Épithéliale repeuplement cellulaire et préparation des rongeurs matrice extracellulaire échafaudages pour le développement de tissu rénal

L’objectif global de cette procédure est de repeupler les échafaudages de matrice extracellulaire tridimensionnelle de rongeurs acellulaires avec des cellules épithéliales rénales humaines. Ceci est accompli en décellularisant d’abord un rein de rat avec une série de solutions détergentes perfusées à travers l’artère rénale sur une période de 26 heures. Le rein est ensuite stérilisé et les échafaudages de la matrice extracellulaire rénale acellulaire sont injectés avec 40 millions de cellules épithéliales tubulaires corticales rénales humaines ou RCTE sous perfusion artérielle antegrade continue au sein d’un système de réacteur Biore conçu sur mesure.

En fin de compte, la capacité des cellules RCTE à repeupler l’échafaudage rénal peut être évaluée par des tests ER et de perfusion et une analyse immunohistochimique. Cette technique de culture cellulaire 3D permet aux chercheurs de repeupler la matrice extracellulaire d’un organe entier. Les cellules d’échafaudage sont déposées dans l’espace péritubulaire de la matrice extracellulaire pour permettre l’investigation et la liaison des facteurs qui influencent la croissance, la différenciation et la maturation cellulaires.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que la fabrication d’échafaudages en polymère synthétique est que la matrice extracellulaire rénale facilite l’adhésion, la prolifération et la maturation des cellules perfusées au sein d’un réseau complexe de protéines structurelles naturelles, de facteurs de croissance et d’autres composants biologiques. Commencez la procédure de décellularisation en connectant le cathéter de l’artère rénale de chaque rein décongelé à l’extrémité de la tubulure du circuit de perfusion en aval de la pompe, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit piégée dans le cathéter. Si des bulles d’air sont présentes dans le cathéter, utilisez une micro-pipette de 200 microlitres pour extraire les bulles et remplissez le cathéter de liquide.

Suspendez le rein le long de la paroi interne d’un bécher vide de cinq litres afin que l’artère rénale ne se plie pas ou ne s’enroule pas, et ajustez l’entraînement de la pompe à cinq millilitres par minute. Appuyez ensuite sur Démarrer après avoir confirmé que chaque rein est perfusant en observant l’écoulement des solutions du bas de l’organe plus chaque rein avec les solutions appropriées comme désigné dans l’organigramme à la fin de la perfusion, stockez les reins décellularisés dans PBS dans un tube conique de 50 millilitres à quatre degrés Celsius ou un maximum de deux. Après avoir assemblé le circuit de perfusion, nous retirons le capuchon à vis rouge sur la tête du bioréacteur et pipetions 50 millilitres d’une solution d’acide acétique à 0,1 % et 4 % d’éthanol dans le réservoir de milieu par l’ouverture.

À l’aide d’une grande cartouche de pompe, connectez le segment de tube de la pompe péristaltique à la tête de pompe. Ajustez ensuite le débit à cinq millilitres par minute. Appuyez sur start et laissez le circuit s’amorcer lorsque le liquide remplit la conduite de profusion et atteint l’orifice ouvert restant du robinet d’arrêt à trois voies.

Utilisez un bouchon de leurre mâle pour boucher le port. Laissez le circuit s’amorcer complètement jusqu’à ce qu’aucun air ne soit observé dans la tubulure du circuit de perfusion ou à l’intérieur de l’entrée. L’accepteur de leurre expulse les bulles du circuit de perfusion en augmentant temporairement le débit de la pompe.

Lorsque le système est complètement amorcé, arrêtez l’entraînement de la pompe et vous stérilisez les pinces de six pouces. Pour brancher soigneusement l’extrémité du leurre femelle du cathéter de l’artère rénale dans l’entrée mâle, placez l’accepteur de leurre sur la surface interne de la tête du bioréacteur, en vous assurant que la connexion est bien serrée et qu’il ne reste pas d’air dans le cathéter. Laissez le rein pendre doucement du cathéter de l’artère rénale afin que l’artère rénale ne se torde pas ou ne se plie pas.

Serrez ensuite la pince métallique qui maintient la tête et le corps du bioréacteur ensemble de manière à ce que le réservoir du bioréacteur soit hermétiquement scellé et fermez le bouchon à vis. Maintenant, stérilisez les reins avec une perfusion à température ambiante de la solution d’éthanol d’acide acétique à cinq millilitres par minute. Au bout d’une heure, arrêtez la pompe et ouvrez le bouchon à vis rouge.

À l’aide d’un parasite stérile, votre pipette aspire soigneusement toute la solution du réservoir du bioréacteur. Ensuite, pipetez 50 millilitres de PBS frais dans le réservoir du bioréacteur. Fermez le bouchon à vis et démarrez la pompe pour trois perfusions séquentielles d’une heure à température ambiante à cinq millilitres par minute.

