Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

Ce manuscrit décrit une nouvelle technique qui permet la détection de l’expression génique intracellulaire après endocytose de nanoparticules marquées par fluorescence directement dans des cellules vivantes. La méthode ne nécessite pas de manipulation des cellules et n’est pas limitée par rapport au gène ou à l’espèce cible.

L’objectif global de cette procédure est d’analyser l’expression des gènes intracellulaires directement dans les cellules vivantes via l’application de nanoparticules fluorescentes spécifiques aux gènes. Pour ce faire, il faut d’abord définir les séquences cibles appropriées dans le gène d’intérêt. La deuxième étape consiste à fabriquer des nanoparticules avec des brins de capture et de rapporteur spécifiques.

Ensuite, les nanoparticules sont ajoutées directement au milieu de culture de la cellule vivante. La dernière étape consiste à incuber les cellules avec les nanoparticules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour visualiser la fluorescence spécifique d’un gène dans les cellules cibles vivantes, tandis que l’analyse par cytométrie en flux est utilisée pour quantifier le nombre de cellules fluorescentes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunohistochimie, les balises moléculaires ou l’analyse PCR, est que l’expression des gènes peut être observée visuellement dans des cellules vivantes sans aucune manipulation de la culture cellulaire. Martina Teresa, biologiste et doctorante de notre laboratoire, Lynette Henkel, fera la démonstration de la procédure pour la cytométrie en flux. Après avoir déterminé les séquences cibles, commandez des nanoparticules d’or lyophilisées à partir de sources disponibles dans le commerce.

Ces particules sont composées d’une particule d’or centrale liée de manière covalente à un brin de capture, qui est lié à un brin rapporteur. Lorsque l’ARNm cible se lie au brin de capture, le brin rapporteur et son fluorophore lié sont libérés dans la solution, permettant au Fluor quatre d’émettre de la fluorescence. Avant la reconstitution.

Les nanoparticules doivent être stockées à quatre degrés Celsius dans l’obscurité dans une boîte en carton. Pour reconstituer les nanoparticules d’or, ajoutez 20 microlitres d’eau distillée doublement, ce qui donne une concentration finale de 100 nano molaires. Les nanoparticules reconstituées peuvent être conservées à température ambiante dans l’obscurité pendant au moins un an.

Le jour de l’application, diluez la solution mère de nanoparticules d’or en une solution de travail 20 x dans du PBS, retirez une plaque de 24 puits contenant 2 cellules HEK 2 93 de l’incubateur de culture cellulaire, aspirez le milieu, puis ajoutez 237,5 microlitres de milieu de culture frais, puis pipetez 12,5 microlitres de la solution de travail de nanoparticules dans chaque puits préparé et faites tourner la plaque pour assurer une distribution uniforme des nanoparticules. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Le lendemain.

Analysez les cultures cellulaires pour détecter la fluorescence du site trois spécifique au gène à l’aide d’un microscope fluorescent standard afin de préparer les cellules pour la cytométrie en flux. Lavez une fois les cellules HEK 2, 9 3 affichant la fluorescence induite par le côté trois avec du PBS et ajoutez un millilitre de 0,05 % de trypsine EDTA, incubez les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après l’incubation, ajoutez 0,5 millilitre de CO et pipetez de haut en bas.

Transférez ensuite les cellules dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez trois millilitres de milieu de culture et centrifugez le tube pendant cinq minutes à 300 fois G.Ensuite, retirez le sate et suspendez les cellules dans 200 microlitres de tampon de fax glacé. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre et stockez-les sur de la glace dans l’obscurité jusqu’à l’analyse.

Avant l’analyse par télécopie, faites passer les cellules à travers un filtre de 30 micromètres pour éviter l’agrégation de cellules. Ajoutez ensuite de l’iodure de propidium aux cellules à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre pendant au moins deux minutes, amenez les cellules au vortex du cytomètre en flux et chargez le tube d’échantillon sur l’appareil. Pour détecter trois cellules séropositives.

Utilisez des cellules de contrôle non traitées pour définir les portes hiérarchiques sur la diffusion directe ou la zone FSC par rapport à la diffusion latérale ou au sous-ensemble de zone SSC, la hauteur FSC par rapport à FSC avec sous-ensemble et la hauteur SSE par rapport à SSE avec sous-ensemble pour exclure les débris de cellule et les cellules non dispersées. Retirez les cellules mortes de l’analyse basée sur la coloration à l’iodure de propidium en affichant le canal PE contre le canal PE Texas Red, puis effectuez la porte de tri finale sur le site trois cellules positives PE. Détection de GA dh.

Un gène de ménage exprimé de manière constitutive a été réalisé dans des cellules HEK 2 93 pour valider la faisabilité expérimentale. Les nanoparticules de contrôle négatif brouillées montrent peu ou pas de fluorescence tout en étant fluorescentes en permanence. Les témoins montrent un signal fort après l’incubation pendant la nuit.

Il a été démontré que ces nanoparticules détectent spécifiquement les marqueurs de cellules souches pluripotentes, l’expression des gènes nano et GDF trois en miroir des cellules souches pluripotentes induites par l’homme et le porc ou IPC. Il est important de noter que ces marqueurs n’ont été détectés que dans les IPC et non dans les cellules de fibroblastes qui ont servi de couche nourricière lors de la culture cellulaire IPS. L’analyse visuelle et quantitative par cytométrie en flux a été utilisée pour évaluer l’efficacité du marquage des nanoparticules GA DH classées de zéro à 1000.

La molaire PICO a été réalisée avec des cellules HEK 2 93, qui ont montré une nette augmentation de la fluorescence en fonction de la concentration. Une analyse quantitative a ensuite été effectuée sur des cellules souches embryonnaires murines, qui ont montré environ 40 %CY trois cellules positives après l’édition de 400 nanoparticules PICOMOLAR GA DH. Des valeurs similaires ont été obtenues pour les marqueurs de pluripotence.

Nano et GDF trois Une fois maîtrisés. Cette technique peut être réalisée dans les 16 heures si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser des nanoparticules spécifiques à un gène pour détecter l’expression génique intracellulaire directement dans les cellules vivantes à l’aide de la microscopie à fluorescence.