Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

L’objectif global de cette technique est d’utiliser les cellules endothéliales comme un nouveau type de modèle de cellule présentatrice d’antigène planaire pour étudier les processus fondamentaux de signalisation antigénique. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunité adaptative, telles que la façon dont la dynamique de remodelage subcellulaire et moléculaire est coordonnée spatialement et temporellement au sein de la synapse immunologique. Le principal avantage de cette technique est que l’endothélium se forme virtuellement plane sur une surface PC.

Cela permet d’obtenir une imagerie avec une résolution spatio-temporelle optimale dans le contexte d’une surface cellulaire physiologiquement complexe et formable. Bien que cette méthode se concentre sur l’activation des cellules mémoires CD, quatre TH positifs et un effecteur, elle peut également être appliquée à l’étude d’une variété de types de lymphocytes T, d’antigènes et de processus de signalisation. Aujourd’hui, Chris et moi allons vous montrer comment effectuer le deuxième Begin by code transectant des cellules endothéliales primaires pulmonaires humaines ou microvasculaires dermiques avec une membrane YFP et un SD rouge soluble via une affection nucléaire NU et plaquer les cellules transfectées sur des plaques de culture d’imagerie de cellules vivantes.

Le lendemain, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu frais complété par de l’interféron gamma pour induire l’expression du CMH M deux sur les cellules endothéliales, suivi d’une stimulation des cellules avec 20 nanogrammes par millilitre de TNF alpha 24 heures plus tard le troisième jour 30 à 60 minutes. Avant de commencer l’expérience, incubez l’endothélium avec un microgramme par millilitre, chacun des superantigènes bactériens de l’entérotoxine staphylococcique B et de la toxine du syndrome de choc toxique un à 37 degrés Celsius. Pendant l’incubation, comptez le nombre de cellules viables de la culture lymphocytaire d’intérêt et transférez deux fois 10 à la sixième des cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, faites tourner les cellules et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de tampon A fraîchement préparé de sorte qu’il ne reste plus d’amas de cellules. Ajoutez ensuite deux micromolaires RA deux à l’échantillon de cellules T, bouchez le tube et retournez-le immédiatement pour qu’il soit homogène. Répartissez le colorant dans toute la suspension cellulaire.

Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, faites tourner les lymphocytes marqués et remettez doucement mais complètement les cellules en suspension dans 20 à 40 microlitres de tampon A frais pour obtenir une image en direct, les cellules allument le système de microscope et ouvrent le logiciel de capture d’image approprié. Définissez les paramètres appropriés pour l’imagerie time-lapse multicanal automatisée, ainsi que l’intervalle d’acquisition de 10 à 30 secondes et une durée totale d’environ 20 à 60 minutes. Ensuite, ajoutez de l’huile fraîche à l’objectif.

Montez une parabole de microscope contenant 0,5 millilitre de tampon A sur l’adaptateur de platine de chauffage et allumez immédiatement l’adaptateur précédemment réglé à 37 degrés Celsius. Après deux à trois minutes d’équilibre, à l’aide d’une pipette de 20 microlitres, ajoutez les deux lymphocytes chargés de l’AR au repos dans la chambre de la boîte de microscope montée et activez l’imagerie en fond clair. Sélectionnez le chemin de la lumière vers les oculaires et utilisez le bouton de mise au point de course pour mettre l’objectif en contact avec le bas de la parabole du microscope.

Ensuite, utilisez l’oculaire et le bouton de mise au point fine pour localiser les cellules T installées au fond de la parabole et utilisez les commandes de la platine XY pour sélectionner un champ contenant au moins 10 cellules lorsque les cellules appropriées ont été localisées. Passez du fond clair à la source lumineuse fluorescente et de l’imagerie IP à la caméra CCD. Optimisez les paramètres d’acquisition puis acquérez les images au repos Fira 2 3 40 et FIRA 2 3 80.

