Name: Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez une méthode fluorimétrique rapide pour le criblage de médicaments ciblant les protéines en utilisant des nanoclusters d'or fluorescents synthétisés in situ. Cette technique permet de déterminer l'affinité de liaison des médicaments sans instrumentation complexe.

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Y.N.T. tient à remercier l’Agence pour la science, la technologie et la recherche (A*STAR) de Singapour pour son soutien financier dans le cadre de la subvention JCO CDA 13302FG063.

Attention: S&#39;il vous plaît consulter les fiches de données de sécurité (FDS) de tous les produits chimiques impliqués avant utilisation. L&#39;expérience de criblage de médicaments implique la synthèse et la manipulation des nanomatériaux, qui peut avoir des risques supplémentaires par rapport à leur homologue vrac. S&#39;il vous plaît assurer que toutes les mesures de contrôle nécessaires pour être pratiquées pendant toute l&#39;expérience, y compris l&#39;utilisation des contrôles d&#39;ingénierie (hottes) et équipement de protection individuelle (EPI, par exemple, un pantalon long de la sécurité, des chaussures fermées, des gants résistant aux produits chimiques, et des lunettes de sécurité). 1. Préparation des réactifs chimiques pour le dépistage de drogues <ol><li> Précurseurs pour la synthèse Au CN <ol><li> Dissoudre 30 mg de solution d&#39;or (III) de chlorure (99,99% métaux traces de base, 30 en poids.% Dans HCl dilué) dans 6,9 ml d&#39;eau ultra pure pour préparer 15 mM d&#39;or (III) de la solution de chlorure. Attention: solution de chlorure d&#39;or est corrosif et irritant. Porter l&#39;EPI approprié pour éviter le contact direct avec les yeux et la peau. </li><li> Dissolve 74 mg de HSA ou BSA dans 1 ml d&#39;eau ultra pure pour préparer 74 mg / ml de solution de protéines de stock. </li></ol></li><li> Solutions médicamenteuses <ol><li> Dissoudre la quantité désirée de médicament, par exemple, 1,9 mg de (a) l&#39;ibuprofène, 2,8 mg de (b) la warfarine, 2,3 mg de (c) la phénytoïne, et 1,5 mg de (d) sulfanilamide dans 20 pi de DMSO pour préparer 450 mM de solutions mères de médicament. Remarque: Le DMSO est choisi comme solvant parce que ces médicaments sont hydrophobes et ont une faible solubilité dans l&#39;eau. </li></ol></li><li> D&#39;autres réactifs <ol><li> Dissoudre 600 mg de NaOH en pastilles dans 10 ml d&#39;eau ultra-pure pour préparer 1,5 M de solution de NaOH. Dissoudre 2,4 g d&#39;urée dans 2 ml d&#39;eau ultra pure pour préparer 20 M de solution d&#39;urée. </li></ol></li></ol> 2. synthèse de la protéine-Templated Au CN <ol><li> HSA-templated Au CN (HSA-Au CN) <ol><li> Placez deux flacons en verre, chacune contenant une barre d&#39;agitation magnétique micro en elle, à deux température séparé agitation magnétique contrôlableRER. </li><li> Régler la température d&#39;un agitateur magnétique à 60 ° C, et l&#39;étiquette du flacon de verre sur le dessus de celui-ci en tant que &quot;60 ° C&quot;; tandis que l&#39;autre agitateur magnétique est maintenu à température ambiante (TA) lorsque le flacon de verre sur le dessus de celui-ci est marqué comme &quot;RT&quot;. </li><li> Ajouter 200 ul de solution de HSA, 200 ul d&#39;eau ultrapure, et 200 ul d&#39;une solution d&#39;or (III) de chlorure de chaque flacon sous agitation constante (défini comme 360 ​​tours par minute, sauf indication contraire) pour permettre l&#39;encapsulation de Au ions à l&#39;intérieur du gabarit de la protéine. </li><li> 2 minutes plus tard, ajouter 20 ul de solution de NaOH à chaque flacon de manière à activer la capacité réductrice de la HSA dans la formation Au CN et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min. </li><li> Chaque 