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Developmental Biology

Une introduction à la biologie moléculaire du développement

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Developmental Biology

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JoVE Science Education Developmental Biology

An Introduction to Molecular Developmental Biology

2.3: Genetic Engineering of Model Organisms

2.5: Explant Culture for Developmental Studies

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

Signaux moléculaires jouent un rôle majeur dans les processus complexes qui se produisent durant le développement embryonnaire. Ces signaux de réglemente les activités telles que la différenciation cellulaire et de la migration, qui contribuent à la formation des types spécifiques de cellules et des structures. L’utilisation de méthodes moléculaires permet aux chercheurs d’étudier ces mécanismes physiques et chimiques en détail.

Cette vidéo passera en revue un bref historique de l’étude des événements moléculaires au cours du développement. Ensuite, principales questions posées par les biologistes moléculaires du développement aujourd’hui seront examinées, suivie d’une discussion de plusieurs méthodes de premier plan permettant de répondre à ces questions, telles que la coloration, l’explantation de la culture et l’imagerie de cellules vivantes. Enfin, nous examinerons certaines applications actuelles de ces techniques à l’étude de la biologie du développement.

Procedure

Études dans le domaine de la biologie moléculaire du développement renseignent sur les changements qui se produisent au niveau cellulaire au cours de la différenciation et le développement. Les chercheurs examinent les mécanismes physiques et chimiques qui régulent les fonctions cellulaires. Cela aide à comprendre comment les cellules donnent naissance à des tissus spécialisés au sein de l’embryon en voie de maturation, et comment défauts au niveau moléculaire peuvent conduire à des états pathologiques.

Cette vidéo présente une brève histoire de la biologie moléculaire du développement, présente les questions clées posées par les scientifiques dans ce domaine, décrit certains outils disponibles pour répondre à ces questions et discute de quelques applications courantes de laboratoire.

Commençons par examiner certaines études de point de repère dans l’histoire de recherche de biologie moléculaire du développement.

En 1957, Conrad Waddington a publié un livre intitulé « La stratégie de the Genes », dans lequel il a essayé d’expliquer comment établit-on la sort de la cellule. Selon les études de transplantation de tissus précédemment menée, il a présenté un modèle conceptuel qui décrivait qu’une cellule est comme une bille de roulement bas d’une colline, et le chemin qu’il faut pour atteindre le fond permettra de déterminer l’état final différenciée. Cette idée que les types cellulaires distincts proviennent de cellules indifférenciées recevant des signaux différents au cours du développement est devenu connue comme le « paysage épigénétique ».

Vers la même époque, Rita Levi-Montalcini et Stanley Cohen a fait observer que transplanter des tumeurs dans les embryons de poulets a conduit à la croissance rapide de neurone. Ils ont émis l’hypothèse qu’une substance sécrétée par les tumeurs causés cette croissance et identifié la protéine comme facteur de croissance nerveuse ou NGF. Peu de temps après, Cohen a découvert un autre facteur de croissance qui est sécrété par les glandes salivaires de souris et favorisé la croissance des cellules épithéliales. Il a identifié cette protéine comme facteur de croissance épidermique, ou EGF.

Plus tard, en 1969, Lewis Wolpert proposa une théorie sur comment une certaine classe de molécules, appelées morphogènes, agissent directement sur les cellules à induire des réponses spécifiques à des concentrations variables de signalisation. Il a utilisé des couleurs du drapeau Français aux États de cellule modèle, rouges servant de l’État par défaut quand aucun signal n’est présent. A partir de là, des concentrations faibles autocatalytiques, montrées en blanc, pourraient activer un gène, tandis que des concentrations de haute autocatalytiques, représentées en bleu, pourraient activer un gène différent.

Poursuivant sur ce travail, en 1988 Christiane Nusslein-Volhard identifié le premier autocatalytiques connus en effectuant des écrans génétiques sur des mouches. Elle a utilisé des anticorps pour montrer qu’une protéine, appelée Bicoid, forme un gradient de concentration le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon en développement et contrôle l’expression de gènes importants pour l’Organisation des régions de la tête et le thorax.

Pendant le début des années 1990, Peter Lawrence et Ginés Morata utilisé leur propre travail chez les mouches pour développer la théorie des gradients autocatalytiques. Ils ont émis l’hypothèse qu’un ensemble de cellules est chargé d’organiser un compartiment en particulier de l’organisme. Comme développement produit, les signaux moléculaires charger ces cellules de diviser et de construire plusieurs compartiments, continuant jusqu’à ce que l’ensemble de l’organisme est formé.

Maintenant que nous avons passé en revue quelques faits historiques marquants, examinons quelques questions fondamentales posées par les biologistes du développement actuels.

Pour commencer, certains chercheurs se concentrent sur l’identification des molécules qui régulent le développement. Par exemple, ils pourraient étudier individu, ou des combinaisons de, facteurs de croissance provoque une réponse cellulaire spécifique, tels que la différenciation ou de la migration.

