2.3: Modification des organismes modèles grâce au génie génétique

Le génie génétique est un outil précieux utilisé pour modifier les génomes d’organismes modèles dans un processus connu sous le nom de transgenèse. En biologie du développement, cette approche est souvent utilisée pour exprimer des gènes modifiés qui peuvent être visualisés dans les tissus vivants. Alternativement, le génie génétique peut être utilisé pour prévenir ou perturber l’expression des protéines afin d’étudier la fonction développementale de gènes spécifiques.

Cette vidéo résumera les principes qui sous-tendent cette technologie, passera en revue certaines procédures de génie génétique et mettra en évidence les façons dont ces techniques sont utilisées en laboratoire.

Pour commencer, explorons quelques concepts importants sous-jacents à la transgénèse. Cela implique l’insertion d’ADN dans le génome d’un organisme modèle. Il existe un certain nombre d’approches en fonction de l’objectif de l’étude.

Premièrement, l’ajout d’un gène modifié peut révéler des changements fonctionnels ou morphologiques dus à une mutation. Une autre méthode consiste à mettre des copies supplémentaires du gène de type sauvage non modifié pour étudier les effets de la surexpression, qui peut souvent être tout aussi dommageable qu’une mutation. Une approche différente consiste à insérer une protéine de fusion qui contient une étiquette visualisable, telle que la protéine fluorescente verte, pour suivre l’emplacement et le moment de l’expression génique chez les animaux vivants.

Le segment d’ADN qui sera inséré dans le génome doit être soigneusement conçu pour produire les modèles d’expression et les résultats souhaités. Le promoteur, qui est un élément de séquence qui dicte quand et où un gène est exprimé, est un composant crucial. Certains promoteurs sont omniprésents dans presque tous les tissus, tandis que d’autres ne sont actifs que dans des tissus spécifiques. Les promoteurs inductibles, qui sont activés par l’administration de produits chimiques ou l’exposition à des températures élevées, peuvent également être utilisés pour contrôler le moment de l’expression des gènes.

Pour être exprimé de manière stable dans les tissus, un transgène doit d’abord s’intégrer dans le génome. Pour ce faire, les transgènes peuvent inclure des séquences d’ADN flanquantes qui correspondent à des zones du génome de l’organisme. Cela permet au transgène de s’intégrer à l’ADN de l’hôte par un processus connu sous le nom de recombinaison homologue. Alternativement, chez certaines espèces, des éléments spéciaux appelés transposons peuvent rendre la transgenèse plus efficace en incluant des sites de reconnaissance pour l’enzyme transposase, qui catalyse l’insertion aléatoire du transgène dans le génome.

Maintenant que vous connaissez certaines des bases de la conception de transgènes, voyons comment fabriquer un animal transgénique. Pour construire le transgène, commencez par amplifier le gène d’intérêt à l’aide de la PCR. Cette région amplifiée est ensuite clonée en un vecteur, qui est un morceau d’ADN qui peut transporter le transgène dans les cellules. Les vecteurs contiennent généralement des éléments qui permettent une amplification efficace des transgènes à l’aide de bactéries, telles que E. coli. Après cette étape d’amplification, le vecteur est purifié à partir de la culture bactérienne.

Les animaux transgéniques sont fabriqués en injectant de l’ADN purifié dans des embryons. Chez les poissons et les grenouilles, les constructions sont généralement injectées directement dans le jaune ou le cytoplasme des embryons au stade unicellulaire. Pour la transgenèse médiée par transposon, un transcrit codant pour l’enzyme transposase est ajouté au mélange d’injection.

Chez la souris, la transgenèse peut être accomplie en manipulant des ovules nouvellement fécondés dans lesquels les pronoyaux des spermatozoïdes et des ovules n’ont pas encore fusionné. La construction est injectée directement dans le pronoyau plus grand, où elle peut s’intégrer dans le génome à mesure que la cellule se divise. Les ovules doivent ensuite être transplantés dans l’utérus d’une femelle pseudo-enceinte pour le développement.

L’efficacité de la transgenèse varie, de sorte que les animaux doivent être examinés pour identifier la descendance dans laquelle la construction s’est intégrée avec succès dans le génome. Cela peut se faire en recherchant une étiquette fluorescente qui a été insérée pour une identification facile, ou par des analyses moléculaires telles que la PCR de l’ADN génomique isolé à partir de petits morceaux de tissu.

