Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

L’objectif global de cette nouvelle méthode de criblage fluorométrique est de déterminer l’affinité de liaison de petites molécules médicamenteuses à une protéine cible en formant des nano-clusters d’or fluorescents dans la matrice de protéine chargée de médicament. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du ciblage des protéines, les découvertes de médicaments, telles que la façon dont la force de vidding des molécules de médicament peut affecter la stabilité des protéines à partir du dépliement, conduisant à la formation de nano-amas d’or fluorescents de différentes intensités. Le principal avantage de ce tenix est que nous pouvons transformer une cible protéique en un biocapteur fluorescent pour permettre un criblage rapide de petits médicaments moléculaires sans avoir besoin d’instruments sophistiqués et d’étapes de marquage fastidieuses.

La combinaison de mes propres connaissances et de la co-auteure, elle a découvert que la protéine a un effet stabilisateur distinct sur le plasmonique. Les nanoparticules ont inspiré l’idée de cette méthode. Commencez cette procédure par la préparation des réactifs chimiques pour le criblage de médicaments, comme détaillé dans le protocole de texte pour préparer les nano-grappes d’or à base d’albumine sérique humaine ou de modèles HSA, placez deux flacons en verre contenant chacun une barre d’agitation micromagnétique sur deux agitateurs magnétiques distincts à température contrôlée.

Réglez la température d’un agitateur magnétique à 60 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution d’albumine sérique humaine, 200 microlitres d’eau ultrapure et 200 microlitres de solution de chlorure d’or dans chaque flacon sous agitation constante pour permettre l’encapsulation des ions d’or à l’intérieur de la matrice protéique, deux minutes plus tard, ajoutez 20 microlitres de solution d’hydroxyde de sodium dans chaque flacon afin d’activer la capacité réductrice de l’albumine sérique humaine informant les nanograppes d’or. Commencez à enregistrer le temps de réaction à zéro minute toutes les 20 minutes.

Prélever 50 microlitres de chaque échantillon et transférer sur une plaque noire de 384 puits. Mesurez le spectre d’émission à l’aide d’un lecteur de microplaques. Arrêtez l’agitation magnétique après 100 minutes.

Refroidissez les flacons en verre sous l’eau courante dans un évier. Tracez les spectres de photoémission à tout moment pour chaque échantillon afin d’acquérir la cinétique de formation des nano-amas d’or dans différentes conditions de température. Pour préparer les nano-grappes d’or à base d’albumine sérique bovine ou de BSA, placez un flacon en verre contenant une barre d’agitation micromagnétique sur le dessus d’une agitation magnétique.

Laissez la température à température ambiante. Mélangez 200 microlitres de solution BSA, 200 microlitres d’urée et 200 microlitres de solution de chlorure d’or dans le flacon en verre en agitant constamment. Deux minutes plus tard à 20 microlitres de solution d’hydroxyde de sodium.

Activer la capacité réductrice de BSA à former des nano-amas d’or et commencer à enregistrer le temps de réaction à zéro minute. Mesurez le spectre de photo-émission du mélange réactionnel toutes les heures. Placez cinq flacons en verre contenant chacun une barre d’agitation magnétique et pré-étiquetés avec un médicament ou un HSA pur sur une agitation magnétique multipoint à température contrôlable.

Ajoutez 200 microlitres de HSA dans chaque flacon. Ajoutez ensuite un microlitre de chaque solution médicamenteuse préalablement préparée dans les quatre fichiers correspondants. Ajoutez également un microlitre de DMSO à l’interrupteur de commande de l’agitateur.

Réglez la vitesse d’essorage à 360 tr/min et incubez pendant une heure pour permettre la liaison du médicament à HSA une heure plus tard à 200 microlitres d’eau milli Q et 200 microlitres de solution de chlorure d’or dans chaque flacon sous agitation constante. Réglez la température à 60 degrés Celsius en remuant constamment pendant 10 minutes. Après 10 minutes à 20 microlitres d’hydroxyde de sodium de 1,5 molaire à chaque lime et commencez à enregistrer le temps de réaction à zéro minute.

