Name: Une alternative simple à injection stéréotaxique pour Brain Knockdown spécifique de miARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez une méthode d'inhibition des microARN cérébraux chez la souris utilisant un peptide neurotrope et un antagomir modifié par acide nucléique verrouillé. Cette technique évite l'injection stéréotaxique et facilite l'étude des maladies neurodégénératives.

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Nous remercions Souvik Maiti pour son aide dans la conception des antagomirs. Nous remercions également Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey et Bijay Pattnaik pour leur aide avec les méthodes expérimentales. Ces travaux ont été financés par le Conseil de la recherche scientifique et industrielle (BSC0123). HS, MV et RR reconnaissent la bourse du Conseil de la recherche scientifique et industrielle de l’Inde. MAS reconnaît la bourse de la Commission des subventions universitaires, Inde.

Remarque: Tous les sujets y compris la procédure d&#39;animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel Animaux éthique (AIVE) à l&#39;Institut de Génomique et biologie intégrative, New Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Ce protocole est particulièrement adaptée pour l&#39;administration ciblée de antagomir-29 dans le cerveau et knock-down de miR-29. 1. Stratégie de conception antagomir <ol><li> Récupérer la séquence miARN mature à partir miRBase 11 <a href="http://www.mirbase.org/">(http://www.mirbase.org/).</a> </li><li> Récupérez les séquences de membres de la famille liés miRNA en utilisant le lien &quot;Gene famille&quot; dans le dossier de miRBase <a href="http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009">(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).</a> </li><li> Inverser compléter la séquence: <a href="http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html">http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html</a> fournit un outil pratique pourinverser séquences complément. </li><li> Marquez les positions être modifiés par LNA en utilisant les lignes directrices suivantes: <ol><li> Choisissez résidus thymine placés 3-4 bases en dehors de la modification de LNA, depuis pyrimidines de LNA sont plus stables que les purines 12. </li><li> Choisissez résidus cytosine séparés par 3-4 résidus si l&#39;étape précédente produit moins de cinq modifications. </li><li> Prioriser les cinq modifications à l&#39;extrémité 5 &#39;de la antagomir, puisque cela évite la séquence de semences. </li></ol></li></ol> Préparation Complexe 2. antagomir-neuropeptide Note: Ceci est l&#39;étape la plus critique dans le protocole et il a besoin de normalisation. Pour standardiser le protocole tout oligonucléotide marqué par fluorescence (FLO) peut être utilisé à la place du antagomir 9. Les peptides devraient être de haute pureté (qualité HPLC, 98% de pureté) et .Sequences charge de peptide et antagomir sont donnés dans le tableau 1. <ol><li> Déterminez le nombre de Mode les antagomir à injecter sur la base de la charge molaire de antagomir, sa toxicité et de poids de la souris. Calculer le nombre de moles de peptide à être injecté basée sur rapport de charge molaire de antagomir: peptide. NOTE: Normaliser rapport de charge molaire de antagomir: peptide pour la toxicité et la prestation efficace dans le cerveau de la souris. Utilisez différents rapports de charge molaire de l&#39;oligonucléotide marqué par fluorescence: peptide de normalisation. Nous avons constaté que antagomir-29 et de contrôle étaient à la fois toxique à 4microgram / gramme de poids corporel de souris. Antagomir-29 et de contrôle ont été utilisés au poids corporel 2microgram / gramme, mais cette concentration efficace est susceptible de varier pour chaque microARN. </li><li> Diluer le peptide et antagomir dans des tubes de microcentrifugation séparer les solutions mères avec le D-glucose stérile à 10% de la concentration finale souhaitée, tel que calculé à l&#39;étape 1. </li><li> Maintenir le tube de centrifugeuse avec la solution de peptide sur un vortex à la vitesse de tourbillonnement modéré. </li><li> Ajouter 1/3 de l&#39;unntagomir solution dans le tube de solution de peptide, lentement, goutte à goutte, pendant qu&#39;il est bien mélangé sur un mélangeur vortex. </li><li> Continuer de mélanger des solutions sur le vortex pendant 1 min suivantes, puis laisser le mélange reposer pendant 1 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 4 et 5 