Name: Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez l'utilisation de cellules endothéliales comme modèle plan de présentation d'antigènes pour étudier la dynamique de la synapse immunologique. Cette méthode permet une imagerie haute résolution des processus de signalisation antigénique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr Peter T. Sage pour son aide dans la génération de certaines des images représentatives. Ce travail a été soutenu par une subvention NIH R01 à C.V.C. (HL104006).

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+receptors+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion receptors of the immune system.</a> Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).</li>
<li>Shaw, A. S., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+T+cell+receptor+go+the+distance%3A+a+topological+view+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation.</a> Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li>
<li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+context+of+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).</li>
<li>Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartinelli%2C+R+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).</li>
<li>Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte-endothelial cell interactions.</a> Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+the+endothelium%3A+a+green+light+for+antigen-specific+T+cell+trafficking%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory%2Feffector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+foci+facilitate+activation+of+the+phospholipase+C-gama+in+primary+T+lymphocytes+via+the+WASP+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway .</a> eLife. , (2015).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+complex+class+II-expressing+endothelial+cells+induce+allospecific+nonresponsiveness+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells.</a> J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).</li>
<li>Ma, W., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+effectively+costimulate+cytokine+production+by%2C+but+not+differentiation+of%2C+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells.</a> J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).</li>
<li>Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+antigen+presentation%3A+stimulation+of+previously+activated+but+not+naive+TCR-transgenic+mouse+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells.</a> Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).</li>
<li>Epperson, D. E., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+human+endothelial+cells.+Direct+activation+of+resting+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells.</a> J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).</li>
<li>Shiao, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+memory+CD4%2B+T+cells+directly+recognize+allogeneic+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-signal+model+for+T+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-signal model for T cell trafficking.</a> Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+diapedesis+is+initiated+by+invasive+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes.</a> Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).</li>
<li>Carman, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+transcellular+diapedesis%3A+probing+and+pathfinding+by+%27invadosome-like+protrusions%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'.</a> J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell immunological synapses.</a> Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).</li>
<li>Saito, T., Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+synapse+and+microclusters%3A+the+site+for+recognition+and+activation+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells.</a> Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).</li>
<li>Gomez, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+functions+as+an+essential+actin-regulatory+adaptor+protein+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse.</a> Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).</li>
<li>Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+signaling+to+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor signaling to integrins.</a> Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).</li>
<li>Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+during+leukocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton during leukocyte responses.</a> Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).</li>
<li>Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+deformation+model+of+TCR+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">The receptor deformation model of TCR triggering.</a> Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).</li>
<li>Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-anchored+monomeric+agonist+pMHCs+alone+trigger+TCR+with+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity.</a> PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).</li>
<li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+receptor+activation+by+dynamic+membrane+binding+of+the+CD3epsilon+cytoplasmic+tyrosine-based+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif.</a> Cell. 135 (4), 702-713 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans l&#39;ensemble, ce protocole décrit des méthodes pour étudier les cellules endothéliales que i) APC physiologiques peu étudiés et ii) comme un type de «modèle plane APC cellulaire» de roman. En ce qui concerne le premier, il est devenu de plus en plus apprécié que les APC périphérique non-hématopoïétiques (ou «stromales &#39;) jouent des rôles critiques, non redondants (ie, par rapport à hématopoïétique APC) dans l&#39;élaboration de réponses immunitaires adaptatives 16-18. Parmi ces «semi-profe...

