Circumscribed capsulaire Infarctus Modélisation en utilisant une technique photothrombotique
2 juin 2016
Ce manuscrit décrit une technique de modélisation des capsulaire Infarctus. Ici, nous avons utilisé une technique photothrombotique modifiée avec une faible intensité de la lumière après la cartographie cible pré-opératoire. En utilisant cette technique, nous avons créé un modèle d'infarctus capsulaire circonscrites avec déficience motrice persistante.
L’objectif global de cette technique est de créer un modèle d’infarctus capsulaire circonscrit avec une déficience motrice persistante à l’aide de la technique photothrombotique. Avant de créer l’infarctus capsulaire, il est nécessaire d’identifier la zone du membre antérieur dans la capsule interne en introduisant un virus adéno-associé exprimant la GFP dans la zone du membre antérieur du cortex moteur. Commencez par placer un rat anesthésié dans un cadre stéréotaxique.
Ensuite, rasez la tête du rat et stérilisez le cuir chevelu avec de l’alcool à 70 % et une solution de povidone et d’iode. Injectez du chlorhydrate de lidocaïne à 2 % sous le cuir chevelu dans la zone de l’incision du cuir chevelu prévue pour réduire la douleur peropératoire. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement des yeux.
Et placez un drap stérile sur l’animal. Après avoir pratiqué une incision médiane de deux centimètres dans le cuir chevelu, positionnez le bras stéréotaxique pour identifier la zone des membres antérieurs du cortex moteur en fonction des coordonnées stéréotaxiques. Percez un trou d’entrée à cet endroit.
Déplacez l’aiguille dans le trou percé et abaissez l’aiguille d’un millimètre à travers la dure-mère et dans le cortex moteur. Utilisez une micro-pompe de haute précision pour injecter lentement un micro litre de virus. Laissez l’aiguille en place pendant 10 minutes supplémentaires pour éviter le reflux dans le tractus de l’aiguille.
Une fois que 10 minutes se sont écoulées, retirez lentement l’aiguille. Après avoir nettoyé le site opératoire avec une irrigation saline, fixez la plaie avec une suture en nylon 3-0. Relâchez ensuite le rat du cadre stéréotaxique et transférez-le dans une chambre de récupération pour surveillance.
Administrer un analgésique pour le contrôle de la douleur postopératoire. Après deux à trois semaines, sacrifiez le rat selon les méthodes approuvées et sectionnez le cerveau cryoprotégé. Après la coloration de la GFP, observez les axones transduits par l’AAV-GFP dans la capsule interne à l’aide d’un microscope fluorescent.
Comparez l’emplacement des axones transduits tels qu’ils sont vus sur l’image fluorescente avec l’atlas du cerveau de rat pour déterminer avec précision les coordonnées stéréotaxiques des axones transduits. Pour préparer l’interface neuronale optique, utilisez d’abord une perceuse pour couper environ quatre centimètres d’une aiguille vertébrale de calibre 27 avec un stylet à l’intérieur. Dénudez ensuite 10 centimètres de la gaine d’une fibre optique.
Insérez la partie non gainée de la fibre optique dans un tube métallique. Et fixez le tube autour de la fibre. Ensuite, à l’aide d’un presse-agrumes, fixez deux fois la partie inférieure du tube métallique.
Le tube métallique remplit l’espace entre la fibre optique et le moyeu de l’aiguille vertébrale. Appliquez de l’époxy thermodurcissable sur la fibre optique. Appliquez de l’époxy supplémentaire sur l’espace vide du moyeu.
Et insérez la fibre optique dans l’aiguille de la colonne vertébrale. Durcissez l’époxy pendant 20 minutes à 100 degrés Celsius pour une fixation stable. Une fois durci, crevez la fibre optique qui dépasse de l’aiguille vertébrale, puis utilisez des feuilles de rodage en diamant pour polir la fibre optique à l’extrémité de l’aiguille vertébrale.
Enfin, connectez la partie connecteur FCPC du cordon de raccordement au coupleur du système laser vert. Ensuite, utilisez un wattmètre optique numérique et un compteur d’énergie pour mesurer l’intensité lumineuse à partir de l’extrémité de la fibre optique afin d’assurer une émission précise de la lumière. Placez un coussin chauffant sous le corps de l’animal pour maintenir la température corporelle à 37,5 degrés Celsius lors de la chirurgie.
