High Throughput Danio rerio Dépense énergétique Assay

Les poissons-zèbres sont un organisme modèle important pour l’étude de l’homéostasie énergétique. En utilisant un indicateur redox sensible au NADH₂, alamar Blue, nous avons mis au point un test qui mesure le taux métabolique des larves de poisson-zèbre dans un format de plaque à 96 puits et peut être appliqué à la découverte de médicaments ou de gènes.

L’objectif global de ce test fluorométrique à haut débit à base de résazurine est de surveiller l’effet des manipulations génétiques ou pharmacologiques sur la production de NADH2, qui est une mesure du taux métabolique. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’obésité, telles que l’effet d’un médicament ou d’un gène donné sur le taux métabolique. De plus, ce test peut être appliqué pour dépister les interactions potentielles médicament-médicament ou médicament-gène dans l’ensemble d’un système animal.

Le principal avantage de ce test, par rapport aux tests de consommation d’oxygène, est le débit élevé et l’accumulation du signal dans le temps, ce qui permet à l’utilisateur de détecter de petites différences de taux métabolique. Caroline Foy, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Après avoir préparé une solution mère 60X de milieu E3 selon le protocole de texte, préparez 1X milieu E3 en diluant 16,5 millilitres de bouillon et un litre d’eau distillée doublement.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de bleu de méthylène à 1 %. Pour fabriquer une pipette jetable polie à la flamme pour le transfert d’œufs et de poissons, utilisez des ciseaux pour couper une pipette de transfert jetable graduée à la graduation de 0,25 millilitre. Ensuite, pour enlever les bords rugueux, utilisez un bec Bunsen pour polir à la flamme la pointe coupée.

Après avoir mis en place des croisements de poissons-zèbres et collecté les œufs, laissez les œufs se déposer au fond du plat et versez l’eau. Utilisez une pipette de transfert jetable à pointe fine pour évacuer l’eau restante. Rajoutez ensuite le support E3.

Incuber le poisson embryonnaire à 28,5 degrés Celsius jusqu’à quatre jours après la fécondation, ou DPF. Deux fois par jour, utilisez une pipette de transfert jetable graduée polie à la flamme pour retirer les ovules non fécondés ou les embryons morts. Ensuite, une fois par jour, versez le milieu E3.

Utilisez une pipette de transfert à pointe fine pour retirer tout fluide restant et remplacez-le par de l’E3 frais préchauffé à 28,5 degrés Celsius. Pour effectuer le dosage de la dépense énergétique, préparez la solution de dosage en suivant ce tableau. Utilisez un filtre de 0,22 micromètre pour filtrer la solution et réchauffez-la à 28,5 degrés Celsius dans un bain-marie pour le dos.

Dans une boîte de Pétri, mélangez tous les embryons viables de poisson-zèbre de la couvée. Après avoir stérilisé 75 millilitres de milieu E3, utilisez une pipette de transfert jetable à pointe fine pour retirer autant de milieu E3 que possible de la boîte de Pétri. Rajoutez 20 millilitres d’E3 stérile. Retirez ensuite et remplacez l’E3 stérile deux fois de plus.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert jetable en plastique graduée polie à la flamme, transférez des poissons embryonnaires individuels dans les puits d’une plaque de 96 puits. En travaillant avec une colonne de la plaque à la fois, retirez le milieu E3 des huit puits de la première colonne, en prenant soin de ne pas toucher les embryons avec la pipette de transfert. Ajoutez ensuite 300 microlitres de solution de dosage dans chaque puits.

Répétez l’opération avec les 12 colonnes de la plaque. Pour inclure un traitement médicamenteux, après avoir préparé une solution 100X du composé souhaité, ajoutez trois microlitres dans chacun des puits de traitement. Ajoutez ensuite trois microlitres de contrôle du véhicule dans les puits de contrôle des poissons.

Pour s’assurer que la réponse de fluorescence au composé est le résultat de l’activité à l’intérieur du poisson, mettez en place des traitements médicamenteux et véhiculatoires sur trois puits vierges chacun dans une plaque de 96 puits. Maintenant, à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence, avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 530 nanomètres et 590 nanomètres respectivement, lisez les puits de la plaque de poisson. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 28,5 degrés Celsius.

En fonction du dosage et de la stabilité du composé testé, relisez la fluorescence à un moment prédéterminé. Pour évaluer la variation relative de la fluorescence, calculez la variation moyenne de la fluorescence pour les puits témoins. Divisez ensuite la variation de fluorescence de chaque puits par la variation moyenne de fluorescence des puits témoins.

Voici un exemple d’utilisation de deux colonnes d’une plaque à 96 puits. Les puits de la colonne A comprennent des poissons-zèbres témoins traités par véhicule, tandis que les puits de la colonne B comprennent des poissons-zèbres traités à l’insuline. Le tableau A montre la fluorescence mesurée au temps zéro.

Le tableau B contient la fluorescence mesurée 24 heures plus tard. Dans le tableau C, la fluorescence au temps zéro a été soustraite de la fluorescence à 24 heures pour évaluer la variation de la fluorescence. Ensuite, calculez la variation moyenne de la fluorescence dans les puits témoins.

Le tableau D est la variation de la fluorescence de chaque puits individuel, divisée par la variation moyenne des puits témoins. Vous pouvez voir ici que le traitement à l’insuline à 10 micromolaires a provoqué une augmentation de 2,77 fois du signal généré par le poisson-zèbre sur 24 heures avec une valeur P inférieure à 0,0001. Comme on le voit ici, la solution de test ne change pas de couleur ou de niveaux de fluorescence absolus en l’absence d’embryons.

Cependant, le test est très sensible aux petits changements du taux métabolique dans le puits. Cette figure représente les signaux générés par le tilapia embryonnaire après une incubation de 24 heures. Les puits roses sont révélateurs de poissons ayant un taux métabolique élevé.

Les puits violets contiennent des poissons avec des taux métaboliques modérés, et les puits bleus représentent un faible taux métabolique. Cela montre également la polyvalence de ce test et de son application chez les espèces téléostéens. Parce que la réduction induite par le NADH2 du bleu alamar est non réversible, le signal s’accumule avec le temps, ce qui permet d’amplifier de petits changements.

On voit ici le changement relatif de fluorescence induit par un à cinq poissons à une, deux et quatre heures. À chaque augmentation du nombre de poissons, le changement relatif de fluorescence augmente considérablement avec le temps, et plus le nombre de poissons est grand, plus l’ampleur du changement de fluorescence est importante avec le temps. Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée sur jusqu’à 5 000 poissons embryonnaires par jour.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de veiller à ne pas blesser le poisson embryonnaire. Après avoir effectué ce test, d’autres procédures telles que la mesure du rouge du Nil des lipides neutres ou la mesure de l’entraînement phagique par l’incorporation de paramécie marquée au fluor peuvent être effectuées. Cela nous permet de comparer la relation entre le taux métabolique et le métabolisme des lipides, ou le taux métabolique et la pulsion phagique.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du métabolisme énergétique et des maladies métaboliques pour étudier la dépense énergétique chez le poisson zèbre sans limitation de débit. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le réactif fluorométrique resazurin pour mesurer la production de NADH2 chez le poisson zèbre.