, sur deux agitateurs magnétiques séparés dont la température est contrôlable.

Régler la température d’un agitateur magnétique à 60 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 200 microlitres de solution d’albumine sérique humaine, 200 microlitres d’eau ultrapure et 200 microlitres de solution de chlorure d’or dans chaque vial sous agitation constante afin de permettre l’encapsulation des ions d’or à l’intérieur du gabarit protéique ; deux minutes plus tard, ajouter 20 microlitres de solution d’hydroxyde de sodium dans chaque vial afin d’activer la capacité réductrice de l’albumine sérique humaine, conduisant à la formation d’amas nanostructurés d’or. Commencer à enregistrer le temps de réaction à zéro minute toutes les 20 minutes.

Prélvez 50 microlitres de chaque échantillon et transférez-les dans une plaque noire de 384 puits. Mesurez le spectre d'émission à l'aide d'un lecteur de plaques. Arrêtez le mélangeur magnétique après 100 minutes.

Refroidissez les vials en verre sous un filet d'eau courante dans un évier. Relevez les spectres d'émission photoluminescente à tous les instants pour chaque échantillon afin d'acquérir la cinétique de formation des nanoagrégats d'or dans différentes conditions de température. Pour préparer les nanoagrégats d'or portant de l'albumine sérique de bovin ou BSA comme matrice, placez un vial en verre contenant une barrette magnétique microscopique sur un agitateur magnétique.

Laisser la température à température ambiante. Mélanger 200 microlitres de solution de BSA, 200 microlitres d'urée et 200 microlitres de solution de chlorure d'or dans le flacon en verre sous agitation constante. Deux minutes plus tard, ajouter 20 microlitres de solution d'hydroxyde de sodium.

Pour activer la capacité réductrice de la BSA à former des nano-amas d'or et commencer à enregistrer le temps de réaction à zéro minute. Mesurer horairement le spectre d'émission photoélectrique du mélange réactionnel. Placer cinq vials en verre, chacun contenant une barrette aimantée et pré-étiquetés avec un médicament ou de l'HSA pure, sur un agitateur magnétique multiposition dont la température est contrôlable.

Ajouter 200 microlitres d'HSA à chaque flacon. Ensuite, ajouter un microlitre de chaque solution de médicament préparée précédemment aux quatre flacons correspondants. Ajouter également un microlitre de DMSO au témoin sur le mélangeur r.

Régler la vitesse de rotation à 360 tr/min et incuber pendant une heure afin de permettre la liaison du médicament à l'albumine sérique humaine. Une heure plus tard, ajouter 200 microlitres d'eau Milli-Q et 200 microlitres de solution de chlorure d'or dans chaque vial sous agitation constante. Régler la température à 60 degrés Celsius sous agitation constante pendant 10 minutes. Après 10 minutes, ajouter 20 microlitres de soude à 1,5 molaire dans chaque vial et commencer à enregistrer le temps de réaction à zéro minute.

Les solutions de réaction articulaires destinées à la mesure doivent suivre la même séquence d'ajout des médicaments et doivent être préparées aussi rapidement que possible afin de minimiser l'effet du décalage temporel. Prélevez rapidement 50 microlitres de solution à partir de chaque flacon. Transférez-les dans une plaque noire de 384 puits et mesurez le spectre d'émission. Enregistrez les spectres d'émission de chaque échantillon toutes les 10 minutes, en recueillant au moins quatre spectres à quatre moments différents.

Répétez ces étapes plusieurs fois afin d'obtenir des résultats présentant une tendance cohérente. Tracez les spectres de photoémission résolus en temps pour chaque échantillon. Identifiez l'intensité maximale de tous les échantillons et représentez-la en fonction du temps afin de comparer la cinétique de formation des nanoagrégats d'or dans différents gabarits protéiques chargés de médicament, dans le but de mesurer la constante de liaison entre chaque médicament et l'HSA.

Remplacez les solutions de médicament par des solutions d'ibuprofène à quatre concentrations différentes. Dix minutes plus tard, refroidissez les flacons en verre sous un filet d’eau courante dans un évier. Prélevez 50 microlitres des solutions ci-dessus à partir de chaque flacon vers une plaque noire de 384 puits et mesurez le spectre d’émission.

Répétez ces étapes deux fois supplémentaires afin d'obtenir deux autres séries de résultats à différentes concentrations du médicament avant d'arrêter l'agitation magnétique. Ensuite, tracez les spectres d'émission lumineuse et analysez les résultats bruts obtenus pour chaque lot individuel. Tracez les spectres d'émission lumineuse de chaque échantillon à l'aide d'un logiciel tel qu'Origin Pro et déterminez l'intensité maximale.

Calculez et tracez l'intensité de fluorescence relative en fonction de la concentration du médicament. Ensuite, calculez la constante de liaison en ajustant les données à un modèle de liaison à un seul site. Utilisez l'équation de Mics cementin pour effectuer cet ajustement dans un logiciel tel qu'Origin Pro.

Sélectionnez dans le menu l'analyse adaptée à l'ajustement de courbe non linéaire, puis choisissez la fonction hail dans la catégorie sigmoïde de croissance sur la page de sélection des fonctions de paramétrage. Cliquez sur ajuster pour afficher. Les résultats ajustés présentés ici sont des résultats représentatifs des spectres de photoémission résolus en temps de nano-amas d'or produits dans différentes conditions de dénaturation des protéines.

On peut observer que les nanoagglomérats d'or se forment plus rapidement à température élevée. Les conditions de dénaturation par l'urée peuvent également faciliter la synthèse directe de nanoagglomérats d'or en utilisant la protéine BSA comme matrice. Des résultats typiques du criblage fluorométrique rapide de médicaments, basé sur l'intensité de fluorescence des nanoagglomérats d'or utilisant l'HSA chargée de médicament comme matrice, sont présentés ici.

Plus l'intensité fluorescente est élevée, plus la force de liaison d'une molécule médicamenteuse à l'HSA est faible. Ces spectres montrent l'effet de la concentration de chargement du médicament sur la vitesse de formation de nano-amas d'or fluorescents à l'intérieur de l'HSA chargée d'ibuprofène. Plus la concentration du médicament est élevée, plus le signal fluorescent des nano-amas d'or résultants est faible. Ce résultat est un exemple représentatif de la détermination de la constante de liaison protéine-médicament.

Il est calculé en ajustant l'intensité relative de fluorescence des nano-amas d'or synthétisés dans le gabarit de protéine HSA préchargé avec des concentrations variables d'ibuprofène, à l'aide de l'équation MICUs cementin. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes pour l'analyse parallèle de plusieurs médicaments, à condition d'être exécutée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez désormais bien comprendre comment synthétiser des nano-amas d'or dans une protéine chargée de médicament, et comment déterminer l'affinité de liaison des médicaments à une protéine cible, grâce au signal fluorescent émis par les nano-amas d'or obtenus.