20 min, tirer 50 pl de solutions à partir de chacun de l&#39;échantillon d&#39;une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d&#39;émission avec un lecteur de microplaque. La configuration typique de balayage: λ ex = 370 nm, λ em = 410-850 nm. </li><li> Arrêtez l&#39;agitateur magnétique après 100 min. </li><li> Refroidir les flacons de verre sous l&#39;eau courante dans un évier. Attention: Les flacons de verre sont chauds. Porter des gants résistants à la chaleur pour éviter de brûler. </li><li> Tracer les spectres de photoémission en tout temps pour chaque échantillon d&#39;acquérir la cinétique de formation de Au CN à différentes conditions de température. </li></ol></li><li> BSA-templated Au CN (BSA-Au CN) <ol><li> Placez un flacon en verre contenant une barre d&#39;agitation magnétique micro sur le dessus d&#39;un agitateur magnétique. Laisser la température que la température ambiante. </li><li> Mélanger 200 ul de solution de BSA, 200 ul d&#39;urée, et 200 pl de solution d&#39;or (III) de chlorure dans le flacon en verre sous agitation constante. </li><li> 2 minutes plus tard, ajouter 20 ul de solution de NaOH à activer la capacité de réduction de BSA pour former Au CN et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min. Mesurer le spectre du mélange de réaction de photoémission horaire. Remarque: Le spectre de BSA-Au CN photoémission est mesuréemoins fréquemment parce que le taux de BSA-Au CN formation est plus lente que celle de la HSA-Au à la même température en raison de moins d&#39;efficacité de l&#39;urée pour déplier la protéine. </li><li> Arrêtez l&#39;agitateur magnétique après 7 h. Tracer les spectres de photoémission en tout temps pour voir la cinétique de formation de Au CN par l&#39;urée dénaturation. </li></ol></li></ol> Projection 3. Petit Drug moléculaire <ol><li> Écran affinité de liaison relative des différents médicaments à petites moléculaires à HSA <ol><li> Placez cinq flacons de verre, chacun contenant une barre d&#39;agitation magnétique en elle, au-dessus d&#39;une température contrôlable multipoint agitateur magnétique. Marquez ces flacons comme A, B, C et D, respectivement, pour chaque médicament, à savoir l&#39;ibuprofène, la warfarine, la phénytoïne et sulfanilamide. Étiqueter celui avec HSA pur comme contrôle. </li><li> Ajouter 200 pi de HSA à chaque flacon. Ajouter 1 pi de solution de médicament à quatre flacons correspondants. Ajouter 1 pi de DMSO à la commande. Allumez l&#39;agitateur et régler la vitesse de rotation à 360rpm et incuber pendant 1 heure pour permettre la liaison à la HSA médicament pour terminer. </li><li> 1 h plus tard, ajouter 200 ul d&#39;eau Milli-Q et les 200 ul de solution d&#39;or (III) de chlorure de chaque flacon sous agitation constante. Régler la température à 60 ° C sous agitation constante pendant 10 min. Ajouter 20 ul de NaOH 1,5 M dans chaque flacon et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min. </li><li> Dessiner rapidement 50 pi de solution de chaque flacon dans une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d&#39;émission (résultats étiquetés comme 0 min). Enregistrer les spectres d&#39;émission de chaque échantillon toutes les 10 min. Recueillir au moins quatre spectres à quatre fois différente, qui est de 0, 10, 20, et 30 min. </li><li> Répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.4 à plusieurs reprises pour obtenir des résultats avec une tendance constante. Arrêtez l&#39;agitateur magnétique. </li><li> Tracer les spectres de photoémission résolue en temps pour chaque échantillon (A - D, et de contrôle). Identifier l&#39;intensité du pic de tous les échantillons et complot contre le temps de comparer la cinétique de