Les lymphocytes T sont une branche du système immunitaire adaptatif caractérisé par la capacité de reconnaître efficacement antigène peptidique (Ag) lié à complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) à travers leurs récepteurs de lymphocytes T (TCR) 1. Lymphocytes naïfs migrent constitutivement et Scan &#39;Ag cellules présentatrices professionnels »(CPA; par exemple, les cellules dendritiques) dans les ganglions lymphatiques, tandis que les cellules mémoire / T effecteurs doivent pouvoir surveiller efficacement une gamme extrêmement large d&#39;APC et les cellules cibles potentielles dans les tissus périphériques. Dans le min après la comptabilisation initiale de l&#39;apparenté Ag sur une APC, les lymphocytes arrêter leur migration et de commencer à former intime une interface spécialisée cellule-cellule appelée &quot;synapse immunologique&quot; (IS). Soutenue (c.-à 30-60 min) EST contacts sont nécessaires pour amplifier et soutenir signalisation 2-7. Nouvelles études identifient que dans le SI, il est la formation continue et r rapideemodeling de signalisation sous-cellulaire des micro-amas discrets (par exemple, contenant du CMH / Ag-TCR, la F-actine, l&#39;adhérence et des molécules de signalisation) qui déterminent la résistance et la qualité de la réponse immunitaire résultante 2-7. Cependant, les détails dynamiques et mécanisme de régulation de ce processus sont encore mal compris 8,9. Cette situation découle en grande partie des défis techniques liés aux topologies de surfaces irrégulières APC et l&#39;orientation mal contrôlée des plans d&#39;interaction cellule-cellule, les problèmes qui limitent profondément l&#39;imagerie spatio-temporelle requise approches 8-10 (Figure1A). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> Figure 1. Un physiologique Planar cellulaire APC Modèle pour l&#39;imagerie immunologique Synapse Dynamics. Le schéma illustre l&#39;imagerie traditionnelle de la synapse immunologique entre un lymphocyte T et un professio<html> APC nal (A) et des cellules T et un modèle traditionnel plane lipidique bicouche APC (B) par rapport à ce nouveau modèle plane APC endotheliales (C). APC professionnelles fournissent des synapses immunologiques physiologiques, mais offrent l&#39;interface mal orienté cellule-cellule (par exemple, par rapport au plan optimal de formation d&#39;image xy, la résolution ~ 0,2 pm), ce qui compromet considérablement spatial (z imagerie avion résolution ~ 1 um) et temporelle (par exemple, en raison de la nécessité de numériser plusieurs reprises à travers tous les plans z d&#39;imagerie) résolution de l&#39;imagerie. Modèles bicouches ont une topologie planaire qui fournit une résolution spatio-temporelle optimale d&#39;imagerie, mais sont également très simplifiées, non physiologique et rigide. Ce modèle associe des cellules endotheliales de la topologie du plan de bicouches lipidiques avec le substrat physiologique d&#39;un APC classique pour fournir la résolution de l&#39;imagerie spatiale et temporelle optimale dans un contexte physiologique.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Des travaux antérieurs ont partiellement contourné ces obstacles en élaborant des modèles de substrat plan (c.-à-bicouches lipidiques et des surfaces revêtues d&#39;anticorps) qui fournissent la résolution spatio-temporelle optimale (ie, par l&#39;intermédiaire de la fixation de la surface de l&#39;activation des cellules T dans un plan unique qui est parallèle à l&#39;imagerie xy optimale plan) 11 à 15 (figure 1B). Ces modèles ont facilité des informations importantes sur la dynamique sous-cellulaires / moléculaires qui contrôlent la signalisation antigénique des lymphocytes T, y compris la découverte d&#39;actine dynamique / TCR de signalisation micro-clusters 7,11-14. Toutefois, ces modèles sont intrinsèquement trop simplifiées, ainsi que rigide (excluant le développement / étude des caractéristiques topologiques 3 dimensions) (figure 1B). Par conséquent, il reste incertain comment relier ces résultats à PHYcellule-cellule siologic de la surveillance immunitaire. Bien que toujours sous-étudié, vasculaire et les cellules endothéliales lymphatiques apparaissent comme un grand (ie, plus nombreux que tous les APC professionnelles, par ~ 1000 fois) compartiment périphérique de «semi-professionnel» APC 16-18. Ces cellules expriment MHC-I, MHC-II et une multitude de molécules co-stimulatrices (par exemple, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1; mais pas CD80 et CD86) et sont stratégiquement positionné à l&#39;interface sang-tissus où ils remplissent des fonctions sentinelles spécialisées 16-18. Des études antérieures ont démontré que les cellules endothéliales peuvent effectivement re-stimuler effecteur / mémoire, mais pas naïfs, les cellules T 19-25. Ainsi, les cellules endotheliales sont susceptibles de jouer un rôle unique APC en phase effectrice de la réponse immunitaire adaptative dans les tissus périphériques, tels que l&#39;influence locale sur activation des lymphocytes T, la différenciation, de la mémoire et de la tolérance 16,17,26. Critiquement, lorsqu&#39;elles sont cultivées in vitro, les cellules endotheliales forment des surfaces planes pratiquement cellulaires et sont facilement transfectables (par exemple, avec les reporters de protéines fluorescentes). Ces caractéristiques sont idéales pour la résolution spatio-temporelle de haute imagerie de la dynamique topologiques au cours des interactions cellule-cellule 19,27. Ainsi, les cellules endothéliales pourraient servir de «cellulaire plane APC« modèle physiologique distinctement adapté pour l&#39;étude des mécanismes de remodelage sous-cellulaires / moléculaires qui conduisent reconnaissance de l&#39;antigène et régulent les réponses (figure 1C) 19,20. Auparavant établi des techniques d&#39;imagerie complémentaires (y compris la transfection de cellules endotheliales avec une machine de protéines fluorescentes de la membrane plasmique et cytosol) pour étudier les détails de l&#39;interaction des leucocytes-endothélial au cours de l&#39;adhérence et de la migration transendotheliale 27, ont montré que les leucocytes sonde active la surface de l&#39;endothélium par dynamique l&#39;insertion d&#39;und rétraction de sous-échelle du micron, protubérances cylindriques actine riche (~ 200-1,000 nm de diamètre et de profondeur) appelé invadosome-comme des saillies (ie, &quot;PAI&quot;) 27,28. Ces approches d&#39;imagerie ont été encore élargi avec la création de protocoles de profiter de la fonction endothéliale APC pour développer les premières méthodes de résolution spatio-temporelle de l&#39;imagerie haute cellule T-endothélial synapse immunologique comme rapporté 19,20 et décrire plus en détail ici. Une conclusion centrale dérivé de ce roman plane cellulaire modèle APC est que PAI de cellules T fonctionnent à la fois dans la promotion de la détection initiale Ag et dans le maintien de la signalisation subséquente. En effet, les tableaux de multiples PAI (qui ont été stabilisés et comptabilisée en réponse à parapher le flux de calcium) montrent un enrichissement en molécules TCR et suggestives de la signalisation actif tel PKC-Q, ZAP-70, phosphotyrosine et HS1. Par conséquent, PAI semblent représenter une tridimensionnel équivalent physiologique de la micro-TCR de signalisationgrappes observés dans les modèles à deux couches planes. Cette approche, donc, révèle sensible / rapports dynamique moléculaire et architecturaux (et implicites biomécanique) pas autrement détectable. La méthode décrite ici devrait être utile à combler le fossé entre les APC professionnelle et modèles artificiels de substrat APC afin d&#39;améliorer notre capacité d&#39;interroger les mécanismes de base de réponses immunitaires adaptatives. Alors que l&#39;accent est mis ici sur l&#39;activation de CD4 + de type Th1 effecteur / cellule de mémoire, cette approche de base peut être facilement modifié pour étudier un large éventail de types et de Ags de cellules T, comme on le verra ci-dessous.