Autres biologistes du développement étudient comment ces molécules réglementent le processus de développement. Ils pourraient étudier comment la concentration d’un signal moléculaire peut demander une cellule pour différencier ou migrer. Ils également poser des questions sur la façon dont les cellules communiquent avec d’autres cellules voisines et regardent les molécules qui se diffusent sur une courte distance et agissent au niveau local, appelés facteurs paracrines de signalisation.

Enfin, certains biologistes du développement veulent comprendre comment les cellules réagissent aux signaux externes. Ils peuvent étudier les changements à l’intérieur de la cellule elle-même, tels que les augmentations ou diminutions dans l’expression de certains gènes, en regardant les niveaux de leurs protéines codées. D’autres portent sur des changements externes, tels que des altérations dans la forme des cellules ou la taille.

Maintenant que vous avez une sensation de questions clés posées par les biologistes moléculaires du développement, nous allons étudier certaines des techniques qu’ils utilisent pour trouver des réponses à ces questions.

La coloration est une des approches plus couramment utilisés pour étudier les profils d’expression génique et pour identifier les molécules qui régulent le développement.

Immunohistochemistry est une technique de coloration qui utilise des anticorps conjugués à des journalistes chimiques ou fluorescentes, aux protéines de l’étiquette. Visualisation de protéines par microscopie de fluorescence offre un aperçu de leur localisation dans des sections de tissu, ainsi que leur contribution potentielle aux structures cellulaires. Ensemble de montage in situ hybridation est une alternative coloration méthode qui utilise des oligonucléotides ADN ou d’ARN marqués à regarder les profils d’expression génique dans les tissus en trois dimensions.

Culture de l’explant est une autre approche couramment utilisée dans ce domaine à l’étude des mécanismes par lequel agissent les stimuli externes. Dans cette technique, un tissu est retiré du site naturel de croissance et en culture. Conditions de croissance spécifiques, tels que le substrat sur les plaques de culture ou des facteurs de croissance pour les milieux de culture, a ajouté peuvent alors être examinées pour leurs effets sur le développement des cellules et des tissus.

Vivre l’imagerie cellulaire est utilisée pour analyser les réponses cellulaires aux stimuli du développement. In vitro de cultures sont bien adaptés pour capturer les déplacements de la cellule et la localisation en temps réel. Coloré ou fluorescent étiquetés cellules peuvent également être suivis en vivo Time-lapse par microscopie.

Fréquemment, les cellules d’un tissu d’intérêt sont transplantés provenant d’un donneur à un organisme hôte et ensuite surveillés au cours du développement.

Maintenant que vous êtes familiarisé avec certaines méthodes de laboratoire général, regardons quelques applications de la biologie moléculaire du développement recherche.

Une approche pour déterminer les produits des gènes spécifiques rôle jouent dans le développement consiste à modifier leur expression par des moyens externes. Dans cette expérience, des oligonucléotides antisens appelés morpholinos ont été injectés à coup de masse deux zebrafish gènes importants pour le développement de la bonne oreille interne. Immunostaining des protéines structurales ont montré que les embryons avec l’expression du gène réduit présentent moins de neurones et de cellules ciliées dans l’oreille interne par rapport aux contrôles.

Une autre application de la biologie moléculaire du développement est de comprendre quand et où les gènes sont exprimés, de mieux comprendre comment les protéines codées peuvent fonctionner. Chercheurs dans cette expérience utilisé fluorescent étiquetés sondes d’ARN complémentaires aux deux transcriptions de cible afin d’identifier les cellules transcrire un ou les deux gènes d’intérêt.

Certains scientifiques permet d’analyser les réponses des cellules dans des conditions différentes des cultures d’explants. Dans cette expérience, les enquêteurs disséqué les neurones sensoriels de l’oreille interne d’embryons de poulets et eux cultivées pendant plusieurs heures. Ensuite, les cultures sont passés aux médias contenant des billes de protéine. Time-lapse images confocales après incubation avec l’anticorps étiquetés a révélé que les protéines sur les perles promu la croissance de projections de corps cellulaires de neurones.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la biologie moléculaire du développement. Dans cette vidéo, nous avons examiné l’historique des recherches de biologie moléculaire du développement et a présenté les principales questions posées par les biologistes du développement. Aussi, nous avons exploré les stratégies de recherche de premier plan et discuté de certaines de leurs applications actuelles. Comme toujours, Merci pour regarder !

Transcript

Studies in the field of molecular developmental biology provide insight about the changes that occur at the cellular level during differentiation and development. Researchers examine the physical and chemical mechanisms that regulate cell functions. This helps in understanding how cells give rise to specialized tissues within the maturing embryo, and how defects at the molecular level can lead to disease states.

This video presents a brief history of molecular developmental biology, introduces key questions asked by scientists in this field, describes some tools available to answer those questions, and discusses a few current lab applications.

Let’s start by reviewing some landmark studies in the history of molecular developmental biology research.

