Name: Décrire un règlement dépendant du facteur de transcription de lmicroARN transcriptome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Découvrez comment intégrer l'analyse bioinformatique, l'extraction de données publiques et le silençage d'un facteur de transcription par shRNA pour étudier la régulation du transcriptome des microARN.

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Cette étude a été soutenue par une subvention de la Fondation mondiale de recherche CLL. L&#39;Université du Texas MD Anderson Cancer Center est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé par le biais d&#39;un centre d&#39;assistance Grant Cancer (P30CA16672).

1. Identifier Facteur de transcription sites de liaison dans le promoteur des gènes microARN en utilisant l&#39;approche d&#39;exploration de données <ol><li> Utilisez l&#39;Université de Californie à Santa Cruz (UCSC) navigateur génome pour extraire des données immunoprécipitation (ChIP) de séquençage de chromatine générés dans le cadre de l&#39;Encyclopédie de l&#39;élément d&#39;ADN projet (ENCODE). <ol><li> Ouvrez le navigateur de table dans le navigateur de génome UCSC. </li><li> Utilisez les spécifications suivantes pour extraire la table: Clade: (Mammifères), génome: (Human), Assemblée: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), le groupe: (règlement), piste (TxnFactorChIP), table: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), région : (Genome), le format de sortie (tous les gènes de la table sélectionnée). </li><li> Enregistrer la sortie de 1.1.2 en tant que fichier .txt et dans une feuille de calcul. </li><li> Tri et filtre pour le facteur de transcription d&#39;intérêt (par exemple, STAT2). </li></ol></li><li> Utilisez la liste des promoteurs microRNA basé sur H3K4me3 épigénétique signature disponible au Baeer et al. 9 </sup&gt;. Copier cette liste dans un fichier .txt. </li><li> Pour correspondre selon les coordonnées sur le génome humain, cartographier les données à partir de 1.1 et 1.2 (par exemple, la liaison STAT3 sur les promoteurs de microARN putatifs) et de déterminer l&#39;affinité de liaison médiane en utilisant le code écrit en C sharp comme indiqué dans supplémentaire fichier 1 codage. </li></ol> 2. Utilisez shRNA Down réguler l&#39;expression d&#39;un facteur de transcription d&#39;intérêt <ol><li> Plaque de 1,5 x 10 6 cellules provenant d&#39; embryons humains 293 lignée de cellules de rein de 10 cm de la plaque à environ 50% de confluence (DMEM avec 10% de FBS). </li><li> les cellules transfecter de 293 lignée de cellules de rein embryonnaire humain avec 5 ug de protéine de fluorescence verte (GFP), des lentivirus contenant des shRNA dirigés vers le facteur de transcription d&#39;intérêt et avec 5 pg de vecteurs d&#39;emballage en utilisant le réactif de transfection pour les cellules adhérentes selon le protocole du fabricant. </li><li> En tant que témoin, transfecter les cellules de la lignée cellulaire 293 de rein embryonnaire humain avecbrouillés shRNA et les vecteurs d&#39;emballage selon le protocole du fabricant. </li><li> Gardez mélange de transfection sur des cellules pendant 16 heures (à 37 ° C, CO 2 incubateur), puis changer de support à 10 ml frais de 10% du milieu DMEM avec 10% de FBS. </li><li> Attendre 48 heures après transfection, centrifuger la culture cellulaire (300 xg, 5 min) et recueillir le surnageant infectieux. Filtrer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,45 pm (membrane d&#39;acétate de cellulose dépourvue d&#39;agent tensioactif de 25 mm) pour éliminer toutes les cellules flottantes. </li><li> On concentre le surnageant et recueillir le lentivirus au moyen d&#39;un dispositif de filtrage ultracentrifugation avec un seuil de 100 kDa. Centrifuger à 950 g pendant 30-60 min jusqu&#39;à ce que le volume a été concentré à moins de 250 pi. Stocker le virus concentré à -80 ° C. </li><li> Transfecter les cellules avec le lentivirus. Retirer lentivirus congelés de -80 ° C congélateur et décongeler à la température ambiante. Transfert 100 ul de surnageant viral à un 1,5 ml nouveau tube de microcentrifugation. <ol><li> Bring le volume dans le tube à 1 ml avec du milieu de sérum réduit. Ajouter le bromure de hexadimethrine à 1 ml virus suspension pour une concentration finale de 10 ng / ml, mélanger délicatement et laisser reposer le mélange pendant 5 min. </li></ol></li><li> Centrifuger 5 x 10 6 cellules pour chaque transduction et doucement remise