<table><tbody><tr><td>Garrot sans latex extensible BD</td><td>Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD Tampons imbibés d’alcool</td><td>BD Biosciences 326895</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Kit de prélèvement de sang à bouton-poussoir</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Amener à RT avant utilisation</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td> inactivée par la chaleur <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>entérotoxine staphylococcique B</td><td>Toxine Technologie</td><td>BT202RED</td><td>Solution mère 1mg/ml dans la</td></tr><tr><td>toxine 1 du syndrome de choc toxique</td> PBS <td>Technologie</td><td>TT606RED</td><td>solution mère 1mg/ml dans PBS</td></tr><tr><td>IL-15 humain</td><td>R& D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Solution mère 50ug/ml dans PBS</td></tr><tr><td>PBS Life</td><td>Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Solution mère 1mg/ml dans H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>D’autres EC microvasculaires humains peuvent être utilisés, c’est-à-dire HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Solution mère 10x, diluée dans PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Kit requis pour l’étape 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Solution mère 1mg/ml dans H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug,</td><td>human Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Solution mère 1mg/ml dans H20</td></tr><tr><td>sans rouge de phénol HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Solution mère 1M dans H20</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de magnésium Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Solution mère 1M dans H20</td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F huile d’immersion sans fluorescence</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Solution mère 1mM dans DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomère (Soluble Cytoplasmic DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde 37 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Toxique, utilisation de la hotte</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Falcon 15mL Tubes coniques à centrifuger</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Tubes coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Flacons traités pour culture tissulaire Falcon T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Flacons traités pour la culture tissulaire Falcon T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Corning Cell Culture Treated T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-lamelles en verre&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&nbsp ;</td><td>Diamètre 12 mm</td></tr><tr><td>&nbsp ; Falcon Plaques de culture tissulaire 24 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Plaques Delta-T</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur jetables</td><td>Wheaton Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tube Eppendorf&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Souris ICAM1 anti-humaine</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>souris HS1 anti-humaine</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD11a (LFA-1alpha)</td><td>Purified ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 Alexa Fluor&reg ; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHC Classe II anticorps&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-talin 1</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps thêta anti-PKC&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>phosphotyrosine (4G10 Platinum)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Électroporateur requis pour l’étape 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Zeiss Axiovison</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Série 60) Armoire de sécurité biologique</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Forma STRCYCLE 37 &deg ; C, 5 % CO2 Culture cellulaire</td><td>Incubateur Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; Z359629</td><td>Hémocytomètre Bright-Line</td></tr><tr><td>Isotemp Waterbath modèle 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

