Name: Essai in vitro pour mesurer Phosphatidyléthanolamine Methyltransferase activité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez comment mesurer l'activité de la phosphatidyléthanolamine méthyltransférase (PEMT) dans des extraits cellulaires de Leishmania sans purification enzymatique. Cette méthode in vitro utilise le transfert de groupes méthyle radioactifs pour quantifier l'activité PEMT et fournit des informations sur le métabolisme lipidique des parasites.

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Extrait 1. Préparation des cellules <ol><li> Cultiver les cellules de Leishmania dans une bouteille en plastique stérile scellé avec chapeau d&#39;air étanche à 26 ºC dans un milieu en 1x M199 supplémenté avec 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, 5 ug / ml hème , 0,35 g / L NaCO 2 H, mM adénine 0,1 et 2 ng / ml bioptérine sans agitation. Récolter les cellules par centrifugation à 1500 g pendant 5 min à 4 ° C quand ils atteignent une densité cellulaire de 1-2 x 10 7 / ml. </li><li> Jeter le surnageant avec une pipette et laver les cellules par remise en suspension du culot de cellules avec une pipette sérologique à la moitié du volume de la culture d&#39;une solution saline de phosphate froide tamponnée (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na 10 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4). Éliminer des surnageants de cellules selon les directives de sécurité BL2. </li><li> Centrifuger les cellules à nouveau à 1500 g pendant 5 min à 4 ºC. Jeter le surnageant avec une pipette. Procéder to l&#39;étape suivante ou enclencher geler le culot de cellules dans de l&#39;azote liquide pour stockage à long terme à -80 ºC (jusqu&#39;à trois mois). </li><li> Préparer 2x tampon de lyse (0,5 M de saccharose, 0,1 M TrisHCl, pH 7,5, EDTA 2 mM, et l&#39;inhibiteur de protéase de 2x cocktail) et le conserver à 4 ° C sur de la glace. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire (frais ou congelé) dans un volume égal de tampon de lyse 2X. Ajouter 1x volume de billes de verre. Vortex vigoureusement à 4 ºC pendant 10 min. </li><li> Ajouter 2 volumes de tampon de lyse 1x et mélanger. Des extraits cellulaires de centrifugeuses à 1500 g à 4 ° C pendant 10 min pour sédimenter les cellules et des noyaux intacts. </li><li> Transférer le surnageant avec une pipette dans un tube de centrifugeuse fraîche et la maintenir extraits cellulaires sur la glace jusqu&#39;à la fin de l&#39;expérience. </li></ol> 2. Déterminer la concentration en protéines de l&#39;extrait cellulaire utilisant le kit Protein Estimation Comme Bicinchoninic Acid Test <ol><li> Préparer l&#39;acide bicinchoninique (BCA) solution (1 ml / tube) en mélangeant le BCA et de cuivre (II) sulfate dans un rapport de 49: 1 (v / v). </li><li> Préparer les étalons de protéine de 0, 10, 20, 30, 40, 50, et 60 ug / ml par dilution d&#39;un ml d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) solution à 10 mg / des stocks en aliquotes de 1 ml de la solution de BCA. </li><li> Ajouter 2 ul d&#39;extraits de cellules dans 1 ml de solution de BCA en double. Incuber des normes et des échantillons de protéines pendant 10 min dans un bain d&#39;eau à 60 ° C préchauffé. </li><li> Échantillons de transfert de la glace pendant 3 min. Mesurer l&#39;absorbance des étalons et des échantillons de protéines avec un spectrophotomètre à une longueur d&#39;onde de 562 nm. </li><li> Calculer la concentration en protéine des extraits cellulaires en utilisant la BSA comme étalon de référence, comme décrit dans le protocole