formation de Au CN en différents modèles de protéines chargés en médicament. </li></ol></li><li> Mesure de la constante de liaison d&#39;un médicament spécifique pour HSA <ol><li> Répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.4. Remplacer la solution de médicament avec des solutions d&#39;ibuprofène à quatre concentrations différentes (y compris un échantillon de contrôle utilisant HSA seulement sans charge de médicament). Marquer le flacon en verre en fonction de la concentration du médicament de manière correspondante. </li><li> 10 min plus tard, refroidir les flacons de verre sous l&#39;eau courante dans un évier. Attention: Les flacons de verre sont chauds. Porter des gants résistants à la chaleur pour éviter de brûler. </li><li> Dessinez 50 pi des solutions ci-dessus de chaque flacon dans une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d&#39;émission. </li><li> Répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.3 deux fois de plus d&#39;obtenir deux autres ensembles de résultats à différentes concentrations de médicaments. </li><li> Arrêtez l&#39;agitateur magnétique. Tracer les spectres de photoémission et analyser les résultats. <ol><li> Pour les données brutes obtenues dans chaque lot individuel, tracer le spectre de photoémission de chaqueéchantillon dans les logiciels tels que les logiciels OriginPro et découvrir l&#39;intensité maximale. </li><li> Calculer et tracer l&#39;intensité de fluorescence relative [(I 0 - I) / I 0] contre la concentration du médicament, où je et je 0 réfère à l&#39;intensité de fluorescence de Au CN formée dans la drogue chargé HSA et pure HSA, respectivement. </li><li> Calcul de la constante de liaison en ajustant les données à un modèle de liaison à site unique en utilisant l&#39;équation de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), où R max indique le signal de réponse maximale, C est la concentration du ligand D et K est la constante de liaison. Effectuez cette dans des logiciels tels que OriginPro. Sélectionnez le menu Analyse non linéaire d&#39;adaptation Curve Fit, puis sélectionnez la fonction Hill, de croissance / catégorie Sigmoidal. Sur les paramètres: la page de sélection de fonction, cliquez sur Ajuster pour montrer les résultats ajustés. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Analysis+of+Ligand-Induced+Changes+in+Protein+Thermal+Unfolding+Applied+to+High-Throughput+Determination+of+Ligand+Affinities+with+Extrinsic+Fluorescent+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistr%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes.</a> Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).</li>
<li>Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Based+Fluorescent+Metal+Nanoclusters+for+Small+Molecular+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening.</a> Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).</li>
<li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nuclear+Magnetic+Resonance+Affinity+Screening+Methods+for+Functional+Annotation+of+Proteins+and+Drug+Discover%22">Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover</a>. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il ya plusieurs étapes critiques qui doivent être mis en évidence dans cette méthode. Dans le protocole de criblage de l&#39;affinité de liaison relative des différents médicaments à petites moléculaires, les étapes 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 et sont essentiels pour obtenir de bons résultats montrant tendance constante pour la force relative de liaison. Dans ces étapes, les actions de l&#39;ajout de produits chimiques et de l&#39;élaboration de solutions de réaction pour la mesure doivent être aussi rapidement que possible afi...