Les solutions de réaction articulaire pour la mesure doivent suivre la même séquence d’ajout de médicaments et doivent être pratiquées le plus rapidement possible pour minimiser l’effet de décalage temporel Prélever rapidement 50 microlitres de solution de chaque flacon. Transférez sur une plaque noire de 384 puits et mesurez le spectre d’émission. Enregistrez les spectres d’émission de chaque échantillon toutes les 10 minutes, en recueillant au moins quatre spectres à quatre moments différents.

Répétez ces étapes plusieurs fois pour obtenir des résultats avec une tendance constante. Tracez les spectres de photoémission résolus en temps pour chaque échantillon. Identifiez l’intensité maximale de tous les échantillons et tracez en fonction du temps pour comparer la cinétique de formation des nano-amas d’or dans différents modèles de protéines chargées de médicaments afin de mesurer la constante de liaison entre chaque médicament et le HSA.

Remplacez les solutions médicamenteuses par des solutions d’ibuprofène à quatre concentrations différentes. 10 minutes plus tard, refroidissez les flacons en verre sous l’eau courante dans un évier. Prélevez 50 microlitres des solutions ci-dessus de chaque flacon sur une plaque noire de 384 puits et mesurez le spectre d’émission.

Répétez ces étapes deux fois de plus pour obtenir deux autres séries de résultats à des concentrations de médicament différentes avant d’arrêter l’agitation magnétique. Ensuite, tracez les spectres de photoémission et analysez les résultats pour le brut obtenu dans chaque lot individuel. Tracez les spectres de photoémission de chaque échantillon dans un logiciel tel qu’Origin Pro et déterminez l’intensité maximale.

Calculez et tracez l’intensité relative de la fluorescence en fonction de la concentration du médicament. Calculez ensuite la constante de liaison en ajustant les données à un modèle de liaison de site unique. Utiliser l’équation de cimentation des micros pour le faire dans un logiciel tel qu’Origin Pro.

Sélectionnez le menu d’analyse d’ajustement d’ajustement de courbe non linéaire, puis sélectionnez la fonction de grêle dans la catégorie sigmoïdale de croissance sur la page de sélection de la fonction de paramètres. Cliquez sur ajuster pour afficher. Les résultats ajustés présentés ici sont des résultats représentatifs des spectres de photoémission résolus en temps de nano-amas d’or produits dans différentes conditions de dénaturation des protéines.

On peut observer que les nano-amas d’or se forment plus rapidement à une température plus élevée. La condition de dénaturation de l’urée peut également faciliter la synthèse directe de nano-amas d’or en utilisant la protéine BSA comme modèle. Les résultats typiques du criblage fluorométrique rapide des médicaments basé sur l’intensité de fluorescence des nanograppes d’or en utilisant le HSA chargé de médicament comme modèle sont présentés ici.

Plus l’intensité de la fluorescence est élevée, plus la force de liaison d’une molécule médicamenteuse à l’HSA est faible. Ces spectres montrent l’effet de la concentration de charge de médicament sur le taux de formation de nano-amas d’or fluorescents à l’intérieur du HSA chargé en ibuprofène. Plus la concentration du médicament est élevée, plus le signal fluorescent des nano-amas d’or résultants présentés ici est un résultat représentatif de la détermination de la constante de liaison aux protéines du médicament.

Il est calculé en ajustant l’intensité de fluorescence relative des nano-amas d’or synthétisés dans le modèle HSA préchargé avec un médicament à base d’ibuprofène de concentrations variées à l’aide de l’équation de cémentine MICUs Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes pour un criblage de plusieurs médicaments en parallèle si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser le rein, le nano-cluster dans la protéine chargée de médicaments, et de déterminer l’affinité de liaison des médicaments à une protéine cible telle que détectable par le signal fluorescent émis par les nano-clusters d’or résultants.