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Developmental Biology

Modification des organismes modèles grâce au génie génétique

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Developmental Biology

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JoVE Science Education Developmental Biology

Genetic Engineering of Model Organisms

2.2: Gene Silencing with Morpholinos

2.4: An Introduction to Molecular Developmental Biology

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09:36 min

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April 30, 2023

Overview

Transgenèse, ou l’utilisation du génie génétique pour modifier l’expression des gènes, est largement utilisée dans le domaine de la biologie du développement. Les scientifiques utilisent plusieurs approches pour modifier la fonction des gènes pour comprendre leurs rôles dans le processus de développement. Cela comprend le remplacement d’un gène, une copie ne fonctionne pas, ou en ajoutant une balise de visualizable à un gène qui permet à la protéine de fusion qui en résulte être suivis tout au long du développement.

Dans cette vidéo, les téléspectateurs apprendront sur les principes qui sous-tendent la transgénèse, ainsi que les étapes de base pour l’introduction des constructions génétiques à un animal et ciblage de gènes d’intérêt. Elle est suivie de la discussion d’un protocole à créer des souris knock-out. Enfin, certaines applications spécifiques des technologies transgéniques dans le domaine de la biologie du développement seront examinées.

Procedure

Le génie génétique est un outil précieux permettant de modifier les génomes d’organismes modèles dans un processus appelé transgénèse. En biologie du développement, cette approche est souvent utilisée pour exprimer les gènes modifiés qui peuvent être visualisées dans les tissus vivants. Par ailleurs, le génie génétique peut être utilisé pour empêcher ou perturber l’expression de la protéine pour étudier la fonction du développement de gènes spécifiques.

Cette vidéo va résumer les principes derrière cette technologie, revoir certaines procédures de génie génétique et les moyens de mettre en évidence que ces techniques sont utilisées dans le laboratoire.

Pour commencer, nous allons explorer certains concepts importants qui sous-tendent la transgénèse. Il s’agit d’insertion d’ADN dans le génome d’un organisme modèle. Il y a un certain nombre d’approches en fonction de l’objectif de l’étude.

Tout d’abord, ajout d’un gène altéré pourrait révéler des modifications fonctionnelles ou morphologiques en raison d’une mutation. Une autre méthode consiste à mettre en des copies supplémentaires du gène sauvage intact pour étudier les effets de la surexpression, qui peut souvent être tout aussi dommageable qu’une mutation. Une autre approche consiste à insérer une protéine de fusion qui contient une balise visualizable, tels que la protéine fluorescente verte, pour suivre l’emplacement et le minutage de l’expression génique dans les animaux vivants.

Le segment d’ADN qui sera inséré dans le génome doit être soigneusement conçu pour produire les modèles d’expression souhaité et les résultats. Le promoteur, qui est un élément de la séquence qui détermine quand et où un gène s’exprime, est une composante essentielle. Certains promoteurs sont partout exprimées tout au long de presque tous les tissus, tandis que d’autres ne sont plus actifs dans des tissus spécifiques. Promoteurs inductibles, qui sont activés par administration chimique ou l’exposition à des températures élevées, peuvent également servir pour contrôler le minutage de l’expression génique.

Pour être stablement exprimée dans les tissus, un transgène doit d’abord s’intégrer dans le génome. Pour ce faire, transgènes peut inclure des séquences d’ADN qui correspondent à des zones du génome de l’organisme d’accompagnement. Cela permet le transgène pour s’intégrer à l’hôte, l’ADN, par un processus appelé recombinaison homologue. Par ailleurs, chez certaines espèces des éléments spéciaux appelés transposons peuvent rendre transgénèse plus efficace en incluant les sites de reconnaissance pour la transposase enzyme, qui catalyse l’insertion aléatoire du transgène dans le génome.