en suspension du culot cellulaire dans 0,5 ml de milieu contenant le virus. Que les cellules restent dans l&#39;incubateur pendant 4-24 heures, puis ajouter 0,5 ml de milieu avec 20% de FBS à une concentration finale de 10% de FBS. </li><li> Attendre 48 à 72 heures et colorer les cellules avec de l&#39;iodure de propidium (PI) et la protéine fluorescente verte (GFP) selon les instructions du fabricant. Protéger les cellules de la lumière et utiliser un trieur FACS pour mesurer les taux de GFP + / PI - cellules. Comme les taches de PI seulement cellules mortes, ce taux est une estimation de l&#39;efficacité de transfection dans les cellules vivantes. </li><li> Trier la population de cellules positives à l&#39; expression de la GFP (GFP +) par FACS trieuse comme décrit précédemment 10. </li><li> Utilisez Western blot immunitaire comme décrit précédemment 10 pour déterminer les niveaux d&#39;un facteur de transcription d&#39;intérêt avant et après l&#39; infection des cellules d&#39;intérêt (par exemple, les cellules CLL) avec shRNA désigné. </li></ol> 3. Déterminer le niveau d&#39;expression de microARN transcriptome dans les cellules transfectées avec Transcription Factor-shRNA <ol><li> Isoler l&#39;ARN à l&#39;aide d&#39;un kit commercial en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Etiqueter l&#39;ARN et hybrider à microRNA microarray 11. </li><li> Déterminer le microARN exprimé de manière différentielle dans les cellules transfectées avec facteur de transcription shRNA ou vecteur vide contrôles 5. </li><li> Valider les résultats de puces à ADN pour les microARN les plus exprimés de manière différentielle à l&#39; aide de PCR en temps réel 5. </li></ol> 4. Déterminer le chevauchement entre les bio-informatique et de l&#39;approche shRNA en décrivant le transcriptome dépendante du facteur de transcription <ol><li> Pour detErmine les ratios attendus et observés de gènes microRNA qui abritent les sites de leurs promoteurs de liaison du facteur de transcription et ont été downregulated en facteur de transcription shRNA cellules transfectées, procédez comme suit: <ol><li> Obtenir le rapport de gènes qui abritent le facteur de transcription d&#39;intérêt dans leur promoteur / microRNA totale de la liste générée en 1.3. Cette liste est le rapport attendu (par exemple, les gènes microARN avec des sites de liaison STAT3 / total des gènes de microARN testés = 0,25). </li><li> Déterminer le nombre de gènes qui ont été réprimés dans les cellules transfectées facteur de transcription shRNA de la liste générée en 3.3 et a facteur de transcription des sites de liaison d&#39;intérêt de la liste générée en 1.3. Ce nombre / nombre total de gènes régulés à la baisse est le rapport observé (par exemple, les gènes microARN avec STAT3 sites de liaison / nombre total de microARN downregulated = 0,6). </li></ol></li&gt; <li> Utilisez χ2 statistiques pour comparer les ratios observés et attendus qui ont été générées ci-dessus et déterminer si la liste des gènes qui ont été downregulated dans des cellules transfectées facteur de transcription shRNA sont enrichies avec des sites de liaison du facteur de transcription dans leur promoteur. </li></ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+highly+enriched+within+microRNA+precursor+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences.</a> Biol Direct. 6, 61(2011).</li>
<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
<li>Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+preferentially+target+the+genes+with+high+transcriptional+regulation+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).</li>
<li>Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34%2C+SIRT1+and+p53%3A+the+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop.</a> Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).</li>
<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
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<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Le mécanisme sous-jacent l&#39;ARN polymérase dépendante II- transcription des gènes codant des protéines a été largement étudiée. Bien que ces éléments ne représentent que 1% - 2% du génome humain, la preuve du projet ENCODE suggèrent que plus de 80% du génome humain peut subir la transcription 17 et ce qui régule la transcription des éléments d&#39;ADN non codantes reste largement inconnue 6 . Plusieurs études, qui indiquaient que Pol II est également responsable de l...