une cellule endothéliale planar modèle for imaging dynamics synapse immunologique

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

L&#39;immunité adaptative est régulée par des interactions dynamiques entre les cellules T et les cellules présentatrices d&#39;antigènes (&quot;APC&quot;) appelés «synapses immunologiques». Au sein de ces interfaces cellule-cellule intimes grappes de sous-cellulaire discrètes de CMH / Ag-TCR, la F-actine, l&#39;adhérence et des molécules de signalisation forment et remodeler rapidement. Ces dynamiques sont pensés pour être des facteurs déterminants de l&#39;efficacité et la qualité des réponses immunitaires qui développent et donc de protection contre l&#39;immunité pathologique. La compréhension actuelle des synapses immunologiques avec physiologique APC est limitée par l&#39;insuffisance de la résolution obtenue d&#39;imagerie. Bien que les modèles de substrat artificiel (par exemple, des bicouches lipidiques planes) offrent une excellente résolution et ont été des outils extrêmement précieux, ils sont intrinsèquement non-physiologique et simpliste. Les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques ont émergé comme un tissu périphérique importante (ou stroma) compartiment de &#39;semi-professional APC ». Ces APC (qui expriment la plupart de la machinerie moléculaire des APC professionnelle) ont la particularité de former surface cellulaire pratiquement plane et sont facilement transfectable (par exemple, avec les journalistes de protéines fluorescentes). Ici une approche de base pour mettre en œuvre les cellules endothéliales comme un roman et physiologique »plane modèle APC cellulaire» pour l&#39;amélioration de l&#39;imagerie et de l&#39;interrogatoire des processus fondamentaux de signalisation antigéniques sera décrit.

Une nouvelle approche de formation d&#39;image en utilisant des cellules endotheliales et en combinant les avantages de résolution du plan modèle de bicouches lipidiques avec la complexité physiologique et la déformabilité des APC professionnelle a été développé (figure 1). La figure 2 donne des exemples de migration typique, le flux de calcium et de la dynamique topologiques observé avec ce approche. En l&#39;absence d&#39;affaissement ...

L’immunité adaptative est contrôlée par des 'synapses immunologiques' dynamiques formées entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes. Ce protocole décrit des méthodes d’étude des cellules endothéliales à la fois en tant qu’APC physiologiques sous-étudiées et en tant que nouveau type de « modèle d’APC cellulaire planaire ».