Maintenant que vous savez de quelques-unes des bases du transgène design, passons en revue comment faire un animal transgénique. Pour rendre le transgène construire, commencer en amplifiant le gène d’intérêt à l’aide de la PCR. Cette région amplifiée est ensuite clonée dans un vecteur, qui est un morceau d’ADN qui peut transporter le transgène dans les cellules. Vecteurs contiennent généralement des éléments qui permettent l’amplification transgène efficace à l’aide de bactéries, comme e. coli. Après cette étape d’amplification, le vecteur est purifié à partir de la culture bactérienne.

Animaux transgéniques sont réalisés en injectant de l’ADN purifié dans des embryons. Dans les poissons et les grenouilles, les constructions sont généralement injectées directement dans le jaune d’oeuf ou le cytoplasme des embryons au stade unicellulaire. Pour la transgénèse induite par le transposon, une transcription codant l’enzyme transposase est ajoutée au mélange injection.

Chez la souris, la transgénèse peut être accompli par la manipulation des oeufs nouvellement fécondés dans lequel les spermatozoïdes et ovules pronucléus n’ont pas encore fusionné. La construction est injectée directement dans le pronucléus plus grande, où elle peut s’intégrer dans le génome que la cellule se divise. Les oeufs doivent ensuite être transplantés dans l’utérus d’une femelle pseudo-gravides pour le développement.

Efficacité de la transgenèse varie, donc les animaux doit subir un dépistage pour identifier les descendants dont la construction a réussi à intégrer dans le génome. Cela peut être fait en recherchant une balise fluorescente qui a été insérée pour une identification facile, ou au moyen d’analyses moléculaires tels que PCR de l’ADN génomique isolé de morceaux de tissus petit.

Une deuxième approche au génie génétique se concentre sur le ciblage de gènes spécifiques visant à désorganiser la fonction du gène. Il y a plusieurs approches pour atteindre cet objectif. Une méthode relativement nouvelle, appelée génome édition, tire parti des enzymes de séquences spécifiques appelées nucléases, qui recoupent l’épine dorsale de l’ADN et causent des mutations dans les gènes que l’ADN est réparé.

Une autre méthode de ciblage implique l’utilisation de la recombinaison homologue pour remplacer un gène soit ADN étranger ou une copie du gène flanqué par des séquences de reconnaissance pour les enzymes appelées les recombinases. Lorsque les recombinases sont présents, la séquence flanquée va être excisée du génome. Ceci est connu comme un masquage conditionnel, et contrôle de l’excision de gène peut être obtenu en exprimant l’enzyme dans des tissus spécifiques ou à certains moments.

Passons en revue une procédure générale pour la génération de souris knock-out par recombinaison homologue. Ici, une construction doit être préparée dans quelle partie de l’ADN génomique séquence est remplacé par ADN étranger. Cet ADN code souvent un autre gène, telles que la résistance aux antibiotique, qui fournit un moyen de sélectionner correctement modifié des cellules dans les étapes ultérieures.

Pour commencer la procédure, les cellules souches embryonnaires proviennent de la masse cellulaire interne d’un jeune embryon de souris appelée blastocyste. La construction linéarisée est transportée dans les cellules souches par électroporation, dans lequel les impulsions électriques génèrent transitoire de pores dans la membrane cellulaire. Les cellules sont alors autorisés à incuber en présence d’un antibiotique pour éliminer les cellules sans le transgène.

Après cette étape de sélection, les cellules souches peuvent être injectés dans un autre embryon de souris au stade de blastocyste. Les embryons sont ensuite transférés dans l’utérus d’une souris femelle pour poursuivre le développement. Les chiots qui en résulte sera chimères, qui sont composées de cellules de type sauvage et knock-out. Quelques chimères auront cellules knockout dans leur lignée germinale, qui transmet le gène perturbé lorsqu’ils sont élevés, qui établira alors une nouvelle ligne de knock-out.

Vous avez appris les bases du génie génétique des modèles de développement, alors maintenant nous allons regardent quelques applications pratiques.