Les microARN sont de petits ARN régulateurs non codantes endogènes qui fonctionnent généralement comme des régulateurs négatifs de l&#39;expression de l&#39;ARNm au niveau post-transcriptionnel. Environ 1000 non codante entre 20 et 25 nucléotides de long microARN sont présents dans le génome humain 1,2. Les microARN régulent l&#39;expression des gènes par appariement de bases canonique entre la séquence de semence de la microARN et sa séquence de match de semences complémentaire, qui est généralement situé à la région 3 &#39;non traduite (UTR) des ARNm cibles. Collectivement, les microARN réglementent plus de 30% des gènes codant des protéines 3, mais seulement on connaît peu la transcription de l&#39; ADN de microARN. Il a été suggéré que la régulation de la transcription microARN est similaire à celle de l&#39; ARNm de 4,5. En particulier, celle de son activité dans la promotion de la transcription des gènes codant pour des protéines, des facteurs de transcription sont censés activer la transcription de microARN 6. Facteur de transcription microRNA jeu a été rapporté comme un facteur de modulation de l&#39; expression génique 7, et peut également former un feed-back et des boucles feed-forward. Par exemple, Yamakuchi et al. A rapporté une boucle de rétroaction dans laquelle p53 induit l&#39;expression de microRNA34a, qui à son tour inhibe la traduction de la p53 SIRT répresseur et d&#39; accroître ainsi l&#39; activité de p53 8. Alors que des exemples spécifiques de facteur de transcription expression dépendante de microARN ont été signalés, une méthode acceptée qui fournit des informations sur la façon dont un facteur de transcription d&#39;intérêt régule l&#39;expression du microARN-transcriptome fait défaut. Le but du protocole proposé ici est de fournir une description détaillée de la réglementation des facteurs dépendant de la transcription du microARN-transcriptome. En combinant les données publiquement disponibles, les outils bioinformatiques et en utilisant la technologie des puces à ADN, les chercheurs qui suivent cet algorithme seraient en mesure de capturer sur une échelle génomique comment unfacteur de transcription dans tout type cellulaire d&#39;intérêt régule l&#39;expression du microARN-transcriptome et d&#39;explorer une contribution putatif du facteur de transcription de l&#39;ARNm dans la régulation de l&#39;expression de microARN.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 & micro ; Filtre à seringue Thermo</td><td>Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de filtration ultracentrifuge Amicon avec seuil de 100&nbsp ; kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrène</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Lignée cellulaire humaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

décrire un règlement dépendant du facteur de transcription de l&#39;microarn transcriptome

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Alors que la régulation de la transcription des gènes codant des protéines a été largement étudié, on sait peu sur la façon dont les facteurs de transcription sont impliqués dans la transcription des ARN non-codant, en particulier des microARN. Ici, nous proposons une stratégie pour étudier le rôle potentiel du facteur de transcription dans la régulation de la transcription des microARN en utilisant des données publiquement disponibles, les ressources de calcul et de données à haut débit. Nous utilisons la signature épigénétique H3K4me3 pour identifier les promoteurs de microARN et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) données -sequencing du projet ENCODE pour identifier les promoteurs de microARN qui sont enrichis avec des sites de liaison du facteur de transcription. Par transfection de cellules d&#39;intérêt avec shRNA ciblant un facteur de transcription d&#39;intérêt et à soumettre les cellules à matrice microRNA, nous étudions l&#39;effet de ce facteur de transcription sur le transcriptome microARN. A titre d&#39;exemple illustratif, nous utilisons notre étude sur l&#39;effet de STAT3 sur le transcriptome microRNA de ly chroniqueleucémie mphocytic (CLL) cellules.

STAT3 est un facteur de transcription qui induit généralement la transcription des gènes qui ont une activité anti apoptotique et des effets prolifératifs 12. Que STAT3 affectent également l&#39;ARN transcriptome non codant est actuellement inconnue. Dans toutes les cellules CLL STAT3 est constitutivement phosphorylée sur des résidus sérine 707 10,13. Navettes phosphosérine STAT3 vers le noyau, se lie à l&#39; ADN et activent des gènes connus pour être activés par l...

Dans ce document, nous proposons une stratégie pour étudier l’effet d’un facteur de transcription d’intérêt sur le transcriptome du microARN en utilisant des données accessibles au public, des ressources de calcul et des données à haut débit provenant de réseaux de microARN après transfection de cellules avec de petits ARN en épingle à cheveux (sh)RNA ciblant un facteur de transcription d’intérêt.