deux fois de plus à mélanger la solution restante antagomir avec la solution de peptide dans le même tube de microcentrifugation. L&#39;addition lente est critique pour la formation de complexes mono-dispersée qui sont efficaces pour la transfection. Plus rapide peut conduire à l&#39;agrégation des complexes et leur précipitation. </li><li> Incuber le complexe pendant 30 min à la température ambiante sans agitation au vortex. Pendant ce temps d&#39;incubation, les souris s&#39;acclimater au laboratoire où les injections seront réalisées. </li></ol> 3. L&#39;injection de la veine caudale Complexe antagomir neuropeptide- <ol><li> Pour retenir l&#39;animal, placer la souris dans un dispositif de retenue ou decapicone de la bonne taille. </li><li> Nettoyer la surface de la queue en utilisant un coton-tige pre-imbibée d&#39;eau tiède (environ 40 ° C). Cela permettra de promouvoir la vasodilatation et accroître la visibilité de la veine. </li><li> Approchez la queue avec un petit volume (0,5 à 1,0 cc) seringue à insuline à un angle de 15-20 °. Veillez à ne pas introduire de l&#39;air dans la seringue. Commencez par la partie distale de la queue. Injecter du complexe. Retirer l&#39;aiguille et appliquer un tampon antiseptique directement au site d&#39;injection (environ 5-10 sec) pour arrêter le saignement. </li><li> Remplacer la souris dans une cage ventilée individuellement dans le groupe de 3-5, à l&#39;épi de maïs et du papier de soie que l&#39;enrichissement. Ne gardez pas les souris non-injecté et injectés dans la même cage. </li></ol> 4. comportementales Assays Remarque: Conservez l&#39;intervalle de temps de 3-4 heures entre injection et comportementaux tests pour permettre la récupération après l&#39;injection. Apportez la souris dans une chambre calme. Ne pas déranger les animaux pendant cette période d&#39;acclimatation. <ol><li> Acclimater la souris vers lanouvelle ambiante pendant 30 min, puis commencer les tests comportementaux suivants. Gardez un espace de 10 min entre chaque test de comportement. </li><li> Accrochage postérieur: NOTE: Ce test indique un dysfonctionnement du moteur et des troubles neurologiques. <ol><li> Soulevez doucement la souris en maintenant près de la base de la queue dans le fond clair. </li><li> Vérifiez la position des membres postérieurs pour 10-15 sec. Ébrasements de souris de type sauvage membres postérieurs loin de l&#39;abdomen, alors qu&#39;une souris ataxique tend à rétracter un ou les deux membres postérieurs en direction de l&#39;abdomen de plus de 50% du temps mis en suspension 13. </li><li> Retour de la souris à la cage </li></ol></li><li> Test de Ledge: <ol><li> Soulevez doucement la souris en maintenant la queue et le garder sur le rebord d&#39;une cage. </li><li> Observez la souris spécifiquement à l&#39;angle de la cage. Souris de type sauvage peut passer facilement les coins sans peur et sans perdre l&#39;équilibre. Souris Ataxique perdre son équilibre, gel ou secoue tout en marchant le long de la corniche de la cage et dans les coins. </li></ol></li><li&gt; dosage pied souris d&#39;impression: NOTE: Pour cet essai garder la feuille absorbante prêt, à l&#39;étage d&#39;une piste étroite (~ 70 cm de long, environ 5 cm de large avec ~ 5 cm de hauts murs.) <ol><li> Maintenez la souris doucement une main et appliquer de l&#39;encre sur les membres postérieurs par une brosse. </li><li> Placez la feuille absorbante sur le plancher d&#39;une piste étroite. </li><li> Laisser la souris pour marcher ou courir sur une feuille absorbante en ligne droite dans une piste d&#39;un bout à l&#39;autre. </li><li> Répétez le processus deux fois de plus avec l&#39;aide de la souris feuille absorbante frais. </li><li> Mesurer la distance entre deux étapes consécutives dans le mouvement vers l&#39;avant. Ne pas inclure les premiers et derniers quelques empreintes où l&#39;animal est tout simplement lancer et terminer sa course, respectivement. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici une méthodologie largement accessible pour étudier les effets de la modulation des miARN. À l’heure actuelle, la plupart des tentatives de caractérisation in vivo des fonctions des miARN impliquent la création de souris knock-out ou d’un transgénique qui exprime une éponge à miARN. La plupart des miARN, même ceux spécifiques au type de cellule, sont exprimés dans plus d’un organe. Par exemple, les miARN que l’on pensait initialement spécifiques du système hématopoïétique sont également exp...