In 1957, Conrad Waddington published a book entitled “The Strategy of the Genes” in which he tried to explain how cell fate is decided. Based on previously conducted tissue transplantation studies, he presented a conceptual model describing that a cell is like a marble rolling down a hill, and the path it takes to reach the bottom will determine its final differentiated state. This idea that distinct cell types arise from undifferentiated cells receiving different signals during development became known as the “epigenetic landscape.”

Around the same time, Rita Levi-Montalcini and Stanley Cohen observed that transplanting tumors into chick embryos led to rapid neuron growth. They hypothesized that a substance secreted by the tumors caused this growth, and identified the protein as nerve growth factor, or NGF. Soon after that, Cohen discovered another growth factor that was secreted by mouse salivary gland and promoted the growth of epithelial cells. He identified this protein as epidermal growth factor, or EGF.

Later, in 1969, Lewis Wolpert proposed a theory about how a certain class of signaling molecules, known as morphogens, act directly on cells to induce specific responses at varying concentrations. He used colors of the French flag to model cell states, red serving as the default state when no signal is present. From there, low morphogen concentrations, shown in white, might activate one gene, while high morphogen concentrations, shown in blue, might activate a different gene.

Expanding on this work, in 1988 Christiane Nusslein-Volhard identified the first known morphogen by conducting genetic screens on flies. She used antibodies to show that a protein, known as Bicoid, forms a concentration gradient along the anterior-posterior axis of the developing embryo, and controls the expression of genes important for organizing the head and thorax regions.

During the early 1990s, Peter Lawrence and Ginés Morata used their own work in flies to expand the theory of morphogen gradients. They hypothesized that one set of cells is responsible for organizing one particular compartment of the organism. As development proceeds, molecular signals instruct those cells to divide and construct more compartments, continuing until the whole organism is formed.

Now that we have reviewed some historical highlights, let’s examine a few fundamental questions asked by current developmental biologists.

To begin, some researchers focus on identifying the molecules that regulate development. For example, they might study individual, or combinations of, growth factors shown to cause a specific cell response, such as differentiation or migration.

Other developmental biologists investigate how these molecules regulate the developmental process. They might study how the concentration of a molecular signal can instruct a cell to differentiate or migrate. They also ask about how cells communicate with other nearby cells, and look at signaling molecules which diffuse over a short distance and act locally, known as paracrine factors.

Finally, some developmental biologists want to understand about how cells respond to external signals. They may study changes inside the cell itself, such as increases or decreases in the expression of particular genes, by looking at levels of their encoded proteins. Others focus on external changes, such as alterations in cell shape or size.

Now that you have a feel for key questions asked by molecular developmental biologists, let’s look at some of the techniques they use to find answers to these questions.

Staining is one of the most widely used approaches to investigate gene expression patterns, and to identify the molecules that regulate development.

Immunohistochemistry is a staining technique that uses antibodies conjugated to chemical or fluorescent reporters to label proteins. Visualization of proteins by fluorescence microscopy offers insights about their localization in tissue sections, and also their potential contributions to cellular structures. Whole-mount in situ hybridization is an alternative staining method, which uses labeled DNA or RNA oligonucleotides to look at patterns of gene expression in three-dimensional tissues.

Explant culture is another commonly used approach in this field to study the mechanisms by which external stimuli act. In this technique, a tissue is removed from the natural site of growth and grown in culture. Specific growth conditions, such as the substrate on the culture plates or growth factors added to the culture media, can then be examined for their effects on developing cells and tissues.

Live cell imaging is used to analyze cell responses to developmental stimuli. In vitro cultures are well-suited for capturing cell movements and localization patterns in real time. Stained or fluorescently labeled cells can also be tracked in vivo using time-lapse microscopy.

Frequently, cells from a tissue of interest are transplanted from a donor to a host organism, and then monitored over the course of development.

Now that you’re familiar with some general laboratory methods, let’s look at some applications of molecular developmental biology research.

One approach to determining the role specific gene products play in development is to alter their expression by external means. In this experiment, antisense oligonucleotides called morpholinos were injected to knockdown two zebrafish genes important for proper inner ear development. Immunostaining of structural proteins showed that embryos with reduced gene expression exhibit fewer neurons and hair cells within the inner ear compared to the controls.

Another application of molecular developmental biology is to figure out when and where genes are expressed, to better understand how their encoded proteins may function. Researchers in this experiment used fluorescently labeled RNA probes complementary to two target transcripts in order to identify cells transcribing one or both genes of interest.

Some scientists use explant cultures to analyze cell responses under various conditions. In this experiment, investigators dissected sensory neurons from the inner ear of chick embryos and cultured them for several hours. Next, cultures were switched to media containing protein beads. Time-lapse confocal images following incubation with labeled antibodies revealed that proteins on the beads promoted the growth of projections from neuron cell bodies.

You’ve just watched JoVE’s introduction to molecular developmental biology. In this video, we have reviewed the history of molecular developmental biology research, and introduced key questions asked by developmental biologists. We also explored prominent research strategies, and discussed some of their current applications. As always, thanks for watching!

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