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

L'objectif général de cette technique est d'utiliser les cellules endothéliales comme un nouveau modèle de cellule présentatrice d'antigène plane afin d'étudier les processus fondamentaux de signalisation antigénique. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunité adaptative, telles que la manière dont les dynamiques de remaniement subcellulaire et moléculaire sont coordonnées spatialement et temporellement au sein de la synapse immunologique. Le principal avantage de cette technique est que l'endothélium forme une surface de PC pratiquement plane.Cela permet une imagerie avec une résolution spatiotemporelle optimale dans le contexte d'une surface cellulaire physiologiquement complexe et malléable. Bien que cette méthode se concentre sur l'activation des cellules mémoires effetrices T CD4+, elle peut également être appliquée à l'étude d'une variété de types de lymphocytes T, d'antigènes et de processus de signalisation. Aujourd'hui, Chris et moi allons vous montrer comment réaliser la deuxième étape : commencer par transfecter des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires ou dermiques primaires humaines avec YFP membranaire et DS red soluble par affection nucléaire NU, puis semer les cellules transfectées dans des plaques de culture pour l'imagerie en temps réel de cellules vivantes.Le lendemain, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu frais supplémenté en interféron gamma afin d'induire l'expression des CMH de classe II sur les cellules endothéliales, puis stimulez les cellules avec 20 nanogrammes par millilitre de TNF alpha 24 heures plus tard, le jour 3, pendant 30 à 60 minutes. Avant de commencer l'expérience, incubez l'endothélium avec un microgramme par millilitre de chacun des superantigènes bactériens, la toxine B staphylococcique et la toxine du syndrome du choc toxique 1, à 37 degrés Celsius. Pendant l'incubation, comptez le nombre de cellules viables issues de la culture de lymphocytes d'intérêt et transférez deux fois 10 à la puissance 6 de ces cellules dans un tube conique de 15 millilitres.Ensuite, centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans deux millilitres de tampon A fraîchement préparé de manière à ce qu'aucun agrégat cellulaire ne subsiste. Puis ajouter deux micromoles de RA deux à l'échantillon de lymphocytes T, boucher le tube et l'inverser immédiatement pour homogénéiser. Répartir le colorant uniformément dans la suspension cellulaire.Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, centrifuger les lymphocytes marqués et redisperser délicatement mais complètement les cellules dans 20 à 40 microlitres de tampon A frais pour l'imagerie en direct. Placer les cellules sur le système de microscope et ouvrir le logiciel approprié de capture d'images. Régler les paramètres adéquats pour une acquisition automatisée en multicanal en laps de temps, ainsi que l'intervalle de prise de vue entre 10 et 30 secondes et une durée totale d'environ 20 à 60 minutes. Ensuite, ajouter de l'huile fraîche à l'objectif.Monter une boîte de microscope contenant 0,5 millilitre de tampon A sur l'adaptateur de plateau chauffant, puis allumer immédiatement l'adaptateur préalablement réglé à 37 degrés Celsius. Après deux à trois minutes d'équilibration, utiliser une pipette de 20 microlitres pour ajouter les lymphocytes au repos chargés de RA deux dans la chambre de la boîte de microscope montée et activer l'imagerie en champ clair. Sélectionner le trajet de lumière vers les oculaires et utiliser la molette de mise au point grossière pour amener l'objectif en contact avec le fond de la boîte de microscope.Ensuite, utilisez l'oculaire et le bouton de mise au point fine pour localiser les lymphocytes T déposés au fond de la boîte, puis utilisez les commandes du stage XY pour sélectionner un champ contenant au moins 10 cellules une fois les cellules appropriées localisées. Passez de l'éclairage en champ clair à la source de lumière fluorescente et de l'imagerie IP à la caméra CCD. Optimisez les paramètres d'acquisition, puis acquérez les images de repos de Fira 2 3 40 et de FIRA 2 3 80.Une des étapes clés pour obtenir des résultats concluants consiste à optimiser soigneusement les paramètres d'acquisition de la fluorescence, en veillant à ce qu'un signal suffisant soit recueilli et, dans le cas de FIRA deux, à ce que le rapport de base 3 43 80 soit proche de un. Une fois les temps d'exposition de FIRA deux réglés, remplacez la boîte de lymphocytes T par