L’une des étapes clés pour obtenir des résultats positifs est l’optimisation minutieuse des paramètres d’acquisition de fluorescence, en veillant à ce qu’un signal suffisant soit collecté et, dans le cas de Fira Two, à ce que le rapport de base 3 43 80 soit proche de un. Lorsque les deux temps d’exposition FIRA ont été réglés, remplacez la boîte de cellules T par une boîte de microscope de cellules endothéliales à l’aide d’une pipette de transfert jetable, retirez rapidement le milieu et rincez les cellules une fois avec un millilitre de tampon de préchauffage A, puis remplacez le lavage par 0,5 millilitre de tampon frais A. À l’aide de l’objectif, identifiez les champs dans lesquels les cellules endothéliales fluorescentes brillantes semblent saines. Ajustez ensuite les paramètres d’acquisition pour la membrane YFP et DS RED comme nous venons de le démontrer pour la fira deux.

Veiller à ce que l’intensité moyenne du signal fluorescent dans chaque canal se situe entre 25 et 75 % de la plage dynamique du détecteur. Avant de réaliser l’expérience d’imagerie de cellules vivantes, capturez plusieurs intervalles d’images des cellules endothéliales seules pour établir une base de référence avec le logiciel automatisé. Ensuite, en insérant la pointe d’un petit volume dans le support proche du centre de l’objectif.

Distribuez lentement cinq microlitres de fira concentré, deux lymphocytes chargés au centre du champ d’imagerie de la boîte du microscope. Au fur et à mesure que les lymphocytes se stabilisent, ajustez finement la mise au point pour vous assurer que les interfaces des cellules endothéliales des lymphocytes T sont maintenues dans le plan focal. Avec les objectifs 40 et 63x, 10 à 20 cellules par champ sont optimales.

Après l’intervalle d’observation souhaité, poursuivez l’imagerie et pipetez immédiatement CIN directement dans la boîte du microscope jusqu’à une concentration finale de deux micromolaires pour induire une sphérole de flux de calcium maximale. Deux signaux. Lors de l’application de traitements sur les cellules, veillez à maintenir une mise au point nette sur la surface de la membrane apicale marquée YFP de l’endothélium pour assurer une résolution optimale du remodelage des synapses immunitaires.

En l’absence de superantigène sur le CD endothélial, quatre lymphocytes TH positifs se propagent, se polarisent et migrent latéralement rapidement sur les cellules endothéliales. Au cours de ce processus, les lymphocytes étendent des protubérances à courte durée de vie ou ILP dans la surface endothéliale, qui sont évidentes sous forme d’anneaux de fluorescence YFP membranaire analogues à des empreintes en présence de superantigène, les contacts étroits de cellule à cellule pilotés par les ILP sont associés à l’initiation d’un flux de calcium conduisant à une accumulation d’ILP stabilisées dans la synapse immunologique. De tels réseaux ILP sont couplés à une signalisation calcique soutenue.

Les anneaux de fluorescence membranaire qui se forment lors des interactions entre les cellules endothéliales des lymphocytes T correspondent aux protubérances des lymphocytes T à l’origine de taches d’invagination discrètes dans les cellules endothéliales, comme le confirme la démonstration que ces anneaux sont en corrélation spatiale et cinétique avec les zones de cytoplasme déplacé et exclu. Dans les minutes qui suivent la co-incubation de l’endothélium et des lymphocytes T en présence d’une adhésion superantigène et les molécules de signalisation associées à la signalisation antigénique sont co-enrichies dans les empreintes pota et les ILP de la synapse immunologique. En effet, la synapse immunologique endothéliale des lymphocytes T présente une architecture tridimensionnelle discrète ponctuée d’ILP des lymphocytes T s’étendant jusqu’à la surface de la cellule présentatrice de l’antigène au sein de laquelle la machinerie moléculaire de reconnaissance de l’antigène est enrichie.

Grâce à cette approche, les principaux obstacles liés aux modèles de PC existants peuvent être surmontés, ce qui permet d’observer une architecture subcellulaire 3D autrement indétectable et de remodeler rapidement les interfaces physiologiques entre les cellules T et les PC. Cela offre un potentiel pour de nouveaux niveaux de compréhension des processus de signalisation antigénique.