Études sur le développement utilisent souvent des protéines fluorescent étiquetées pour identifier les cellules et d’étudier leur développement. À l’aide de tissu-spécifiques promoteurs, organismes transgéniques peuvent être conçues pour exprimer fluorescents protéines dans des cellules spécifiques, comme la crête neurale. Utilisant des techniques d’imagerie avancées, les cellules fluorescentes peuvent être photographiées en temps réel, permettant ainsi aux chercheurs de visualiser directement les événements développementaux complexes.

Une autre utilisation importante du génie génétique est à l’étude des gènes spécifiques et leur rôle dans les phénotypes de la maladie. Ici, les mutations ciblées sont introduites dans un gène de souris spécifiques à l’aide de nucléases, tels que les TALENs. PCR indique si la souris a zéro, une ou deux copies du gène muté. Les embryons porteurs de deux exemplaires mutants peuvent maintenant être étudiés en détail pour déterminer la fonction du développement du gène.

À l’aide de masquages conditionnels, les scientifiques peuvent déterminer la fonction d’un gène au sein d’un ensemble restreint de cellules. Ici, un gène loxP funèbre a été exprimé tout au long de l’embryon entier, mais Cre a été exprimé dans les cellules endothéliales, entraînant une délétion du gène dans le cœur et les vaisseaux sanguins. Ce tissu-spécifique a entraîné un changement mesurable dans la fréquence cardiaque embryonnaire et illustre comment tester le rôle localisé d’un gène sans changer tout l’organisme.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la technologie transgénique. Ces techniques permettent de comprendre les bases du génie génétique, certaines des méthodes qui sont impliqués, et comment elle est appliquée en sciences de la vie quotidienne. Le génie génétique peut être largement appliqué à travers de nombreux organismes et continuera d’être un outil important pour l’étude et la compréhension du rôle de la génétique dans les maladies du développement, ainsi que celles qui apparaissent à l’âge adulte. Merci de regarder !

Transcript

Genetic engineering is a valuable tool used to modify genomes of model organisms in a process known as transgenesis. In developmental biology, this approach is often used to express modified genes that can be visualized in living tissues. Alternatively, genetic engineering can be used to prevent or disrupt protein expression to study the developmental function of specific genes.

This video will summarize the principles behind this technology, review some genetic engineering procedures, and highlight ways that these techniques are used in the lab.

To begin, let’s explore some important concepts underlying transgenesis. This involves insertion of DNA into the genome of a model organism. There are a number of approaches depending on the study goal.

First, addition of an altered gene might reveal functional or morphological changes due to a mutation. Another method is to put in additional copies of the unaltered wild-type gene to study the effects of overexpression, which can often be just as damaging as a mutation. A different approach is to insert a fusion protein that contains a visualizable tag, such as green fluorescent protein, to track the location and timing of gene expression in live animals.

The segment of DNA that will be inserted into the genome must be carefully designed to produce the desired expression patterns and outcomes. The promoter, which is a sequence element that dictates when and where a gene is expressed, is a crucial component. Certain promoters are ubiquitously expressed throughout almost all tissues, while others are only active in specific tissues. Inducible promoters, which are activated by chemical administration or exposure to high temperatures, can also be used to control timing of gene expression.

To be stably expressed in tissues, a transgene must first integrate into the genome. To accomplish this, transgenes can include flanking DNA sequences that match areas of the organism’s genome. This allows the transgene to integrate with the host DNA through a process known as homologous recombination. Alternatively, in some species special elements called transposons can make transgenesis more efficient by including recognition sites for the enzyme transposase, which catalyzes random insertion of the transgene into the genome.

Now that you know some of the basics of transgene design, let’s review how to make a transgenic animal. To make the transgene construct, start by amplifying the gene of interest using PCR. This amplified region is then cloned into a vector, which is a piece of DNA that can carry the transgene into cells. Vectors typically contain elements that allow efficient transgene amplification using bacteria, such as E. coli. After this amplification step, the vector is purified from the bacterial culture.