Commencez par anesthésier et préparer le rat pour la chirurgie comme précédemment. Après avoir pratiqué une incision médiane de deux centimètres, ajustez la hauteur de la pince nasale jusqu’à ce que le Bregma et le Lambda soient alignés au même niveau. L’alignement correct est essentiel pour cibler correctement la capsule interne.
Positionnez le bras stéréotaxique pour localiser le site de la photothrombose. Percez ensuite un trou de deux millimètres à cet endroit. Ensuite, polissez et nettoyez l’extrémité de la fibre optique de l’ONI, puis fixez-la au cadre stéréotaxique sans la plier.
Vérifiez l’extrémité de l’ONI pour vous assurer qu’elle est propre et intacte. Mesurez l’intensité du laser à partir de l’extrémité de la fibre optique avant l’insertion de l’interface optique sur le site cible du cerveau du rat. Ajustez l’intensité du laser à 3,5 milliwatts à l’extrémité de la fibre optique.
Maintenant, abaissez l’ONI dans la zone cible de la capsule interne en utilisant la coordonnée dorso-ventrale déterminée dans la première section du protocole. Ensuite, injectez deux milligrammes par kilogramme de Rose Bengal à travers la veine de la queue, puis lancez un compte à rebours réglé sur une minute. Une fois la minute écoulée, allumez le laser vert de 532 nanomètres pendant 90 secondes pour créer l’infarctus.
Après une radiothérapie, retirez doucement l’ONI du cerveau. Après avoir nettoyé le site opératoire, fixez la plaie avec une suture en nylon 3-0. Retirez ensuite le rat du cadre stéréotaxique et transférez-le dans une chambre de récupération.
Cette image montre l’étendue des lésions d’infarctus à différentes intensités de lumière laser de deux milliwatts à cinq milliwatts deux semaines après la lésion photothrombotique. Les flèches indiquent la lésion de l’infarctus. L’intensité de la lumière optique est considérée comme comprise entre trois milliwatts et quatre milliwatts dans ce cadre expérimental.
Les deux images suivantes montrent l’aspect microscopique de l’infarctus capsulaire trois semaines après la photothrombose. Dans cette section coronale du cerveau du rat, les pointes de flèches indiquent le faisceau de l’aiguille contenant la fibre optique dans le thalamus et jusqu’à la capsule interne. Ces coupes colorées en série montrent l’étendue de la lésion de l’infarctus dans la capsule interne.
Les flèches indiquent la lésion de l’infarctus.
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Aperçu
Ce manuscrit décrit une technique de modélisation de l'infarctus capsulaire utilisant une technique photothrombotique modifiée. Cette approche permet la création d'un modèle d'infarctus capsulaire circonscrit qui entraîne une altération motrice persistante.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Neurobiologie
- Altération motrice
Contexte
- Les infarctus capsulaires sont associés à des déficits moteurs.
- Les techniques photothrombotiques sont utilisées pour induire des lésions cérébrales localisées.
- La compréhension des mécanismes de l'altération motrice est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques.
- La cartographie des cibles est essentielle pour la création précise du modèle.
Objectif de l'étude
- Développer un modèle fiable d'infarctus capsulaire.
- Investiguer les effets des infarctus capsulaires sur la fonction motrice.
- Utiliser une technique photothrombotique modifiée pour un ciblage précis.
Méthodes utilisées
- Identification de la zone des membres antérieurs dans la capsule interne à l'aide d'un virus adénovirus associé exprimant GFP.
- Préparation du rat par anesthésie et placement dans un cadre stéréotaxique.
- Stérilisation du cuir chevelu et préparation de l'incision.
- Injection de lidocaïne pour minimiser la douleur intraopératoire.
Résultats principaux
- Création réussie d'un modèle d'infarctus capsulaire circonscrit.
- Démonstration d'une altération motrice persistante après l'infarctus.
- Validation de la technique photothrombotique modifiée.
- Établissement d'une méthode reproductible pour les études futures.
Conclusions
- La technique photothrombotique modifiée est efficace pour modéliser les infarctus capsulaires.
- Ce modèle peut être utilisé pour étudier les altérations motrices et les interventions potentielles.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour explorer les mécanismes sous-jacents des déficits moteurs.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
