Utilisation Ex Vivo Cultures Upright gouttelettes de toute fœtus organes pour étudier les processus de développement au cours de la souris Organogenèse

L’objectif général de cette procédure est d’examiner les effets des inhibiteurs de petites molécules sur le développement des organes fœtaux à l’aide d’une technique de culture de gouttelettes ex vivo. Pour ce faire, il suffit d’ouvrir d’abord le péritoine d’une souris enceinte et de retirer l’embryon contenant l’utérus. Ensuite, les embryons sont retirés de l’utérus et sont libérés des sacs vitellin et amniotique.

Ensuite, le complexe aiguillon est disséqué et isolé de l’embryon. Enfin, le complexe Meris aiguillon est cultivé dans une gouttelette avec ou sans inhibiteur de petite molécule. En fin de compte, la microscopie à immunofluorescence est utilisée pour montrer les changements dans l’architecture des organes à l’aide d’anticorps spécifiques au type de cellule.

Ainsi, l’avantage de notre culture de gouttelettes verticales ex vivo de l’ensemble de l’organe par rapport aux lignées de culture cellulaire, par exemple, est qu’elle a l’avantage d’avoir une structure tridimensionnelle donnant lieu à des interactions cellulaires dues à la localité, ainsi qu’à une signalisation matriculaire extracellulaire qui peut être importante pour la formation et la structuration des organes. De plus, notre technique de gouttelettes verticales permet d’utiliser moins de réactifs, réduisant ainsi les coûts et la toxicité potentielle due aux effets secondaires. C’est un avantage par rapport aux autres techniques d’organes entiers, et cela permet toujours la diffusion d’agents pharmacologiques vers l’organe cible.

Bien que cette technique puisse donner un aperçu du développement vasculaire des testicules fœtaux, elle peut également être appliquée à d’autres organes fœtaux comme les poumons, et nous pouvons également l’utiliser pour étudier divers processus biologiques. Il existe d’autres voies de signalisation cellulaire au cours du développement fœtal à E 11,5. Après avoir euthanasié la souris enceinte, selon le texte, utilisez de l’éthanol à 70 % pour pulvériser l’abdomen avec des ciseaux fins.

Faites une incision en forme de V pour ouvrir la peau du ventre et le péritoine et tirez le lambeau de tissu vers l’arrière pour exposer les organes antérieurs. Localisez les ovaires aux deux extrémités de la corne utérine, puis avec des ciseaux coupez l’ovaire et le tissu conjonctif pour séparer l’utérus contenant les embryons du corps de la mère. Ensuite, ouvrez la paroi utérine en coupant doucement le côté opposé au placenta, exposant les sacs vitellins.

Veillez à ne pas percer le sac vitellin pour éviter d’endommager ou de perdre des embryons. Ensuite, coupez près du placenta pour retirer l’embryon contenant des sacs vitellins et placez-les dans un plat contenant du PBS avec du calcium et du magnésium, ce qui aidera à soutenir les molécules d’adhésion cellulaire pour maintenir l’architecture tissulaire et empêcher le tissu de coller aux outils Avec une pince, retirez le sac vitellin et l’amnios de l’embryon en perçant soigneusement le sac vitellin pour créer un trou dans lequel l’embryon peut glisser. Une fois qu’un embryon est à l’extérieur du sac vitellin, coupez le cordon ombilical.

À partir de ce moment, utilisez un microscope situé dans une hotte de culture de tissus stériles. Retirez la tête de l’embryon à l’aide d’une pince pour pincer de chaque côté du cou, jetez la tête, retirez la queue et placez-la dans un nouveau microtube de centrifugation pour une analyse X-Y-P-C-R afin de déterminer le sexe de l’embryon. Fixez maintenant l’embryon en position couchée contre le fond de la boîte de culture en utilisant une paire de pinces pour épingler les aisselles de l’embryon avec une autre paire de pinces.

Retirez la peau qui recouvre l’abdomen et retirez doucement le foie, les intestins et d’autres organes pour exposer la paroi arrière du corps où se trouve la crête urogénitale. Utilisez la pince pour ramasser sous la crête urogénitale en ouvrant soigneusement la pince et en la soulevant. Retirez la crête urogénitale.

Veillez à ne pas endommager les gonades. Transférez la crête urogénitale dans une boîte de C-D-M-E-M pour acclimater le tissu au milieu à l’aide d’aiguilles de calibre 27 pour séparer le complexe Sphs de la gonade du reste du pont urogénital. Utilisez une aiguille pour couper en appuyant et l’autre pour guider correctement le tissu afin de permettre une séparation optimale vers la culture.

La gonade avec un inhibiteur de petite molécule a réglé deux pipettes de 20 microlitres à 15 microlitres chacune à l’aide d’une lame de rasoir propre et stérilisée. Coupez environ un à deux millimètres de l’une des pointes de pipette barrière pour le transfert des gonades et l’ajout du contrôle C-D-M-E-M. Alignez les gonades avec leur axe long parallèle à la pointe de la pipette afin qu’elles puissent être facilement pipetées avec une pointe de coupure Étiquetez un côté du couvercle d’une boîte de 35 millimètres comme gouttelette de contrôle et l’autre comme gouttelette contenant le médicament.