du fabricant. Diluer extraits cellulaires à une concentration en protéine de 10 mg / ml avec du tampon de lyse 1x. </li></ol> 3. enzymatique de dosage dans 200 pi par tube REMARQUE: Effectuer les étapes suivantes dans une hotte chimique. <ol><li> Tester chaque échantillon en double en 15 mltube conique. Préparer 20 pi 1 M TrisHCl pH 7,5 par tube et le garder sur la glace. Préparation 2 ml d&#39;un mélange chloroforme / méthanol (1: 1 (v / v); solution d&#39;arrêt) à température ambiante pendant chaque tube. </li><li> Pipet 20 pl de 1 M TrisHCl pH 7,5 dans chaque tube de 15 ml conique sur la glace. </li><li> Suivez les directives de sécurité de rayonnement à partir d&#39;ici. Ajouter l&#39;équivalent de 0,06 uM (0,2 uCi) S - [méthyl-3H] adénosyl-L-méthionine et 50 pm SAM froid par tube pour un total de 50,06 M de SAM. Ajouter x ul d&#39;eau froide où x = 200 (20 (pour le tampon) + 20 (pour les extraits cellulaires) + volume de froid et radioactifs SAM) par tube. </li><li> Transférer chaque tube conique à un bain d&#39;eau à 30 ºC préchauffé. Ajouter à chaque tube 20 ul d&#39;extraits cellulaires (équivalent de 200 pg de protéine) pour démarrer la réaction. Incuber pendant le temps désiré (0 à 45 min). </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 2 ml d&#39;un mélange chloroforme / méthanol (1: 1, v / v; solution d&#39;arrêt) à chaque tube. Transférer le tube conique à RT (20-256; C). </li></ol> 4. Extraction des lipides REMARQUE: Effectuer les étapes suivantes dans une hotte chimique. <ol><li> Ajouter 700 ul d&#39;eau à chaque tube contenant l&#39;échantillon de réaction enzymatique. Vortex vigoureusement pendant 30 sec. Centrifuger à 1500 xg pendant 5 min à température ambiante pour séparer le organique de la phase aqueuse. </li><li> Transférer la phase organique inférieure dans un nouveau tube conique de 15 ml avec une pipette. Ajouter 1 ml d&#39;eau à chaque &quot;phase inférieure&quot; et contenant le tube vortex vigoureusement pendant 30 sec. Centrifuger de nouveau à 1500 x g pendant 5 min pour séparer la phase organique de l&#39;eau. </li><li> Transférer la phase organique inférieure dans un tube à scintillation avec une pipette. Les échantillons secs sous un courant de N 2. Éliminer les phases de l&#39;eau contenant de la SAM radioactif non incorporé et les tubes coniques radioactives conformément aux lignes directrices de rayonnement. </li><li> Ajouter 2 ml / tube à scintillation liquide. Mesurer la radioactivité incorporée avec un cou de scintillationnter selon le protocole du fabricant et l&#39;utilisation de l&#39;instrument. </li><li> Calculer l&#39;activité enzymatique en nmol / mg de protéine en utilisant l&#39;équation générale suivante: valeur cpm x 10 x 3 [total (radioactifs et froid) concentration de SAM (mM)] x 5 activité spécifique de SAM radioactif (Ci / mmol de) Les x [concentration de SAM radioactif (mM)] REMARQUE: le protocole ci-dessus peut être modifiée pour une concentration SAM dépendante ou un test de OGERP dépendante de la protéine. Pour le dosage enzymatique dépendant de la concentration de SAM, le temps est maintenue constante (15 min, ce qui est dans la plage linéaire) et diverses quantités de SAM froid sont ajoutés à l&#39;essai tandis que pour dépendante dosage de OGERP protéique, la concentration de SAM (nous avons choisi 0,05 mM) et le temps sont maintenus constants (15 min). De plus, le pH du tampon peut être modifiée selon les besoins, si certaines enzymes OGERP ont une valeur de pH optimal différent. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré

Ce dosage de OGERP simple, rapide permet la quantification des formes méthylées de PE qui résulte du transfert de groupes méthyle de SAM sur radioactives PE en utilisant un extrait de cellules entières en tant que source de protéine. Il est rapide, sensible, reproductible, et également adapté pour 17 des enzymes purifiées. Monométhylique ou diméthylique-PE peuvent être ajoutés à l&#39;essai si la méthyltransférase d&#39;intérêt est spécifique de ces substrats au lieu de PE 12,13,18,19. Si enzyme pu...

Phosphatidyléthanolamine méthyltransférase (OGERP) enzymes catalysent la fixation covalente d&#39;un ou plusieurs des groupes méthyle à l&#39;aide de S -adenosylmethionine (SAM) comme le groupe méthyle donneur sur PE, monométhyl-PE ou diméthyl-PE pour donner monométhyl-PE, le diméthyl-PE et / ou phosphatidylcholine (PC). Ces enzymes sont presque omniprésents dans les cellules animales et les champignons. Ils peuvent également être trouvés dans des plantes 1 et environ 10% des bactéries, en particulier celles qui interagissent avec les eucaryotes 2. PEMTs correspondant à la biologie de la cellule, non seulement en contribuant à la production de PC, qui est la principale classe de lipides dans les cellules animales, mais aussi en remplissant d&#39;autres fonctions cellulaires importantes. Chez les mammifères, PEMTs sont principalement exprimés dans le foie où ils sont nécessaires pour la sécrétion normale de la lipoprotéine de très basse densité et ils contribuent également à l&#39;obésité induite par l&#39;alimentation 3, 4 athérosclérose, et l&#39;insuline résistentance 5. En outre, OGERP mammifères sont également exprimée dans les adipocytes, mais à des niveaux inférieurs, et de participer à des dépôts de graisse 6, 7. OGERP rôle dans le développement du cancer 8, 9 apoptose, et 10 de la croissance cellulaire a également été démontrée. Chez les bactéries, les enzymes OGERP se sont révélés être importants pour la croissance normale de la cellule 2, 2 virulence, et symbiose avec la plante hôte 11. Le but et la justification du présent Protocole est de mesurer l&#39;activité OGERP à partir d&#39;extraits de cellules entières, sans la nécessité de purifier l&#39;enzyme. Deux protocoles distincts ont été développés pour mesurer l&#39;activité OGERP. La première et la plus commune mesure le transfert d&#39;un groupe méthyle tritiée de SAM radioactifs sur PE, qui est le sujet de cet article. Ce protocole a été développé à l&#39;origine pour mesurer l&#39;activité de la levure OGERP 12 et des cellules de mammifères (foie) 13 pour obtenir un understanding biosynthèse de PC dans ces cellules ainsi que pour déterminer la spécificité de ces enzymes. Par la suite, cette technique a été appliquée à d&#39;autres types tels que des bactéries de cellules (2 à l&#39;aide d&#39;une valeur de pH basique pour le dosage si 15) et des protozoaires parasites 14. Cette technique peut être utilisée avec des extraits de cellules entières, ainsi que l&#39;enzyme purifiée, et peut potentiellement être appliqué à tout système d&#39;extrait cellulaire. Un essai non radioactif a également été conçu qui repose sur la quantification enzymatique de -adenosylhomocysteine ​​S, le produit de transméthylation de 16 SAM. Ce dernier dosage peut être plus pratique, car elle ne comporte pas de radioactivité, mais elle ne convient que pour des enzymes purifiées.

<table><tbody><tr><td>S-[Methyl-3H]adénosyl-L-méthionine (activité spécifique de 5-15 Ci/mMole)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>Aliquote le réactif et congeler à -20 &deg ; C; suivez les directives de radioprotection lors de l’utilisation de ce réactif</td></tr><tr>Cocktail<td>d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>diluez-le frais&nbsp ;</td></tr><tr><td>Perles de verre, lavées à l’acide, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acide bicinchoninique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Compteur à scintillation MicroBeta2 avec 1 détecteur</td><td>Perkin Elmer&nbsp ;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>BSA solution mère (10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Liquide à scintillation&nbsp ;</td><td>Research Product International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de S-(5'-Adénosyl)-L-Méthionine (chlorhydrate)&nbsp ;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>diluer le réactif dans 20 mM HCl et congeler les aliquotes à -80 &deg ; C&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

essai in vitro pour mesurer phosphatidyléthanolamine methyltransferase activité

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Les méthyltransférases phosphatidyléthanolamine sont des enzymes biosynthétiques qui catalysent le transfert d’un ou plusieurs groupes-méthyles de la S-adénosyl-L-méthionine sur la phosphatidyléthanolamine, la monométhyl-phosphatidyléthanolamine ou la diméthyl-phosphatidyléthanolamine pour donner soit la monométhyl-phosphatidyléthanolamine, soit la diméthyl-phosphatidyléthanolamine ou la phosphatidylcholine. Ces enzymes sont omniprésentes dans les cellules animales, les champignons et se trouvent également dans environ 10 % des bactéries. Ils remplissent diverses fonctions importantes dans la physiologie cellulaire au-delà de leur rôle direct dans le métabolisme des lipides, comme la résistance à l’insuline, le diabète, l’athérosclérose, la croissance cellulaire ou la virulence. Le présent manuscrit fait état d’un test enzymatique acellulaire simple qui mesure le transfert de groupuscules méthyles tritiés de la S-[Méthyl-3H]adénosyl-L-méthionine sur la phosphatidyléthanolamine en utilisant des extraits de cellules entières comme source d’enzymes. Les formes méthylées de phosphatidyléthanolamine qui en résultent sont hydrophobes et peuvent donc être séparées de la S-[méthyl-3H]adénosyl-L-méthionine soluble dans l’eau par extraction organique. Ce test peut potentiellement être appliqué à tout autre type de cellules et utilisé pour tester des inhibiteurs/médicaments spécifiques d’une phosphatidyléthanolamine méthyltransférase d’intérêt sans qu’il soit nécessaire de purifier l’enzyme.