Décrire un règlement dépendant du facteur de transcription de l&#39;microARN transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

L'objectif général de cette méthodologie est de décrire comment un facteur de transcription d'intérêt régule le transcriptome des microARN. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant l'implication éventuelle des facteurs de transcription qui modulent la transcription des gènes codant pour des protéines dans la transcription des microARN. Le principal avantage de cette méthodologie réside dans son intégration de l'exploration de données, de données expérimentales et d'analyses bioinformatiques afin de fournir une description complète des transcriptions des gènes de microARN dépendant de l'activité du facteur de transcription étudié.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'interaction entre la transcription des gènes de microARN et l'activité liée à l'état du facteur de transcription, il est important de garder à l'esprit qu'il s'agit d'une méthode descriptive, et que la confirmation d'une telle association doit être effectuée à l'aide d'autres tests. Pour commencer, ouvrez un navigateur génomique, tel que le navigateur génomique de l'Université de Californie à Santa Cruz, afin d'extraire les données de séquençage après immunoprécipitation de la chromatine. Une fois sur le site, rendez-vous dans le menu supérieur, sélectionnez Outils, puis ouvrez le Navigateur de table.Saisissez les spécifications, comme indiqué ici, dans les champs correspondants, puis sélectionnez Obtenir le résultat pour extraire le tableau. Enregistrez le résultat sous forme de fichier texte. Ensuite, importez le fichier dans un tableur.Une fois dans le programme de feuille de calcul, trier la colonne des noms et filtrer les résultats pour un facteur de transcription d'intérêt, tel que STAT2. Ensuite, copier la liste des promoteurs de microARN en fonction de leur signature épigénétique H3K4me3 et coller la liste dans un fichier txt. Puis, utiliser le code supplémentaire rédigé en SQL et fourni dans les fichiers de données supplémentaires pour cartographier les données recueillies et déterminer l'affinité médiane de liaison.Commencez par ajouter 1,5 million cellules HEK293 dans une boîte de 10 centimètres et ajoutez du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS. Incubez les cellules pendant 24 heures jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence d'environ 50 %. Ensuite, remplacez le milieu.Ensuite, ajoutez un agent de transfection combiné à cinq microgrammes d'un lentivirus exprimant une protéine fluorescente verte contenant le shARN ciblé et cinq microgrammes de vecteurs d'emballage, conformément aux instructions du fabricant. En tant que contrôle, transfectez une plaque identique de cellules à l'aide d'un shARN aléatoire (scrambled) et des vecteurs d'emballage. Incubez le mélange de transfection avec les cellules pendant 16 heures, puis remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu DMEM frais supplémenté en 10 % de FBS.48 heures après la transvection, retirez le milieu des cellules. Ensuite, centrifugez pendant cinq minutes afin de recueillir le surnageant infectieux. Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micron pour éliminer toute cellule en suspension.Ensuite, ajoutez le milieu dans un dispositif de filtration ultracentrifuge d’un seuil de 100 kilodaltons. Centrifugez le milieu pour concentrer le lentivirus jusqu’à ce que le volume soit inférieur à 250 microlitres. Transférez le liquide restant dans un cryotube et conservez le virus concentré à moins 80 degrés Celsius jusqu’à son utilisation. Lorsque vous êtes prêt à poursuivre, retirez le lentivirus congelé du congélateur à moins 80 et amenez le flacon à température ambiante. Transférez 100 microlitres de surnageant viral dans un nouveau tube microfuge de 1,5 millilitre et ajoutez 900 microlitres de milieu sans sérum. Ensuite, ajoutez 10 nanogrammes par millilitre d'hexadiméthrine bromure à la suspension virale d'un millilitre.Mélanger délicatement le tube et laisser le mélange reposer pendant cinq minutes. Récolter cinq millions de cellules pour chaque transduction prévue, puis re-suspendre doucement le culot cellulaire dans 0,5 millilitre de milieu contenant le virus. Transférer les cellules dans une plaque de 12 puits et les incuber pendant quatre à 24 heures.Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre supplémentaire de milieu contenant 20 %FBS. Entre 48 et 72 heures après la transduction, récoltez les cellules et étiquetez-les avec de l'iodure de propidium selon les instructions du fabricant. Après la coloration, protégez les cellules de la lumière et utilisez des faits pour estimer l'efficacité de la transvection en mesurant les taux de cellules positives pour la GFP et négatives pour l'iodure de propidium.Ensuite, récupérez la population de cellules positives pour la GFP triées et extrayez leurs protéines. Enfin, utilisez le western blotting pour déterminer les niveaux du facteur de transcription ciblé avant et après l'infection des cellules avec le shARN désigné. Après la transfection des cellules de LLC avec le shARN ciblant STAT3, les niveaux d'ARNm STAT3 et de protéine STAT3 ont tous deux significativement diminué.En outre, une analyse par puces à microARN des cellules de LLC a révélé 23 microARN dont l'expression différait de manière significative entre les cellules de LLC transfectées avec un ARNi contre STAT3 et celles transfectées avec un vecteur vide. Les résultats de la puces à microARN ont été validés pour sept de ces gènes, présentés ici, à l'aide de la RT-PCR quantitative. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunoprécipitation de la chromatine, le test de migration en gel et un test de différence peuvent être réalisées afin de confirmer que ce facteur de transcription se lie et active le promoteur d'un gène miroir spécifique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'intégrer une analyse de bio-informatique, des données accessibles publiquement et la suppression d'un facteur de transcription à l'aide d'une approche par ARNh pour déterminer comment ce facteur de transcription régule l'expression des gènes de microARN.