Les albumines sériques telles que l&#39;albumine de sérum humain (HSA) et l&#39;albumine de sérum bovin (BSA) sont la protéine la plus abondante dans le plasma et jouent un rôle vital dans le maintien de la pression osmotique du compartiment sang. Ils sont également reconnus comme protéines porteuses pour les petites molécules de faible solubilité dans l&#39;eau, tels que les stéroïdes, les acides gras, les hormones thyroïdiennes, et une grande variété de médicaments. La propriété de liaison (par exemple, les sites de liaison, d&#39;affinité ou force de liaison) de ces molécules au sérum albumines forme un sujet important de la pharmacocinétique. 1-4 Plusieurs méthodes analytiques ont été développées pour étudier les propriétés de liaison de différents médicaments à la sérum albumine, comme cristallographie aux rayons X, 5,6 résonance magnétique nucléaire (RMN), 7-11 et la résonance plasmonique de surface (SPR), 12,13, etc. Cependant, ces méthodes sont limitées soit par un processus d&#39;analyse fastidieux et prend du temps (par exemple, la croissance de monocristal pour cristallographique aux rayons Xétude graphique), l&#39;exigence de l&#39;équipement spécialisé et coûteux (SPR), ou dans le besoin de marquage isotopique coûteuse (RMN) pour la détection. Il est donc hautement souhaitable de développer des moyens alternatifs pour les petites criblage moléculaire de la drogue d&#39;une manière rapide, straight-forward, et rentable. Nanoclusters de l&#39;or (Au ​​CN) sont un type spécial de nanomatériau qui contiennent plusieurs dizaines d&#39;atomes de métal avec des tailles inférieures à 2 nm. 14-17 Ils ont attiré de vastes intérêts de recherche en raison de leur structure électronique discrète et dépendant de la taille, 18, 19 et moléculaire, comme des absorptions et des émissions. 20-23 Ces propriétés des matériaux uniques, en particulier la fluorescence forte, ont trouvé diverses applications telles que la détection et l&#39;imagerie dans des systèmes biologiques. 24-32 Ultrasmall fluorescent Au CN peut être synthétisé en utilisant des protéines fonctionnelles, telles que les albumines sériques, comme matrice. 33 Dans une synthèse typique de protéine sur matrice de<html> Au CN, une certaine quantité de sels sont des Au premier encapsulé à l&#39;intérieur de la protéine et par la suite réduite de la protéine elle-même. Le pouvoir réducteur de la protéine constituant est attribuée à des résidus d&#39;acides aminés fonctionnels (par exemple, tyrosine) qui peuvent être activés en augmentant le pH de la solution à alcalin. Déroulement de la structure de protéine est considérée comme une étape critique pour la formation de Au CN. En effet, dans une protéine dépliée, plusieurs groupes fonctionnels réducteurs peuvent être exposés à l&#39;UA sels encapsulés. Dépliage de la protéine peut être obtenue par traitement thermique ou exposition à des agents dénaturants. Introduction de médicaments à petites moléculaires peut également affecter le processus de déroulement, à savoir la modification de la température de dénaturation milieu et l&#39;enthalpie de déroulement. 34,35 L&#39;effet de tous ces facteurs, à son tour, peut être réfléchie par la cinétique de formation de fluorescente Au CN et manifesté dans l&#39;intensité de fluorescence des résultantes Au CN. 36 e_content &quot;&gt; Cette vidéo montre le procédé de criblage de médicaments par synthèse Au CN en protéines d&#39;albumine médicament chargé à une température élevée (60 ° C) ou en présence d&#39;agents dénaturants (par exemple urée). L&#39;intensité de fluorescence de la résultante Au CN est la lecture du signal. Tout d&#39;abord, Au-CN sont synthétisés dans HSA et BSA modèles traités à 60 ° C ou en présence d&#39;urée pour montrer comment la protéine dépliage (induite par un traitement thermique ou dénaturants) affecte la cinétique de formation de Au CN. Deuxièmement, Au CN sont synthétisés dans les modèles de protéines préchargés avec différents médicaments, et l&#39;effet de chargement de médicament sur les intensités relatives de fluorescence de résultante Au CN est étudié, qui fournissent la mesure de la force relative de liaison. Enfin, le protocole de dépistage Au NC-médicament est modifiée pour la mesure quantitative de protéine-médicament constante de liaison (K D) en faisant varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine d&#39;une concentration fixe.