La figure 1 montre un dosage de OGERP dépendant du temps, qui a été réalisée avec Leishmania extrait de cellules entières comme source d&#39;enzyme endogène PE en utilisant comme substrat. La quantité de radioactivité dans la phase organique a été quantifiée par comptage par scintillation. Les chiffres obtenus ont été utilisés pour calculer le montant de groupes méthyle tritiatés transférés sur PE. L&#39;activité de OGERP était linéaire pendant environ 20 min. I...

Le présent rapport décrit un essai enzymatique in vitro pour mesurer l’activité de la phosphatidyléthanolamine méthyltransférase à l’aide d’extraits de cellules de Leishmania. Ce dosage est basé sur le transfert d’un groupe méthyle radioactif de la S-[méthyl-3H]adénosyl-L-méthionine sur la phosphatidyléthanolamine endogène.

Essai in vitro pour mesurer Phosphatidyléthanolamine Methyltransferase activité

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

L'objectif général de cette méthodologie est de quantifier l'activité de la phosphatidyléthanolamine méthyltransférase, ou PEMT, à partir d'extraits totaux de cellules. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine du métabolisme lipidique, telles que l'importance des phosphatidyléthanolamine méthyltransférases dans la biosynthèse de la phosphatidylcholine. Le principal avantage de ce protocole est qu'il peut être mesuré à partir d'un extrait total de cellules et ne nécessite pas la purification de l'enzyme.Ainsi, ce protocole peut fournir des informations sur la manière dont les parasites synthétisent leur lipide le plus abondant, la phosphatidylcholine. Ce protocole peut également être appliqué à d'autres types cellulaires, tels que les cellules de mammifères et les bactéries. Culture des cellules de Leishmania dans une bouteille en plastique stérile fermée avec un bouchon étanche à l'air à 26 degrés Celsius dans un milieu M199 supplémenté, sans agitation.Récupérez les cellules par centrifugation à 1500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Lorsqu'elles atteignent une densité cellulaire de 10 à 20 millions de cellules par millilitre. Après avoir éliminé le surnageant à l’aide d’une pipette, lavez les cellules en resuspendant le culot cellulaire avec une pipette serologique dans un volume égal à la moitié du volume de culture de solution saline tamponnée au phosphate froide.Centrifuger à nouveau les cellules à 1550G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette. Passer à l’étape suivante ou congeler rapidement le culot cellulaire dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme à moins 80 degrés Celsius.Ensuite, re-suspendre le culot cellulaire dans un volume égal de tampon de lyse 2X. Ajouter un volume de billes de verre et vortexer vigoureusement à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter deux volumes de tampon de lyse 1X et mélanger.Ensuite, centrifuger les extraits cellulaires à 1500G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes afin de former un culot contenant les cellules non lysées et les noyaux. Transférer le surnageant à l’aide d’une pipette dans un nouveau tube de centrifugation refroidi et conserver les extraits cellulaires sur de la glace jusqu’à la fin de l’expérience. Ajouter deux microlitres d’extrait cellulaire à un millilitre de solution d’acide bicinechoninique et faire une duplication.Incuber les étalons et les échantillons protéiques pendant 10 minutes dans un bain-marie préchauffé à 60 degrés Celsius. Transférer les échantillons sur de la glace pendant trois minutes. Mesurer les absorbances des étalons et des échantillons protéiques à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 562 nanomètres.Calculez la concentration en protéines des extraits cellulaires en utilisant l'albumine sérique bovine comme étalon selon les instructions du protocole du fabricant. Diluez les extraits cellulaires à une concentration en protéines de 10 milligrammes par millilitre avec du tampon de lyse 1X. Dans une hotte chimique, analysez chaque échantillon en double dans un tube conique de 15 millilitres.Préparez 20 microlitres d'une solution de TrisHCl un molaire à pH 7,5 par tube et maintenez-la sur de la glace. Préparez également deux millilitres d'une solution d'arrêt au chloroforme-méthanol à