Les microARN ont émergé comme de nouvelles cibles thérapeutiques en raison de leur rôle universel dans la régulation de l&#39;expression des gènes et de preuve directe de l&#39;implication dans la maladie. MiRNAs sont activement explorées pour leur potentiel en tant que médicament cible 1,2. En outre, dans l&#39;expression des miARN altérations sont associées à plusieurs maladies 3 et simulation de ces changements par une perturbation artificielle d&#39;expression des miARN peuvent être utilisées pour étudier les voies cellulaires impliquées dans la manifestation de la maladie. Livraison spécifique tissulaire de médicaments ciblant miARN est actuellement un défi majeur pour le développement de médicaments à base de miARN. Antagomirs et imite miARN sont des agents prometteurs pour perturber les niveaux de miARN 4-6. Cependant, les caractéristiques spéciales qui améliorent leur spécificité et l&#39;efficacité doivent être intégrées dans la conception des antagomirs avant qu&#39;ils ne puissent être utilisés pour perturbation in vivo d&#39;expression des miARN. Les microARN sont particulièrement pertinentes<html> comme cibles dans neurodégénérative actuellement incurable et les maladies neuro-développementale. La barrière hémato-encéphalique constitue une restriction à la fourniture de antagomirs dans le cerveau. Injections stéréotaxiques sont largement utilisés dans les modèles de rongeurs pour délivrer des molécules à des endroits précis dans le cerveau 7. Il exige des compétences, d&#39;importants investissements dans l&#39;instrumentation et de l&#39;heure. Injections stéréotaxiques sont envahissantes, implique la chirurgie, provoquer au moins des blessures légères et sont limitées à la livraison locale. L&#39;utilisation de peptides de pénétration de cellules avec une préférence pour les neurones de ciblage peut contrer ces limitations, car ils peuvent être livrés par la voie trans-vasculaire, mais franchir la barrière hémato-encéphalique. Un tel peptide dérivé de la glycoprotéine virus de la rage (RVG), a déjà été utilisé pour délivrer siRNA contre le virus de l&#39;encéphalite japonaise chez des souris 8. Nous avons trouvé que l&#39;utilisation du peptide pour antagomir livraison, miARN peut être efficacement éliminé dans le cerveau de souris 9. ontenu &quot;&gt; Le deuxième défi majeur de miARN knock-down découle de la petite taille des miARN et la présence d&#39;isoformes de séquences étroitement liés. Nous prenons l&#39;exemple de la MMU-miR-29 famille qui se compose de trois isoformes étroitement liés, miR-29a , b et c. antagomirs sont aussi généralement modifié le long de l&#39;épine dorsale d&#39;augmenter leur stabilité et les rendre résistant à l&#39;attaque par des nucléases. Verrouillé Nucleic Acids (LNA) offrent un autre avantage à ce qu&#39;ils améliorent la stabilité thermique et même conduire à cibler la dégradation au cours et au-delà 10 encombrement stérique. Présentation des modifications tout le long du squelette peut être efficace mais coûteux. Nous avons vu précédemment que des modifications au-delà d&#39;un nombre optimal ne peuvent pas améliorer encore l&#39;efficacité. La conception de l&#39;antagomir implique donc la modification de la antagomir optimale. Pour le complexe antagomir non covalente avec le peptide neurotrophique, un hepta chargé de l&#39;extension de nona-arginine est utilisé. D-arginineles résidus sont utilisés car ils confèrent une meilleure stabilité car ils ne sont pas sensibles au clivage par des proteases. Hepta à tronçons de nona-arginine Loi sur les agents de pénétration de cellules comme efficaces, même si elles ne confèrent pas de spécificité de type cellulaire. Par liaison covalente du peptide RVG au lieur nona-arginine, un neurotrope, pénétrant dans les cellules peptide a été généré. Les résidus chargés positivement du peptide d&#39;interagir avec le squelette d&#39;acide nucléique chargé négativement, pour former des complexes. Ces complexes peuvent être utilisés pour transfecter efficacement ADN ou d&#39;ARN dans des cellules en culture et in vivo dans les tissus.