<table><tbody><tr><td>Solution de chlorure d’or (III), 30 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>484385</td> Albumine sérique humaine <td>corrosive et irritante</td></tr><tr><td>, 96 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1887</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine, 96 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofène, 98 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I4883.</td><td></td></tr><tr><td>warfarine, 98 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2250</td><td></td></tr><tr><td>phénytoïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1139</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide, 99 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>diméthyl sulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>urée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>221465</tr><tr><td>Agitateur magnétique</td><td>IKA</td><td>RT5</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 384 puits</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipette à déplacement d’air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 000 &#956 ; l pipette à déplacement d’air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &#956 ; l pipette à déplacement d’air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 000 &#956 ; l pourboires</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>1 000 &#956 ; l Pointes</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>100 &#956 ; l Embouts</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>Microtube de 1,5 ml</td> Flacon en verre <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 20 ml avec bouchon</td><td></td><td></td><td></td>à vis</tr><tr><td>Flacon en verre de 4 ml avec bouchon</td><td></td><td></td><td></td> à vis</tr></tbody></table>

un rapide et quantitative méthode fluorimétrique pour small molecule dépistage du médicament protéique ciblage

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Nous démontrons une nouvelle méthode de criblage de médicaments pour la détermination de l&#39;affinité de liaison de petites molécules de médicament à une protéine cible par formation d&#39;nanoclusters fluorescentes d&#39;or (Au CN) au sein de la protéine de médicament chargé, sur la base du signal de fluorescence différentielle émis par le Au CN. Des protéines telles que l&#39;albumine de sérum albumine humaine (HSA) et l&#39;albumine de sérum bovin (BSA) sont sélectionnées comme les protéines du modèle. Quatre petits médicaments moléculaires (par exemple, l&#39;ibuprofène, la warfarine, la phénytoïne et sulfanilamides) de différentes affinités de liaison aux protéines d&#39;albumine sont testés. Il a été constaté que le taux de formation de fluorescence Au CN à l&#39;intérieur de la protéine d&#39;albumine de médicament chargée dans des conditions de dénaturation (par exemple, 60 ° C ou en présence d&#39;urée) est plus lente que celle formée dans la protéine intacte (sans médicament). En outre, l&#39;intensité de fluorescence du CN comme formé se trouve être inversement corrélée aux affinités de liaison de ces médicaments contre les protéines d&#39;albumine. En particulier,plus l&#39;affinité de liaison protéine-médicament, le ralentissement de la vitesse de formation Au CN, et donc une intensité de fluorescence inférieure de la résultante Au CN est observée. L&#39;intensité de fluorescence de la résultante Au CN fournit donc une mesure simple de la force de liaison relative des différents médicaments testés. Cette méthode est également extensible pour mesurer la constante de liaison spécifique médicament-protéine (K D) en faisant simplement varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine à une concentration en protéine déterminée. Les résultats mesurés correspondent bien avec les valeurs obtenues en utilisant d&#39;autres méthodes de prestige, mais plus compliquées.

Dépliement des protéines est une procédure importante pour la formation de protéines templated Au CN parce que les groupes fonctionnels plus réactifs (par exemple, des résidus de tyrosine) d&#39;une protéine peuvent être exposés à réduire les ions Au encapsulés et donc accélérer le rythme de Au CN de formation. De chauffage et de dénaturation externe agents sont deux moyens communs pour promouvoir le processus de déroulement des protéines. La figure 1 montre l&#39;effet de la chaleur et en ajou...

Un protocole pour le criblage de petits médicaments moléculaires basé sur la synthèse in situ de nanoclusters d’or fluorescents ultra-petits (NC Au) en utilisant des protéines chargées de médicaments comme modèle est présenté. Cette méthode est simple pour déterminer l’affinité de liaison des médicaments à une protéine cible par un signal fluorescent visible émis par les NC Au à matrice de protéines.

Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

L'objectif général de cette nouvelle méthode de criblage pharmacologique par fluorométrie est de déterminer l'affinité de liaison de petites molécules médicamenteuses à une protéine cible, en formant des nano-amas fluorescents d'or au sein d'un moule protéique chargé en médicament. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments ciblant les protéines, notamment comment la force de liaison des molécules médicamenteuses peut influencer la stabilité des protéines vis-à-vis du dépliage, conduisant ainsi à la formation de nano-amas fluorescents d'or dont l'intensité varie. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de transformer une protéine cible en un biocapteur fluorescent, permettant ainsi un criblage rapide de petits médicaments moléculaires, sans nécessiter d'instrument sophistiqué ni d'étapes fastidieuses de marquage.La combinaison de mes propres connaissances ainsi que de la découverte de la coauteure, qui a révélé que la protéine li a un effet de stabilisation distinct sur les nanoparticules plasmoniques, a inspiré l'idée de cette méthode. Commencez cette procédure par la préparation des réactifs chimiques pour le criblage médicamenteux, comme décrit dans le protocole écrit, afin de préparer les nanoagglomérats d'or templatisés par l'albumine humaine ou HSA : placez deux vials en verre, chacun contenant une barre magnétique microscopique, sur deux agitateurs magnétiques séparés dont la température est contrôlable.Régler la température d’un agitateur magnétique à 60 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 200 microlitres de solution d’albumine sérique humaine, 200 microlitres d’eau ultrapure et 200 microlitres de solution de chlorure d’or dans chaque vial sous agitation constante afin de permettre l’encapsulation des ions d’or à l’intérieur du gabarit protéique ; deux minutes plus tard, ajouter 20 microlitres de solution d’hydroxyde de sodium dans chaque vial afin d’activer la capacité réductrice de l’albumine sérique humaine, conduisant à la formation d’amas nanostructurés d’or. Commencer à enregistrer le temps de réaction à zéro minute toutes les 20 minutes.Prélvez 50 microlitres de chaque échantillon et transférez-les dans une plaque noire de 384 puits. Mesurez le spectre d'émission à l'aide d'un lecteur de plaques. Arrêtez le mélangeur magnétique après 100 minutes.Refroidissez les vials en verre sous un filet d'eau courante dans un évier. Relevez les spectres d'émission photoluminescente à tous les instants pour chaque échantillon afin d'acquérir la cinétique de formation des nanoagrégats d'or dans différentes conditions de température. Pour préparer les nanoagrégats d'or portant de l'albumine sérique de bovin ou BSA comme matrice, placez un vial en verre contenant une barrette magnétique microscopique sur un agitateur magnétique.Laisser la température à température ambiante. Mélanger 200 microlitres de solution de BSA, 200 microlitres d'urée et 200 microlitres de solution de chlorure d'or dans le flacon en verre sous agitation constante. Deux minutes plus tard, ajouter 20 microlitres de solution d'hydroxyde de sodium.Pour activer la capacité réductrice de la BSA à former des nano-amas d'or et commencer à enregistrer le temps de réaction à zéro minute. Mesurer horairement le spectre d'émission photoélectrique du mélange réactionnel. Placer cinq vials en verre, chacun contenant une barrette aimantée et pré-étiquetés avec un médicament ou de l'HSA pure, sur un agitateur magnétique multiposition dont la température est contrôlable.Ajouter 200 microlitres d'HSA à chaque flacon. Ensuite, ajouter un microlitre de chaque solution de médicament préparée précédemment aux quatre flacons correspondants. Ajouter également un microlitre de DMSO au témoin sur le mélangeur r.Régler la vitesse de rotation à 360 tr/min et incuber pendant une heure afin de permettre la liaison du médicament à l'albumine sérique humaine. Une heure plus tard, ajouter 200 microlitres d'eau Milli-Q et 200 microlitres de solution de chlorure d'or dans chaque vial sous agitation constante. Régler la température à 60 degrés Celsius sous agitation constante pendant 10 minutes. Après 10 minutes, ajouter 20 microlitres de soude à 1,5 molaire