Assurez-vous que les étiquettes sur les couvercles correspondent aux étiquettes sur le tissu de la queue contenant des microtubes à centrifuger. Pipette de 15 microlitres de C-D-M-E-M contenant une seule gonade dans une gouttelette dans le couvercle. Veillez à ce que les gonades ne collent pas à l’intérieur de l’embout de la pipette et répétez l’opération avec la deuxième gouttelette de l’autre côté.

Vérifiez au microscope que les gonades ont été transférées dans la gouttelette désignée comme témoin. À l’aide de la pipette de contrôle, ajoutez 15 microlitres supplémentaires de C-D-M-E-M contenant du DMSO pour obtenir une gouttelette de 30 microlitres à l’autre gouttelette. À l’aide de la pipette, à l’aide de la pipette, ajoutez 15 microlitres d’ITK, deux en C-D-M-E-M.

Étalez les gouttelettes dans un motif circulaire en expansion jusqu’à ce qu’elles aient un diamètre d’environ 15 à 18 millimètres et que la gonade soit située à peu près au milieu. Orientez la gonade de manière à ce qu’elle se couche sur le côté et que l’aiguillon et les désordres soient facilement distinguables. Orientez les poumons de manière à ce que les deux lobes soient à plat et maintenus en place par une tension superficielle sans se toucher.

Placez soigneusement le couvercle du plat de culture avec les gouttelettes à la verticale et à plat à plat sur la surface de l’eau dans un grand bol humidificateur, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles piégées en dessous et qu’aucune eau ne pénètre dans le couvercle. Pour créer une petite chambre humidifiée, couvrez immédiatement le grand plat avec son couvercle, en veillant à ce que les couvercles des petits plats puissent se déplacer librement dans le grand plat et à ce qu’un échange d’air puisse se produire. Une fois que les deux petits couvercles sont placés dans la chambre, placez immédiatement la chambre dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.

Effectuer la PCR et l’immunofluorescence selon le protocole textuel. Lorsqu’ils sont cultivés à l’aide du système de culture de gouttelettes Exvivo, les complexes de gona sphs fœtaux ont un taux de survie élevé, comme le montre ici. Les comparaisons des gonades E 11.5 lors de l’incubation initiale par rapport à 24 ou 48 heures en culture révèlent un changement spectaculaire dans la forme des gonades et l’apparence de structures de cordon en forme de rayures dans la gonade témoin XY, comme on le voit ici.

Le système de culture de gouttelettes peut recréer des événements de différenciation des testicules ex vivo, car il est possible de visualiser des cellules sertoli SOX neuf positives dans les gonades XY se formant en cordons de type tubo et une vascularisation se formant dans tout l’organe. Dans les poumons, une culture de 48 heures entraîne une augmentation de la ramification des branches épithéliales positives de SOX neuf eco herrin. Bien qu’il y ait une certaine augmentation des cellules apoptotiques dans les poumons, dans les mêmes conditions de culture, des niveaux similaires d’apoptose sont observés chez les témoins cultivés et in utero.

Les gonades suggèrent que la gonade est particulièrement adaptée aux conditions de culture. Pour examiner les effets de la vascularisation et du remodelage vasculaire dans la morphogenèse des testicules, l’inhibiteur de petite molécule TKI deux, qui bloque l’activité des récepteurs VEGF, a été utilisé. Les résultats démontrent que la perturbation du remodelage vasculaire dans le testicule fœtal est efficace dans le système de culture de gouttelettes, et que les défauts ultérieurs de la morphogenèse du cordon testiculaire peuvent être visualisés à la suite de cette procédure.

D’autres méthodes telles que la PCR quantitative en temps réel, le séquençage de l’ARN de nouvelle génération ou la cytométrie en flux peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont différents réactifs pharmacologiques affectent l’expression des protéines ou des gènes d’intérêt. De plus, nous pouvons utiliser l’imagerie en direct en accéléré pour visualiser la dynamique cellulaire en temps réel si des embryons fluorescents transgéniques sont utilisés. De plus, un large éventail de réactifs est disponible pour cibler les voies de signalisation candidates qui peuvent être impliquées dans l’organogenèse fœtale.

Ces techniques nous aideront à comprendre les mécanismes sous-jacents qui régissent le développement du fœtus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’effectuer des cultures de gouttelettes verticales ex vivo d’organes entiers afin d’élucider les voies de signalisation pendant l’organogenèse fœtale. Cette technique implique la dissection d’embryons en milieu de gestation, l’isolement des organes cibles et la préparation de cultures de gouttelettes dressées pour l’incubation de ces organes avec des réactifs pharmaceutiques.