Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

L’objectif global de cette procédure est de générer des cultures de peau organotypiques génétiquement modifiées à l’aide d’un derme humain revitalisé afin de déterminer l’impact de l’expression génique modifiée sur la croissance et la différenciation de l’épiderme. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la dermatologie, telles que la détermination des gènes responsables de la croissance, de la différenciation et de la progression de l’épidémiologie. Le principal avantage de cette technique est qu’une peau humaine génétiquement modifiée est générée en quelques jours, ce qui permet d’étudier des échantillons humains potentiellement pertinents sur le plan clinique.

La démonstration de la procédure sera faite par mon laboratoire. Si vous recevez de la peau humaine congelée, placez le tissu dans le capuchon de culture tissulaire pendant trois à cinq minutes pour le décongeler. Une fois décongelé, transférez le tissu dans un tube conique stérile de 50 millilitres ou une bouteille de 125 millilitres, selon la taille.

Ensuite, ajoutez quatre fois de la pénicilline et de la streptomycine dans un XPBS jusqu’à ce que le récipient soit rempli à 75 %. Fermez le récipient et secouez vigoureusement pendant cinq minutes. Retirez la solution antibiotique et répétez l’opération.

Pas trois fois de plus après le dernier lavage, transférez le mouchoir dans un nouveau récipient et ajoutez une solution antibiotique fraîche. Incuber ce mélange dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant deux semaines pour permettre la séparation du derme de l’épiderme. Lorsque deux semaines se sont écoulées, utilisez des pinces pour retirer l’épiderme du derme.

Jetez l’épiderme conformément au protocole de l’établissement pour le traitement des tissus humains. Placez le derme dans un récipient de solution antibiotique et lavez-le en secouant vigoureusement comme précédemment. Après le dernier lavage, transférez le derme dans un nouveau récipient de solution antibiotique et stockez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé la veille de la transfection des cellules de phénix dans un milieu complet dans une plaque à six puits à une densité de 800 000 cellules par puits.

Le jour de la transfection, mélangez six microlitres de réactif de transfection avec 100 microlitres de dmm. Pour chaque puits à transfecter et à incuber à température ambiante Pendant cinq minutes, ajoutez le mélange dans un tube contenant trois microgrammes de vecteur rétroviral pour chaque puits à transfecter et incubez à température ambiante pendant 30 minutes, ajoutez tout ce mélange goutte à goutte à chaque puits des cellules du phénix et incubez les cellules pendant la nuit le lendemain de la transfection. Retirez le média des cellules du phénix et ajoutez deux millilitres de milieu complet frais le même jour.

Réinstallez les kératinocytes humains primaires dans un milieu exempt de sérum de kératinocytes avec des antibiotiques et ensemencez-les dans six plaques paroises à une densité de 75 000 cellules par puits. Le lendemain, récoltez le milieu qui contient maintenant des particules virales provenant des cellules Phoenix transfectées. Faites passer le média à travers un filtre de 0,45 micron à l’aide d’une seringue pour éliminer toutes les cellules contaminantes.

Ajoutez cinq microgrammes par millilitre de bromure d’hexadiméthyle au milieu filtré contenant le virus pour aider à médier le processus d’infection. Ensuite, pipetez deux millilitres du virus sur les kératinocytes plaqués la veille. Ensuite, faites tourner les six plaques parois dans une centrifugeuse à 200 G pendant une heure à température ambiante.

Après l’essorage, retirez et jetez le support contenant le virus. Lavez les cellules une fois avec un XPBS, puis ajoutez du K-C-S-F-M frais le lendemain. Infectez le même lot de kératinocytes avec le virus en utilisant la procédure qui vient d’être montrée.

Pour fabriquer des cassettes organotypiques. Utilisez une cautérisation pour retirer un carré d’un centimètre sur un centimètre du centre du couvercle d’une boîte de culture tissulaire de 3,5 centimètres. Fixez des chevilles carrées au bas de la cassette à l’aide de vernis à ongles transparent et laissez le vernis sécher pendant cinq minutes.

Enfin, retournez la cassette et placez-la dans un plat de six centimètres avec une cassette reposant sur les chevilles. Récupérez le derme du stockage à quatre degrés Celsius et transférez-le dans un récipient de croissance de kératinocytes. Moyen à laver.

Après avoir répété le lavage, placez le derme dans du KGM frais et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux jours. Après l’incubation, utilisez un scalpel pour couper le derme en morceaux de 1,5 centimètre sur 1,5 centimètre. Ensuite, placez-le sur le trou carré de l’organotypique est fixé avec le haut du derme vers le haut.

À l’aide d’une pince, retournez toute la cassette organotypique contenant le derme. Ajoutez cinq gouttes de matrice extracellulaire fraîchement levée au bas du derme et secouez légèrement pour assurer une répartition uniforme sur le derme. Après avoir laissé la matrice extracellulaire se solidifier pendant cinq minutes, utilisez une pince pour retourner la cassette, puis ajoutez quatre millilitres de KGM dans la boîte de six centimètres.

Ensuite, après la récolte et le comptage des kératinocytes génétiquement modifiés, Resus met en suspension 0,5 à 1 million de cellules dans 90 microlitres de KGM et distribue les cellules sur le derme. Incuber la co-culture à 37 degrés Celsius. Changez de média sur les cultures tous les deux jours.

La stratification et la différenciation complètes de l’épiderme se produisent généralement après le cinquième jour. Les tissus peuvent être récoltés jusqu’à 14 jours après le placage. Cette image montre la coloration à l’hématine et à l’éosine de l’organotypique.

Les cultures de peau régénérées de la peau humaine contiennent à la fois l’épiderme et le derme. L’épiderme est entièrement stratifié et différencié en quatre couches distinctes, dont la couche basale indifférenciée et les trois couches différenciées, dont la strate, le spinosum, le ranum et le cornium. Ces images d’immunofluorescence démontrent que la surexpression de SNA i deux, comme indiqué à droite, inhibe la différenciation épidermique par rapport au tissu témoin montré à gauche, marquant la différenciation.

La kératine protéique 1 ou K 1 est indiquée en vert et les noyaux sont marqués en bleu. L’analyse RTQ PCR R pour mesurer les niveaux d’ARNm de SNAI deux chez le témoin LAC Z et S NNA I deux tissu surexprimant démontre une expression supérieure à 50 fois de SNAI deux par rapport au contrôle. Enfin, cette analyse RTQ PCR R démontre que la surexpression de SNA I deux entraîne une perte d’expression des gènes structurels induits par la différenciation tels que TGM un et SPRR un A. Suite à cette procédure.

D’autres méthodes telles que la chipsy, l’immunofluorescence, l’RN, l’ae ou le western blot peuvent être effectuées afin de déterminer les mécanismes de croissance et de différenciation de la péridurale. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la dermatologie pour explorer comment la fonction des gènes altérés affecte l’homéostasie de la peau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des cultures de peau humaine organique génétiquement modifiée en utilisant des kératinocytes et du derme humain.