Injection intracérébroventriculaire de Peptides amyloïde-ß chez les souris normales à Provoquer Pleinement Déficits cognitifs de type Alzheimer

L’objectif global de cette intervention chirurgicale est de réaliser l’injection intra-ventriculaire de bêta-amyloïde sans instruments stéréotaxiques et d’induire de manière aiguë des anomalies de comportement de type Alzheimer chez les souris normales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la découverte de médicaments pour la maladie d’Alzheimer. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons effectuer l’injection directe de A bêta dans la région intra-rébroventriculaire des souris sans l’aide d’instruments stéréotaxiques, et elle nous permet d’imiter les anomalies de comportement de type Alzheimer chez les souris sans attendre le processus de vieillissement.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement ou au diagnostic de la maladie d’Alzheimer, car elle peut être utilisée pour étudier la pathologie en aval de la bêta-amyloïde et pour dépister des candidats médicaments. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car il peut être difficile de trouver l’emplacement précis du bregma sur le crâne de l’animal. Pour commencer cette procédure, faites un A-bêta millimolaire avec du DMSO.

Ensuite, diluez-le dix fois dans du PBS. Ensuite, préparez une solution PBS contenant 10 % de DMSO comme véhicule pour l’injection d’ICV. Après cela, enveloppez la microseringue avec une aiguille en acier inoxydable de calibre 26 à l’aide de bandes Parafilm afin d’ajuster la longueur de l’aiguille pour une injection contrôlée en profondeur.

Enroulez densément la seringue plusieurs fois afin que le Parafilm ne soit pas comprimé lors de l’insertion de l’aiguille et que la longueur de l’aiguille reste constante. Ensuite, coupez les couches de bandes Parafilm pour ajuster la longueur de l’aiguille à 3,8 millimètres entre la pointe de l’aiguille et le Parafilm. Ensuite, lavez la seringue deux fois avec de l’éthanol à 70 %.

Par la suite, rincez la seringue à l’eau distillée. Séchez-la complètement dans une hotte pendant au moins 30 minutes et laissez la seringue propre sous une lumière UV pendant encore 20 minutes avant l’injection. Dans cette étape, placez une souris anesthésiée de sept semaines sur un tapis chaud.

Ensuite, appliquez des gouttes ou une pommade PBS stérile sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse cornéenne pendant la procédure. Ensuite, confirmez une anesthésie adéquate en évaluant le réflexe de retrait de l’extenseur du pincement de l’orteil. Ensuite, préparez deux miroirs avec plusieurs lignes verticales dessinées sur les surfaces pour fournir des références pour l’injection perpendiculaire de la seringue.

Placez un miroir juste à côté du corps de la souris et l’autre devant la tête. Gardez M1 parallèle à la ligne médiane imaginaire entre les deux yeux de la souris et disposez M2 perpendiculairement à M1, de sorte que les deux plans forment un angle de 90 degrés. Ensuite, vaporisez de l’éthanol à 70 % sur le front de la souris et frottez-le avec des cotons-tiges secs.

Pour localiser le bregma, placez le pouce et l’index directement au-dessus des yeux et appuyez légèrement sur le front jusqu’à ce que les deux yeux fassent saillie. Dans le même temps, faites glisser la peau du front vers l’arrière afin de minimiser le mouvement du crâne en dessous. Localisez le site d’injection à l’aide d’un ruban adhésif à 2,4 millimètres de profondeur sous le crâne.

Remplissez la seringue avec 10 microlitres de solution A-bêta ou de véhicule. Placez la seringue de manière à ce qu’elle soit perpendiculaire au plan du site d’injection. Ensuite, alignez les images réfléchies de la seringue dans les deux miroirs avec les lignes dessinées sur les miroirs.

Commencez à insérer l’aiguille jusqu’à ce que l’emballage Parafilm touche la peau. Tenez la seringue d’une main et injectez cinq microlitres de la solution A-bêta ou du véhicule de l’autre main, lentement pendant cinq secondes sans faire de pause, et assurez-vous que la seringue reste perpendiculaire tout au long de la cuisson. Une fois l’injection terminée, attendez trois à cinq secondes avant de retirer la seringue.

Placez le pouce et l’index sur la tête et maintenez-le enfoncé pour éviter que le crâne ne fasse des mouvements inutiles. Retirez ensuite la seringue sans l’incliner. Par la suite, placez la souris sur un tapis chaud pour la récupération.

Pour confirmer si l’A-bêta a été injecté dans la région cible de l’ICV, vérifiez la trace de l’insertion de l’aiguille dans le tissu cérébral pour voir si elle a atteint l’un des ventricules. Si l’injection n’a pas réussi, excluez les données de ce sujet de l’analyse des résultats expérimentaux. Dans cette expérience, le peptide A-bêta complet de 42 acides aminés a été utilisé pour produire un mélange de monomères A bêta, d’oligomères et de fibrilles.

Grâce à l’étape de monomérisation induite par HFIP, des monomères relativement homogènes ont été obtenus. Après l’incubation de sept jours, diverses tailles d’agrégats A-bêta ont été développées, dans lesquelles les trimères et les tétramères étaient les espèces dominantes parmi les formes oligomères d’A-bêta. Dans cette étude, la mémoire de travail spatiale a été évaluée chez les souris injectées A-bêta dans le test Y-maze, dans lequel la séquence des choix de bras et le nombre total d’entrées de bras ont été enregistrés pendant que chaque souris était autorisée à explorer librement le labyrinthe.

Le groupe de souris injectées A-bêta a montré des taux d’alternance significativement plus faibles, indiquant le développement de déficits cognitifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes, y compris les procédures d’anesthésie, si elle est effectuée correctement. Lors de ces procédures, il est important de se rappeler de rendre l’aiguille perpendiculaire au plan d’injection.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments pour la maladie d’Alzheimer pour explorer le criblage in vivo de candidats médicaments dans ces modèles de rongeurs d’Alzheimer facilement accessibles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser une injection intra-ventriculaire sans instruments stéréotaxiques.