dans chaque vial et commencer à enregistrer le temps de réaction à zéro minute.Les solutions de réaction articulaires destinées à la mesure doivent suivre la même séquence d'ajout des médicaments et doivent être préparées aussi rapidement que possible afin de minimiser l'effet du décalage temporel. Prélevez rapidement 50 microlitres de solution à partir de chaque flacon. Transférez-les dans une plaque noire de 384 puits et mesurez le spectre d'émission. Enregistrez les spectres d'émission de chaque échantillon toutes les 10 minutes, en recueillant au moins quatre spectres à quatre moments différents.Répétez ces étapes plusieurs fois afin d'obtenir des résultats présentant une tendance cohérente. Tracez les spectres de photoémission résolus en temps pour chaque échantillon. Identifiez l'intensité maximale de tous les échantillons et représentez-la en fonction du temps afin de comparer la cinétique de formation des nanoagrégats d'or dans différents gabarits protéiques chargés de médicament, dans le but de mesurer la constante de liaison entre chaque médicament et l'HSA.Remplacez les solutions de médicament par des solutions d'ibuprofène à quatre concentrations différentes. Dix minutes plus tard, refroidissez les flacons en verre sous un filet d’eau courante dans un évier. Prélevez 50 microlitres des solutions ci-dessus à partir de chaque flacon vers une plaque noire de 384 puits et mesurez le spectre d’émission.Répétez ces étapes deux fois supplémentaires afin d'obtenir deux autres séries de résultats à différentes concentrations du médicament avant d'arrêter l'agitation magnétique. Ensuite, tracez les spectres d'émission lumineuse et analysez les résultats bruts obtenus pour chaque lot individuel. Tracez les spectres d'émission lumineuse de chaque échantillon à l'aide d'un logiciel tel qu'Origin Pro et déterminez l'intensité maximale.Calculez et tracez l'intensité de fluorescence relative en fonction de la concentration du médicament. Ensuite, calculez la constante de liaison en ajustant les données à un modèle de liaison à un seul site. Utilisez l'équation de Mics cementin pour effectuer cet ajustement dans un logiciel tel qu'Origin Pro.Sélectionnez dans le menu l'analyse adaptée à l'ajustement de courbe non linéaire, puis choisissez la fonction hail dans la catégorie sigmoïde de croissance sur la page de sélection des fonctions de paramétrage. Cliquez sur ajuster pour afficher. Les résultats ajustés présentés ici sont des résultats représentatifs des spectres de photoémission résolus en temps de nano-amas d'or produits dans différentes conditions de dénaturation des protéines.On peut observer que les nanoagglomérats d'or se forment plus rapidement à température élevée. Les conditions de dénaturation par l'urée peuvent également faciliter la synthèse directe de nanoagglomérats d'or en utilisant la protéine BSA comme matrice. Des résultats typiques du criblage fluorométrique rapide de médicaments, basé sur l'intensité de fluorescence des nanoagglomérats d'or utilisant l'HSA chargée de médicament comme matrice, sont présentés ici.Plus l'intensité fluorescente est élevée, plus la force de liaison d'une molécule médicamenteuse à l'HSA est faible. Ces spectres montrent l'effet de la concentration de chargement du médicament sur la vitesse de formation de nano-amas d'or fluorescents à l'intérieur de l'HSA chargée d'ibuprofène. Plus la concentration du médicament est élevée, plus le signal fluorescent des nano-amas d'or résultants est faible. Ce résultat est un exemple représentatif de la détermination de la constante de liaison protéine-médicament.Il est calculé en ajustant l'intensité relative de fluorescence des nano-amas d'or synthétisés dans le gabarit de protéine HSA préchargé avec des concentrations variables d'ibuprofène, à l'aide de l'équation MICUs cementin. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes pour l'analyse parallèle de plusieurs médicaments, à condition d'être exécutée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez désormais bien comprendre comment synthétiser des nano-amas d'or dans une protéine chargée de médicament, et comment déterminer l'affinité de liaison des médicaments à une protéine cible, grâce au signal fluorescent émis par les nano-amas d'or obtenus.