Une deuxième approche du génie génétique se concentre sur le ciblage de gènes spécifiques pour perturber la fonction des gènes. Il existe plusieurs approches pour atteindre cet objectif. Une méthode relativement nouvelle, connue sous le nom d’édition du génome, tire parti d’enzymes spécifiques à une séquence appelées nucléases, qui coupent le squelette de l’ADN et provoquent des mutations dans les gènes lors de la réparation de l’ADN.

Une autre méthode de ciblage implique l’utilisation d’une recombinaison homologue pour remplacer un gène par de l’ADN étranger ou une copie du gène flanquée de séquences de reconnaissance pour des enzymes appelées recombinases. Lorsque les recombinases sont présentes, la séquence flanquée sera excisée du génome. C’est ce qu’on appelle un knock-out conditionnel, et le contrôle de l’excision génique peut être réalisé en exprimant l’enzyme dans des tissus spécifiques ou à certains moments.

Passons en revue une procédure générale de génération de souris knock-out par recombinaison homologue. Ici, une construction doit être préparée dans laquelle une partie de la séquence d’ADN génomique est remplacée par de l’ADN étranger. Cet ADN code souvent pour un autre gène, par exemple pour la résistance aux antibiotiques, ce qui permet de sélectionner avec succès des cellules modifiées dans des étapes ultérieures.

Pour commencer la procédure, des cellules souches embryonnaires sont prélevées dans la masse cellulaire interne d’un embryon de souris précoce connu sous le nom de blastocyste. La construction linéarisée est ensuite délivrée dans les cellules souches par électroporation, dans laquelle des impulsions électriques génèrent des pores transitoires dans la membrane cellulaire. Les cellules sont ensuite laissées incuber en présence d’un antibiotique pour éliminer les cellules sans le transgène.

Après cette étape de sélection, les cellules souches peuvent être injectées dans un autre embryon de souris au stade de blastocyste. Les embryons sont ensuite transférés dans l’utérus d’une souris femelle pour poursuivre le développement. Les chiots qui en résulteront seront des chimères, qui sont composées à la fois de cellules de type sauvage et de cellules knock-out. Certaines chimères auront des cellules knock-out dans leur lignée germinale, qui transmettront le gène perturbé lorsqu’elles seront élevées, ce qui établira ensuite une nouvelle lignée knock-out.

Vous avez appris les bases du génie génétique des modèles de développement, alors voyons maintenant quelques applications pratiques.

Les études sur le développement utilisent souvent des protéines marquées par fluorescence pour identifier les cellules et étudier leur développement. À l’aide de promoteurs spécifiques aux tissus, les organismes transgéniques peuvent être modifiés pour exprimer des protéines fluorescentes dans des cellules spécifiques, comme la crête neurale. À l’aide de techniques d’imagerie avancées, les cellules fluorescentes peuvent être imagées en temps réel, ce qui permet aux chercheurs de visualiser directement des événements de développement complexes.

Une autre utilisation importante du génie génétique est l’étude de gènes spécifiques et de leur rôle dans les phénotypes des maladies. Ici, des mutations ciblées sont introduites dans un gène spécifique de souris à l’aide de nucléases, telles que les TALEN. La PCR montre si la souris a zéro, une ou deux copies du gène muté. Les embryons porteurs de deux copies mutantes peuvent maintenant être étudiés en détail pour déterminer la fonction développementale du gène.

À l’aide d’inknockouts conditionnels, les scientifiques peuvent déterminer la fonction d’un gène au sein d’un ensemble restreint de cellules. Ici, un gène flanqué de loxP a été exprimé dans tout l’embryon, mais Cre n’a été exprimé que dans les cellules endothéliales, provoquant une délétion du gène dans le cœur et les vaisseaux sanguins. Cet inactivation tissulaire spécifique a entraîné un changement mesurable de la fréquence cardiaque embryonnaire et illustre comment tester le rôle localisé d’un gène sans modifier l’ensemble de l’organisme.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la technologie transgénique. Ces techniques vous aident à comprendre les bases du génie génétique, certaines des méthodes impliquées et comment il est appliqué dans la science de tous les jours. Le génie génétique peut être largement appliqué à de nombreux organismes et continuera d’être un outil important pour étudier et comprendre le rôle de la génétique dans les maladies du développement, ainsi que celles qui apparaissent à l’âge adulte. Merci d’avoir regardé !