Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

L'objectif général de cette procédure est d'analyser l'expression génique intracellulaire directement dans des cellules vivantes à l'aide de nanoparticules fluorescentes spécifiques aux gènes. Cela est réalisé en premier lieu en définissant les séquences cibles appropriées dans le gène d'intérêt. La deuxième étape consiste à fabriquer des nanoparticules dotées de brins capteurs et de brins rapporteurs spécifiques.

Ensuite, les nanoparticules sont ajoutées directement au milieu de culture des cellules vivantes. L'étape finale consiste à incuber les cellules avec les nanoparticules toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 dans une atmosphère humidifiée. Enfin, la microscopie de fluorescence est utilisée pour visualiser la fluorescence spécifique aux gènes dans les cellules cibles vivantes, tandis que l'analyse par cytométrie en flux permet de quantifier le nombre de cellules fluorescentes.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'immunohistochimie, les sondes moléculaires ou l'analyse PCR réside dans la possibilité d'observer visuellement l'expression génique dans des cellules vivantes, sans aucune manipulation du milieu de culture cellulaire. La procédure sera démontrée par Martina Teresa, biologiste et étudiante en doctorat de notre laboratoire, et Lynette Henkel, pour la cytométrie en flux. Après avoir déterminé les séquences cibles, commander des nanoparticules d'or lyophilisées auprès de fournisseurs commerciaux.

Ces particules sont composées d'une particule d'or centrale liée de façon covalente à une chaîne de capture, elle-même liée à une chaîne rapporteur. Lorsque l'ARNm cible se lie à la chaîne de capture, la chaîne rapporteur et son fluorophore associé sont libérés en solution, permettant au Fluor four d'émettre une fluorescence. Avant la reconstitution.

Les nanoparticules doivent être conservées à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière, dans une boîte en carton. Pour reconstituer les nanoparticules d'or, ajouter 20 microlitres d'eau doublement distillée, ce qui donne une concentration finale de 100 nano molaires. Les nanoparticules reconstituées peuvent être conservées à température ambiante à l'abri de la lumière pendant au moins un an.

Le jour de l'application, diluez la solution mère de nanoparticules d'or à une concentration de travail 20 x dans le PBS, retirez une plaque 24 puits contenant des cellules HEK 293 de l'incubateur de culture cellulaire, aspirez le milieu, puis ajoutez 237,5 microlitres de milieu de culture frais. Ajoutez ensuite 12,5 microlitres de la solution de travail de nanoparticules dans chaque puits préparé et agitez doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme des nanoparticules. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % CO₂ dans une atmosphère humidifiée. Le lendemain.

Analyser les cultures cellulaires pour la fluorescence spécifique du site trois du gène à l’aide d’un microscope fluorescent standard afin de préparer les cellules pour la cytométrie en flux. Laver les cellules HEK 293 présentant une fluorescence induite au site trois une fois avec du PBS et ajouter un millilitre de trypsine 0,05 % EDTA, incuber les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius et 5 % CO2. Après l’incubation, ajouter 0,5 millilitre de milieu CO et pipeter de haut en bas.

Ensuite, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez trois millilitres de milieu de culture et centrifugez le tube pendant cinq minutes à 300 ×g. Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 200 microlitres de tampon fax glacé. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre et conservez-les sur glace à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse.

Avant l'analyse en cytométrie en flux, faire passer les cellules à travers un filtre de 30 micromètres afin d'éviter l'agrégation cellulaire. Ensuite, ajouter de l'iodure de propidium aux cellules à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre pendant au moins deux minutes, amener les cellules au vortex du cytomètre en flux et charger le tube d'échantillon sur l'appareil. Pour détecter les cellules positives SI trois.

Utilisez des cellules contrôles non traitées pour définir les portes hiérarchiques sur le sous-ensemble de la surface de diffusion avant ou FSC par rapport à la surface de diffusion latérale ou SSC, le sous-ensemble de la hauteur FSC par rapport à la largeur FSC et le sous-ensemble de la hauteur SSE par rapport à la largeur SSE afin d'exclure les débris cellulaires et les cellules non dispersées. Éliminez les cellules mortes de l'analyse en fonction de la coloration par l'iodure de propidium en affichant le canal PE par rapport au canal PE Texas Red, puis effectuez la porte de tri finale sur les cellules positives PE au site trois. Détection de GA dh.

Un gène de référence exprimé de manière constitutive a été utilisé dans des cellules HEK 293 afin de valider la faisabilité expérimentale. Les nanoparticules de contrôle négatif désordonnées présentent une fluorescence faible ou nulle, contrairement à l'absorption positive qui fluoresce de manière permanente. Les témoins montrent un signal intense après une incubation nocturne.

On a démontré que ces nanoparticules détectent spécifiquement les marqueurs des cellules souches pluripotentes, l'expression génique de nano et de GDF trois, dans des cellules souches pluripotentes induites humaines et porcines, ou CPI. Il est important de noter que ces marqueurs n'ont été détectés que dans les CPI et non dans les cellules de fibroblastes utilisées comme couche nourricière lors de la culture des cellules SPI. Une analyse visuelle et quantitative par cytométrie en flux a été utilisée pour évaluer l'efficacité de marquage des nanoparticules GA DH, version graduée des nanoparticules de zéro à 1000.

Une analyse en pico-molaire a été réalisée avec des cellules HEK 293, qui ont montré une augmentation claire de la fluorescence dépendante de la concentration. Une analyse quantitative a ensuite été effectuée sur des cellules souches embryonnaires murines, révélant environ 40 % de cellules positives pour CY3 après l'ajout de nanoparticules GA DH à 400 pico-molaire. Des valeurs similaires ont été obtenues pour les marqueurs de pluripotence.

Nano et GDF trois une fois maîtrisés. Cette technique peut être réalisée en moins de 16 heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser des nanoparticules spécifiques aux gènes pour détecter directement l'expression génique intracellulaire dans des cellules vivantes à l'aide de la microscopie de fluorescence.