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Dans cette vidéo, nous décrivons la technique d’anisotropie de fluorescence pour étudier les interactions entre la protéine du syndrome de Shwachman-diamond (SBDS) marquée au fluorophore et la GTPase 1 de type facteur d’allongement 1 (EFL1). Lors de l’incubation de protéines SBDS avec des concentrations progressivement croissantes d’EFL1, une augmentation constante de l’anisotropie est observée, indiquant une interaction réussie entre les deux protéines.

Détection des interactions protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l'affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

La fluorimétrie différentielle à balayage est une méthode largement utilisée pour cribler des bibliothèques de petites molécules pour les interactions avec les protéines. Nous présentons ici une méthode simple pour étendre ces analyses afin de fournir une estimation de la constante de dissociation entre une petite molécule et son partenaire protéique.

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

Nous présentons dans l'étude d'un nouveau test basé sur la fluorescence en utilisant des lymphocytes dérivés d'une souris transgénique. Ce dosage est adapté pour le criblage à haut débit (HTS) de petites molécules dotées de la capacité de l'une ou l'inhibition de la promotion de l'activation des lymphocytes.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

Dans cette étude, nous avons amélioré les capacités d'analyse de données de l'expérience DARTS en surveillant les changements dans la stabilité des protéines et en estimant l'affinité des interactions protéines-ligands. Les interactions peuvent être tracées en deux courbes : une courbe protéolytique et une courbe dose-dépendance. Nous avons utilisé l'interaction mTOR-rapamycine comme un cas exemplaire.

Un test de stabilité cible sensible à l'affinité semi-quantitative des médicaments (DARTS) pour étudier l'interaction Rapamycin/mTOR

Cette étude visait à présenter une stratégie pour identifier les interactions médicament-peptide. La stratégie consiste à biopanner les peptides courts reconnaissant les médicaments à partir d'un biocapteur de microbalance quartz-cristal (QCM), suivi d'une analyse bioinformatique pour évaluer quantitativement les informations obtenues pour la reconnaissance et l'annotation des sites de liaison médicamenteux sur les protéines.

Stratégie d&apos;analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines

La surveillance des changements dans la température de fusion d’une protéine cible(c.-à-d.essai de décalage thermique, TSA) est une méthode efficace pour filtrer les bibliothèques de fragments de quelques centaines de composés. Nous présentons un protocole TSA mettant en œuvre la fluorimétrie à balayage nano-différentiel assistée par robotique (nano-DSF) pour surveiller la fluorescence intrinsèque du tryptophane et la rétrodiffusion de la lumière pour le criblage des fragments.

Fluorimétrie à balayage nano-différentiel pour le criblage dans la découverte de plomb à base de fragments

Le présent protocole décrit une procédure pour effectuer une chromatographie d’exclusion de taille fluorescente (FSEC) sur les protéines membranaires afin d’évaluer leur qualité pour l’analyse fonctionnelle et structurale en aval. Des résultats CSEM représentatifs recueillis pour plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dans des conditions solubilisées et sans détergent sont présentés.

Évaluation rapide de la qualité des protéines membranaires par chromatographie d’exclusion de taille fluorescente

L’expérience utilisée ici montre une méthode d’amarrage moléculaire combinée à un test de décalage thermique cellulaire pour prédire et valider l’interaction entre les petites molécules et les cibles protéiques.

Prédiction et validation de cibles protéiques de composés à petites molécules

Le test qIT (quantitative irreversible tethering) est une méthode basée sur la fluorescence permettant d’identifier des fragments covalents qui s’engagent sélectivement avec une protéine cible. Ici, un protocole détaillé est décrit pour décrire le test qIT, avec des exemples de résultats inclus.

Criblage de fragments covalents à l’aide du test quantitatif de liaison irréversible

Ce protocole introduit une méthodologie de dépistage fluorométrique optimisée pour identifier les inhibiteurs naturels de produits et petites molécules de la synthèse protéique. Sa praticité le rend adapté à la fois à l’enseignement de premier cycle en techniques de découverte de médicaments et à la mise en œuvre dans des campagnes de chimie médicinale.

Un protocole basé sur la fluorescence pour le dépistage préliminaire des inhibiteurs de synthèse protéique provenant de sources naturelles

Découvrez une méthode fluorimétrique rapide pour le criblage de médicaments ciblant les protéines en utilisant des nanoclusters d'or fluorescents synthétisés in situ. Cette technique permet de déterminer l'affinité de liaison des médicaments sans instrumentation complexe.

Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

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