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La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome de collecte de l'ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l'application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

Les microARN (miARN) sont des régulateurs importants de l'expression génique et ont été montrés à jouer un rôle dans de nombreux processus biologiques. Afin de mieux comprendre les interactions miARN-UTR, nous avons créé une collection pangénomique de journalistes UTR 3 luciférase jumelé avec un nouveau gène de la luciférase et réactif de dosage, le système LightSwitch.

L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

Nous décrivons ici une méthode de régulation du tropisme du picornavirus en incorporant des séquences complémentaires à des microARN spécifiques dans le génome viral.  Ce protocole peut être adapté à toutes les différentes classes de virus, avec des modifications en fonction de la durée et de la nature de leur cycle de vie.

Règlement de Picornavirus Tropisme base microARN-

Ce rapport décrit une méthode rapide et fiable pour la validation de cibles ARNm des miARN cellulaire. La méthode utilise biotinylé synthétique basé sur Locked Nucleic Acid LNA miRNA imite pour capturer les cibles ARNm. Par la suite, streptavidine des billes magnétiques travaillent à menu déroulant la cible ADN messagère pour la quantification par qPCR polymerase chain reaction.

Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

Nous décrivons ici une inversion optimisé multiplexe transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR) en combinaison avec le protocole d'une plateforme microfluidique comme un coût et le temps moyen efficace de dépistage à haut débit pour microARN (miARN) les niveaux d'expression, surtout quand on travaille avec des quantités limitées de l'échantillon.

Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l&#39;échelle nanolitres sur l&#39;IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

Visualisation de volume non destructifs peuvent être atteints que par des techniques tomographiques, dont le plus efficace est la tomographie aux rayons X micro ordinateur (TAO).

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Nous décrivons l'utilisation d'un instrument stopped-flow d'enquêter sur les deux réductrices et l'oxydation des demi-réactions...

Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d&#39;une monooxygénase flavine-dépendante à l&#39;aide Stopped-Flow Spectrophotométrie

Nous présentons une combinaison de cryo-microscopie électronique, lipides nanotechnologies, et l'analyse de la structure appliquée pour résoudre la structure membranaire des deux formes de FVIII hautement homologues: les droits et les porcins. La méthodologie développée dans notre laboratoire à organiser de manière hélicoïdale les deux formes de FVIII recombinants fonctionnels sur les nanotubes de lipides chargés négativement (LNT) est décrite.

Organisation hélicoïdale de facteur VIII de coagulation du sang sur les lipides nanotubes

Ici, nous décrivons des méthodes simples pour la préparation de vésicules, l'encapsulation de la transcription et de la machinerie de traduction, et le suivi de la production de protéines. Les systèmes sans cellules résultantes peuvent être utilisées comme point de départ pour construire imite cellulaires de plus en plus complexes.

L&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

Découvrez comment intégrer l'analyse bioinformatique, l'extraction de données publiques et le silençage d'un facteur de transcription par shRNA pour étudier la régulation du transcriptome des microARN.

Décrire un règlement dépendant du facteur de transcription de l'microARN transcriptome

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