Après le rinçage final du PBS, aspirez la solution saline du réservoir et ajoutez 50 millilitres de fluide dans le réservoir avec un bouchon à vis fermé. Transférez le bioréacteur avec le circuit de perfusion attaché dans un incubateur de grande capacité à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Connectez ensuite le circuit de perfusion du bioréacteur à la pompe et perfuser les reins à raison de quatre millilitres par minute pendant au moins une heure avant l’ensemencement.

Pour cellulariser, les reins recueillent un nombre suffisant de flacons de culture pour la concentration souhaitée. Ensuite, après avoir aspiré le milieu de culture de chaque flacon, utilisez 10 millilitres de l’enzyme de dissociation cellulaire appropriée pour soulever les cellules épithéliales tubulaires corticales rénales du ballon à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes, commencez à vérifier les flacons sur un microscope à contraste facial toutes les deux minutes jusqu’à ce que le décollement du pli soit observé.

Ensuite, après avoir prélevé une petite aliquote de cellules pour le comptage, diluez la suspension cellulaire associée dans un volume égal de milieu prémédical et centrifugez les cellules en suscinq. Suspendez la pastille avec un volume approprié de milieu de culture pour obtenir une concentration finale de deux fois 10 à la septième cellules par millilitre. Transférez deux millilitres de la suspension du siège, une boîte de culture de 35 millimètres, puis aspirez le volume de deux millilitres dans une seringue stérile de cinq millilitres.

Transférez le bioréacteur à perfusion dans une enceinte de sécurité biologique et tournez la vanne du robinet d’arrêt pour fermer le débit vers l’orifice d’assise. Retirez la glissière du leurre mâle, branchez-la du robinet d’arrêt et connectez la seringue. Ensuite, transférez rapidement le circuit de perfusion dans l’incubateur et utilisez la grande cartouche de pompe pour fixer le segment du tube de la pompe péristaltique à la tête de pompe pour asseoir les cellules.

Fermez l’orifice de la vanne du robinet d’arrêt pointant vers la pompe et injectez lentement les cellules dans l’échafaudage rénal. Tournez ensuite le robinet d’arrêt pour fermer le débit de la seringue et démarrez la pompe à 25 millilitres par minute. Après 15 minutes, réduisez le débit de la pompe à quatre millilitres par minute, en remplaçant le fluide le lendemain et tous les deux jours par la suite.

Pour évaluer la viabilité et la prolifération des cellules, remplacez aseptiquement le milieu de culture par 10 millilitres de solution de travail au zarin par une perfusion de quatre millilitres par minute des échafaudages rénaux après exactement une heure, prélevez la solution de zarin conditionnée et partiellement réduite et effectuez une autre perfusion de quatre millilitres par minute. Avec 100 millilitres de culture fraîche, les reins moyens profusés séquentiellement avec de l’eau et des solutions détergentes diluées sont devenus progressivement plus transparents sur une période de 26 heures par la perfusion finale du détergent, le réseau vasculaire des reins et en particulier, les vaisseaux interlobaires sont mis en évidence dans l’échafaudage décellularisé. L’organe entier est débarrassé des cellules natives, laissant derrière lui le réseau intact de membranes basales des tubules glomérules et des canaux collecteurs, ainsi que la matrice extracellulaire des vaisseaux sanguins décellularisés.

En plus des vaisseaux plus gros, les membranes basales microvasculaires à l’intérieur des glomérules conservent également leur intégrité structurelle. Les cellules RCTE enracinées dans l’échafaudage rénal, comme nous venons de le démontrer, se dirigent principalement vers les régions corticales de l’échafaudage rénal où elles repeuplent préférentiellement les tubules glomérulaires de Pereg. Peu de cellules s’incrustent dans les glomérules le premier jour après l’ensemencement, et le septième jour, les glomérules sont pratiquement dépourvus de cellules tandis que la majorité de ces cellules occupent les régions corticales de la matrice extracellulaire rénale.

Après sept jours de culture de perfusion antérograde, de nombreux tubules de la lignée RCTE sont présents dans les tubules médullaires et papillaires externes et les canards collecteurs après le repeuplement cellulaire de l’ECR et une semaine de culture de perfusion. Cependant, la transparence observée après la décellularisation est perdue et le rein isé apparaît opaque et plus proche en apparence de son état natif. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse immunochimique de milieux de culture conditionnés peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que : comment les états métaboliques ou phénotypiques de ces cellules changent-ils dans la matrice extracellulaire rénale ?

La capacité de développer des échafaudages extracellulaires et d’ajouter les ventes de donneurs à la matrice permet aux chercheurs de délimiter la croissance et la maturation en trois dimensions dans des échafaudages naturels d’exomatrice rénale. Le but ultime est d’utiliser cette technologie comme un outil pour mieux comprendre les mécanismes de réparation et de régénération rénales.