température ambiante pour chaque tube. Pipetez 20 microlitres de la solution de TrisHCl un molaire dans chaque tube conique de 15 millilitres placé sur de la glace.Ensuite, conformément aux directives de sécurité en matière de rayonnements, ajouter l'équivalent de zéro virgule zéro six micromolaire de SAM tritiée et 50 micromolaires de SAM froide par tube, soit un total de 50 virgule zéro six micromolaires de SAM. À ce stade, ajouter un volume d'eau froide par tube calculé conformément au protocole décrit dans le texte. Transférer chaque tube conique dans un bain-marie préchauffé à 30 degrés Celsius.Ajouter 20 microlitres d'extraits cellulaires dans chaque tube pour démarrer la réaction. Incuber les échantillons pendant la durée souhaitée. Arrêter la réaction en ajoutant deux millilitres de chloroforme-méthanol dans chaque tube.Transférez les tubes coniques à température ambiante. Dans une hotte chimique, ajoutez 700 microlitres d'eau à chaque tube contenant l'échantillon de réaction enzymatique. Vortexez vigoureusement pendant 30 secondes.Ensuite, centrifuger à 1500g pendant cinq minutes à température ambiante pour séparer la phase organique de la phase aqueuse. Il est essentiel, lors du transfert de la phase inférieure, de ne pas prélever de la phase aqueuse, car cela fausserait le calcul de dosage. Utiliser une pipette pour transférer la phase organique inférieure dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.Ajouter un millilitre d’eau dans chaque tube contenant la phase inférieure et vortexer vigoureusement pendant 30 secondes. Ensuite, centrifuger à nouveau à 1500G pendant cinq minutes afin de séparer la phase organique de la phase aqueuse. Transférer la phase organique inférieure dans un tube à scintillation à l’aide d’une pipette.Séchez les échantillons sous un courant d'azote gazeux. Éliminez les phases aqueuses contenant le SAM radioactif non incorporé et les tubes coniques radioactifs conformément aux directives relatives aux rayonnements. Ensuite, ajoutez deux millilitres de liquide de scintillation par tube.Mesurez la radioactivité incorporée à l'aide d'un compteur à scintillation selon le protocole du fabricant et les instruments utilisés. Calculez l'activité enzymatique en nanomoles par milligramme de protéine en utilisant l'équation indiquée dans le protocole écrit. On montre ici un dosage de PEMT dépendant du temps qui a été réalisé avec un extrait total de cellules de Leishmania comme source enzymatique, en utilisant le PE endogène comme substrat.La quantité de radioactivité dans la phase organique a été quantifiée par comptage en scintillation et utilisée pour calculer la quantité de groupes méthyles tritiés transférés sur la PE. L'activité de la PEMT était linéaire pendant environ 20 minutes. Elle atteignait ensuite un plateau vers 30 minutes, après quoi elle restait constante pendant encore 15 minutes. Comme prévu, aucune activité de la PEMT n’a été détectée en l’absence d’extraits cellulaires, tandis qu’une activité a été détectée lorsque des extraits cellulaires ont été ajoutés au test.En outre, cette activité était abolie en présence de 100 micromolaire de bromure d'octadécyltriméthylammonium, un inhibiteur spécifique des phosphatidyléthanolamine N-méthyltransférases de Leishmania major LMJ PEM Un et LMJ PEM deux. L'activité PEMT dépendait également de la concentration en protéines, et cette activité était proportionnelle de façon linéaire à la quantité de protéine utilisée dans le dosage enzymatique. Enfin, un dosage de l'activité PEMT dépendant de la concentration en SAM a été réalisé, dans lequel des concentrations croissantes de SAM ont été testées.L'activité de la PEMT a atteint un plateau à une concentration de SAM d'environ 0,5 millimolaire. Ce protocole peut être réalisé en trois à cinq heures selon le nombre d'échantillons. Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est très important d'utiliser du SAM récemment acheté, car ce composé est instable.N'oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes et des matières radioactives peut être extrêmement dangereux. Par conséquent, il est essentiel de suivre les consignes de sécurité et de porter les équipements de laboratoire appropriés.

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