Transgenic animals are made by injecting purified DNA into embryos. In fish and frogs, constructs are usually injected directly into the yolk or cytoplasm of one-cell stage embryos. For transposon-mediated transgenesis, a transcript encoding the transposase enzyme is added to the injection mix.

In mice, transgenesis can be accomplished by manipulation of newly fertilized eggs in which the sperm and egg pronuclei have not yet fused. The construct is injected directly into the larger pronucleus, where it may integrate into the genome as the cell divides. The eggs must then be transplanted into the uterus of a pseudopregnant female for development.

Transgenesis efficiency varies, so animals must be screened to identify progeny in which the construct has successfully integrated into the genome. This can be done by looking for a fluorescent tag that was inserted for easy identification, or through molecular analyses such as PCR of genomic DNA isolated from small tissue pieces.

A second approach to genetic engineering focuses on specific gene targeting to disrupt gene function. There are multiple approaches to achieve this goal. One relatively new method, known as genome editing, takes advantage of sequence-specific enzymes called nucleases, which cut the DNA backbone and cause mutations in genes as the DNA is repaired.

Another targeting method involves the use of homologous recombination to replace a gene with either foreign DNA or a copy of the gene flanked by recognition sequences for enzymes known as recombinases. When the recombinases are present, the flanked sequence will be excised from the genome. This is known as a conditional knockout, and control of gene excision can be achieved by expressing the enzyme in specific tissues or at certain time points.

Let’s review a general procedure for generating knockout mice by homologous recombination. Here, a construct must be prepared in which part of the genomic DNA sequence is replaced with foreign DNA. This DNA often encodes another gene, such as for antibiotic resistance, which provides a way to select successfully modified cells in later steps.

To begin the procedure, embryonic stem cells are collected from the inner cell mass of an early mouse embryo known as a blastocyst. The linearized construct is then delivered into the stem cells via electroporation, in which electrical pulses generate transient pores in the cell membrane. The cells are then allowed to incubate in the presence of an antibiotic to eliminate cells without the transgene.

After this selection step, the stem cells can be injected into another mouse embryo at the blastocyst stage. The embryos are then transferred to the uterus of a female mouse to continue development. The resulting pups will be chimeras, which are composed of both wild-type and knockout cells. Some chimeras will have knockout cells within their germline, which will transmit the disrupted gene when they are bred, which will then establish a new knockout line.

You have learned the basics of genetic engineering of developmental models, so now let’s look at some practical applications.

Developmental studies often use fluorescently tagged proteins to identify cells and study their development. Using tissue-specific promoters, transgenic organisms can be engineered to express fluorescent proteins in specific cells, like the neural crest. Using advanced imaging techniques, the fluorescent cells can be imaged in real time, allowing researchers to directly visualize complex developmental events.

Another important use of genetic engineering is to study specific genes and their role in disease phenotypes. Here, targeted mutations are introduced into a specific mouse gene using nucleases, such as TALENs. PCR shows whether the mouse has zero, one, or two copies of the gene mutated. The embryos carrying two mutant copies can now be studied in detail to determine the developmental function of the gene.

Using conditional knockouts, scientists can determine the function of a gene within a restricted set of cells. Here, a loxP-flanked gene was expressed throughout the entire embryo, but Cre was expressed in endothelial cells only, causing a gene deletion in the heart and blood vessels. This tissue-specific knockout resulted in a measureable change in embryonic heart rate, and illustrates how to test the localized role of a gene without changing the entire organism.

You’ve just watched JoVE’s introduction to transgenic technology. These techniques help you understand the basics of genetic engineering, some of the methods that are involved, and how it is applied in everyday science. Genetic engineering can be widely applied across many organisms, and will continue to be an important tool for studying and understanding the role of genetics in developmental diseases, as well as those that appear during adulthood. Thanks for watching!

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