une boîte de microscope contenant des cellules endothéliales ; à l’aide d’une pipette jetable, retirez rapidement le milieu et rincez les cellules une fois avec un millilitre de tampon A préchauffé, puis remplacez le rinçage par 0,5 millilitre de tampon A frais. À l’aide de l’objectif, repérez des champs où les cellules endothéliales fortement fluorescentes apparaissent saines. Réglez ensuite les paramètres d’acquisition pour la YFP membranaire et la DS RED comme cela vient d’être démontré pour FIRA deux.Veiller à ce que l'intensité moyenne du signal fluorescent dans chaque canal se situe entre 25 et 75 % de la plage dynamique du détecteur. Avant de réaliser l'expérience d'imagerie de cellules vivantes, acquérir plusieurs séries d'images des cellules endothéliales seules afin d'établir une ligne de base à l'aide du logiciel automatisé. Puis insérer la pointe d'un petit volume dans le milieu, près du centre de l'objectif.Dispense lentement cinq microlitres de fira concentré, contenant deux lymphocytes chargés, au centre du champ d’imagerie de la boîte de microscope. Pendant que les lymphocytes se déposent, effectuez des réglages fins de la mise au point afin de maintenir les interfaces entre les lymphocytes T et les cellules endothéliales dans le plan focal. Avec des objectifs de 40 et 63 x, une densité de 10 à 20 cellules par champ est optimale.Après l'intervalle d'observation souhaité, poursuivez l'acquisition d'images et pipetez immédiatement du CIN directement dans la boîte du microscope jusqu'à une concentration finale de deux micromoles pour induire un flux calcique maximal sphera. Deux signal. Lorsque vous appliquez des traitements aux cellules, veillez à maintenir un bon contraste net sur la surface marquée par YFP de la membrane apicale de l'endothélium afin d'assurer une résolution optimale du remodelage de la synapse immunitaire.En l'absence de superantigène sur les cellules endothéliales, les lymphocytes T CD4 positifs spécifiques du superantigène s'étendent rapidement, polarisent et migrent latéralement sur les cellules endothéliales. Au cours de ce processus, les lymphocytes émettent des protrusions de courte durée ou PIL vers la surface endothéliale, visibles sous forme d'anneaux de fluorescence YFP membranaire analogues à des empreintes. En présence de superantigène, les contacts étroits entre cellules, induits par les PIL, sont associés à l'initiation d'un flux de calcium conduisant à l'accumulation de PIL stabilisés au sein de la synapse immunologique. De tels réseaux de PIL sont couplés à une signalisation calcique prolongée.Les anneaux de fluorescence membranaire qui se forment lors des interactions entre les cellules T et les cellules endothéliales correspondent aux protrusions des cellules T induisant des sites d'invagination distincts dans les cellules endothéliales, comme le confirme la démonstration selon laquelle ces anneaux coïncident spatialement et cinétiquement avec les zones de cytoplasme déplacé et exclu. En quelques minutes de co-incubation des cellules endothéliales et des cellules T en présence de superantigène, les molécules d'adhésion et de signalisation associées à la signalisation antigénique sont co-enrichies au sein des empreintes podales et des ILP (prolongements invadosome-like) de la synapse immunologique. En effet, la synapse immunologique entre les cellules T et les cellules endothéliales présente une architecture tridimensionnelle distincte, ponctuée par des ILP des cellules T s'étendant vers la surface de la cellule présentatrice d'antigène, au sein desquels la machinerie moléculaire de reconnaissance de l'antigène est enrichie.Grâce à cette approche, les principaux obstacles présents dans les modèles actuels de PC peuvent être surmontés, permettant d'observer une architecture subcellulaire tridimensionnelle autrement indétectable ainsi que le remodelage rapide des interfaces physiologiques entre les lymphocytes T et les PC. Cela offre un potentiel pour atteindre de nouveaux niveaux de compréhension des processus de signalisation antigénique.

an-endothelial-planar-cell-model-for-imaging-immunological-synapse

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Soutenu bicouches planaires sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires dans une synapse immunologique. Ici, nous montrons des méthodes pour l'ancrage des protéines d'adhésion cellulaire connue pour moduler la formation des synapses au feuillet supérieur de la bilyer lipides et de visualiser la formation des synapses en microscopie TIRF.

Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse

Cet article décrit une méthode pour visualiser la formation d'une synapse enveloppe du VIH-1 induite par le verre virologique soutenu bicouches planaires par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie. La méthode peut également être combiné avec immunofluorescence pour détecter l'activation et la redistribution des molécules de signalisation qui se produisent pendant le VIH-1 induite par l'enveloppe formation de la synapse virologique.

Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

Cette vidéo présente une technique in vitro pour étudier la formation de synapses immunitaires entre les lymphocytes T humains primaires et les bicouches lipidiques supportées (SLB). Les protéines de surface des lymphocytes T interagissent avec les ligands respectifs immobilisés sur la SLB pour former une synapse immunitaire, suivie du mouvement des granules lytiques vers la synapse, qui est visualisé à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Une technique in vitro pour étudier l’interaction des lymphocytes T avec des bicouches lipidiques planes soutenues

Cette vidéo montre l’imagerie de cellules vivantes de la topologie des synapses immunologiques, en étudiant les interactions entre les lymphocytes T et les cellules épithéliales porteuses d’antigènes fluorescents. La microscopie à fluorescence révèle un déplacement du cytoplasme rouge et des anneaux membranaires jaunes dans les cellules endothéliales, indiquant la formation de synapses immunologiques.

Évaluation de la topologie immunologique des synapses par l’imagerie de cellules vivantes

Source : Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage de virus adéno-associés clairsemés de populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo montre l’utilisation de la microscopie confocale pour visualiser la dynamique dendritique dans des explants rétiniens de souris vivantes. Il décrit les étapes de stabilisation de la rétine au microscope confocal, d’imagerie par épifluorescence pour...

Imagerie confocale en accéléré de la dynamique dendritique neuronale dans des explants rétiniens de souris

Ici, nous montrons le protocole pour l'imagerie par deux couleurs STED nanoscopie la synapse immunitaire cytotoxique des cellules NK récapitulés sur le verre. En utilisant cette méthode, on obtient la résolution nm sous-100 de protéines synaptiques et le cytosquelette.

Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

Nous décrivons ici une combinaison de la technique de bicouche lipidique soutenue par du verre pour former des synapses immunologiques avec la technique d’imagerie à super-résolution de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs les instructions nécessaires pour mener à bien ces deux techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

Nous décrivons ici un workflow complet pour l’analyse qualitative et quantitative du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines primaires et les cellules présentatrices d’antigène. La méthode est basée sur l’imagerie cytométrie en flux, qui permet l’acquisition et l’évaluation de plusieurs images de milliers de cellules dans un délai relativement court.

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

Ce protocole image à la fois la formation de synapse immunologique et le trafic sécréteur polarisé suivant vers la synapse immunologique. Des conjugués cellulaires ont été formés entre une cellule Raji à impulsion de superantigène (agissant comme cellule de présentation d'antigène) et un clone de Jurkat (agissant comme lymphocyte T d'aide d'effecteur).

Imagerie de la synapse immunologique humaine

Ce rapport fournit des protocoles d’assemblage, de culture cellulaire et de dosage sur la plateforme μSiM pour la construction de modèles de barrière hémato-encéphalique.

Utilisation de la plateforme tissulaire barrière MicroSiM (μSiM) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique

Découvrez l'utilisation de cellules endothéliales comme modèle plan de présentation d'antigènes pour étudier la dynamique de la synapse immunologique. Cette méthode permet une imagerie haute résolution des processus de signalisation antigénique.

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Explorer plus de vidéos