<table><tbody><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resrestraint ou Decapicone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piste étroite ~</td><td></td><td></td><td>70 cm de long, ~5 cm de large avec des murs de ~5 cm de haut.</td></tr><tr><td>Réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides marqués par fluorescence (siGLO)</td><td>GE Healthcare Dharmacon INC</td><td>D0016300120</td><td></td></tr><tr><td>10 % D-glucose</td><td></td><td></td><td></td>stérile</tr><tr><td>Antagomir-29</td><td>Exiqon</td><td>synthèse personnalisée</td> Antagomir-control <td></td></tr><tr><td></td><td>Exiqon</td><td>synthèse</td><td></td>personnalisée</tr><tr><td>Neuropeptide RVG</td><td>G.L.Biochem ( Shanghai) Ltd.</td><td>synthèse sur mesure</td><td>>Neuropeptide de pureté 98 %</td></tr><tr><td>RVM</td><td>G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>synthèse personnalisée</td> <td>>98 % de pureté</td></tr><tr><td>Autre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coton</td><td></td><td></td><td></td></tr> Eau tiède <tr><td>Seringues d’insuline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feuilles absorbantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Encre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptique</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une alternative simple à injection stéréotaxique pour brain knockdown spécifique de miarn

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

Les microARN (miARN) sont des régulateurs clés de l’expression des gènes. Dans le cerveau, les processus vitaux tels que le neurodéveloppement et les fonctions neuronales dépendent de l’expression correcte des microARN. La perturbation des microARN dans le cerveau peut être utilisée pour modéliser les maladies neurodégénératives en modulant la mort cellulaire neuronale. Actuellement, l’injection stéréotaxique est utilisée pour administrer des agents d’inhibition des miARN à un endroit spécifique du cerveau. Ici, nous discutons des stratégies de conception d’antagonmirs contre les miARN avec des modifications nucléotidiques verrouillées (LNA). Décrire ensuite une méthode d’administration d’antagomirs spécifique au cerveau, uniformément dans différentes régions du cerveau. Cette méthode est simple et largement applicable puisqu’elle permet de surmonter la chirurgie, les blessures associées et la limitation de l’administration locale dans les injections stéréotaxiques. Nous avons préparé un complexe de glycoprotéine du virus de la rage (RVG) peptidique neurotrope pénétrant dans les cellules avec de l’antagomir contre le miARN-29 et injecté à travers la veine de la queue, pour l’administrer spécifiquement dans le cerveau. La conception de l’antagomir incorporait des caractéristiques qui permettent un ciblage spécifique du miARN et la formation de complexes non covalents avec le peptide. L’inactivation du miARN dans les cellules neuronales a entraîné la mort des cellules apoptotiques et des défauts de comportement associés. Ainsi, la méthode peut être utilisée pour des modèles aigus de neuro-dégénérescence par perturbation des miARN.

En utilisant la procédure présentée ici, des complexes d&#39;oligonucléotide 50microgram marqué par fluorescence (FLO) et ~ 850microgram RVG peptide de 1:15 rapport de charge molaire (FLO: peptide) ont été préparés et injectés qu&#39;une seule fois par veine de la queue. Complexe de non-neurotrope virus de la rage Matrix (RVM) peptide et FLO a été utilisé comme un contrôle de livraison. Le jour suivant, les souris cerveau et le foie ont été isolés et des suspensions cellulaires simples ont été préparées. Les cellules on...

Les microARN jouent un rôle crucial dans le cerveau et sont des cibles potentielles pour la modélisation de la neurodégénérescence. Cependant, il est difficile de perturber les niveaux de miARN en raison de la courte longueur des miARN et de l’inaccessibilité du tissu cérébral. Cette vidéo présente une méthode de conception d’antagomir et d’administration spécifique au cerveau à l’aide d’un neuropeptide chez la souris.

Une alternative simple à injection stéréotaxique pour Brain Knockdown spécifique de miARN

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Ici, nous démontrons l'utilisation d'un peptide pénétrant les cellules associé à un oligonucléotide antisens modifié afin d'inhiber spécifiquement les microARN dans le cerveau de souris. Cette inhibition a été obtenue en concevant un antigo ciblant le 29 mai. Dans cette étude, nous avons utilisé des antigos mâles pour cibler les microARN comportant des modifications en acide lock nucléique.Des modifications LNA ont été incorporées à cinq positions différentes. Cette incorporation de modifications LNA augmente l'affinité de liaison vis-à-vis du microARN. Elle confère également une résistance au noyau et améliore ainsi l'efficacité de ciblage du microARN.Des complexes de l'ANTIGO MAR avec le peptide ont été préparés in vitro et injectés aux souris par la veine de la queue. L'extinction du microARN a entraîné des modifications comportementales suggérant l'implication de ce microARN dans l'ataxie ; trois injections consécutives ont suffi pour induire un changement notable de la démarche. Après le traitement, le tissu cérébral a été collecté et l'extinction du microARN a été confirmée. Les CPP, ou peptides pénétrants cellulaires, sont récemment apparus comme des vecteurs attrayants pour

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Procédé par lequel l'expression du gène dans le tube neural peut être régulée à la baisse dans une cellule spécifique d'un type, est décrit de façon traçable. Nous montrons...

En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l&#39;évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

Source : Ullah, I., et.al. Dispositif de positionnement pour le placement de souris lors de l’administration intranasale d’ARNi au système nerveux central. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre une technique d’administration intranasale précise pour délivrer des complexes peptide-siRNA ciblant les neurones au cerveau de la souris à l’aide d’un dispositif de positionnement spécialisé. Les souris anesthésiées sont fixées en position tête baissée et avancée pour optimiser l’inhalation de siRNA...

Administration intranasale de siRNA dans le cerveau de la souris à l’aide d’un dispositif de positionnement

Les microARN ont des rôles importants dans la structure et la fonction du cerveau. Nous décrivons ici une méthode pour appliquer miRNA hippocampe surexpression par injection stéréotaxique d'un lentivirus miRNA exprimant ingénierie. Cette approche peut servir comme un moyen relativement rapide pour évaluer...

Injection stéréotaxique de micro-ARN exprimant lentivirus à la souris hippocampe CA1 Région et l&#39;évaluation du résultat comportemental

Le système / cas9 CRISPR offre la possibilité de faire éditer génome ciblé accessible et abordable pour la communauté scientifique. Ce protocole vise à démontrer comment créer des virus qui Knockout un gène d'intérêt en utilisant le système / cas9 CRISPR, puis les injecter stéréotaxique dans le cerveau de souris adulte.

Design et emballage, et de livraison de titre élevé CRISPR Retro et lentivirus via stéréotaxique Injection

Nous décrivons ici la livraison des micro-ARN, à l’aide d’un sérotype de virus adeno-associé recombinant 9 dans un modèle murin d’une maladie neuromusculaire. Une seule administration périphérique chez les souris a entraîné surexpression de miRNA soutenue dans les muscles et les neurones moteurs, fournissant l’occasion de l’étude miRNA fonction et thérapeutiques potentiels in vivo.

Délivrance systémique des micro-ARN, à l’aide de Recombinant Adeno-associated Virus sérotype 9 pour traiter des maladies neuromusculaires chez les rongeurs

Ce protocole prévoit un flux de travail sur la façon de combiner artificielle induite sur les micro-ARN interférence d’ARN avec optogenetics pour stimuler spécifiquement présynaptiques boutons avec une expression réduite de sélectives ou des gènes au sein des circuits de neurones intacts.

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

L’inhibition spécifique des tissus micro-ARN est une technologie qui est sous-développé dans le domaine des micro-ARN. Ici, nous décrivons un protocole pour empêcher avec succès la famille miR-181 micro-ARN dans des cellules myoblastiques du cœur. Technologie Nanovector est utilisée pour livrer un microARN éponge illustrant l’importante en vivo cardio spécifique miR-181 famille inhibition.

In Vivo Nanovector livraison d’une coeur spécifiques microARN-éponge

Ici, nous présentons un protocole utilisant un dispositif de positionnement de souris qui permet le placement approprié des souris pour l'administration intranasale d'une formulation de peptide-siRNA de cerveau-ciblage permettant le silençage efficace de gène dans le système nerveux central.

Un dispositif de positionnement pour le placement des souris pendant la livraison de siRNA intranasal au système nerveux central

Décrit ici est un protocole pour caractériser des modules des miRNAs biologiquement synergiques et de leur assemblage en transgènes courts, qui permet la surexpression simultanée pour des applications de thérapie génique.

Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.

Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.

Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN

Découvrez une méthode d'inhibition des microARN cérébraux chez la souris utilisant un peptide neurotrope et un antagomir modifié par acide nucléique verrouillé. Cette technique évite l'injection stéréotaxique et facilite l'étude des maladies neurodégénératives.

Une alternative simple à injection stéréotaxique pour Brain Knockdown spécifique de miARN

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