Name: Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez l'imagerie intravitale des neutrophiles et monocytes dans les veines mésentériques de souris anesthésiées. Cette technique permet d'étudier la migration des leucocytes et leurs interactions avec l'endothélium vasculaire en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par l’EMBO (à Y.E.), la Fondation Machaon (à Y.E.) et le FNS (à B.A.I.). Nous remercions la plateforme de bioimagerie pour la disponibilité du microscope Nikon A1r et l’assistance technique. Nous remercions Mme Clarissa Bartley pour la correction en anglais.

Nota: Les procédures animaux ont été effectuées en conformité avec le comité d&#39;éthique institutionnel de protection des animaux à Genève, la Suisse et l&#39;Office vétérinaire cantonal. Numéro d&#39;autorisation GE / 63/14. 1. Préparation d&#39;une seule cellule Suspension de la moelle osseuse <ol><li> Sacrifice des souris (8 à 12 semaines de old) par dislocation cervicale. Stériliser pattes de derrière avec 70% d&#39;éthanol. Enlever la peau des pattes postérieures. </li><li> Disséquer les fémurs de souris et les tibias et enlever les tissus des jambes avec un scalpel. Rincer les jambes avec 90% d&#39;éthanol et le placer dans une boîte de culture rempli de PBS. </li><li> Sous le capot de la culture, le tissu propre à partir de fémurs et tibias avec un scalpel et séparé à l&#39;articulation du genou. Couper chaque extrémité de l&#39;os. </li><li> Rincer la moelle osseuse de l&#39;os à l&#39;aide d&#39;une aiguille de 23G et une seringue de 1 ml avec du milieu rempli de préparation (rouge de phénol libre de DMEM / F12, le sérum de rat à 1%), en une vis 50 ml tube. Perturber agrégats de cellules par passage à travers la délicatesse ne 23Gedle et une seringue de 1 ml. Amener le volume total à 25 ml avec du milieu de préparation. </li><li> Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C. Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1 ml de globules rouges tampon de lyse RBLC (8,3 g NH 4 Cl, 1 g de NaHCO 3, 1 ml d&#39;EDTA (100 mM), complète à 1 L avec de l&#39;eau distillée, filtre de 0,22 um) dans un 15 ml vis tube. Incuber 30 secondes sur la glace. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de préparation et centrifuger à 250 x g, 5 min, 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de milieu de préparation. </li></ol> 2. neutrophiles enrichissement par sélection négative <ol><li> Ajouter 150 pi de souris enrichissement de neutrophiles cocktail (isolement des cellules de kit de plate-forme tels que EasySep). Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Ajouter 10 ml de phénol DMEM sans rouge. Inversez fois centrifugeuse 250 xg, 3 min, 4 ° C. </li><li> Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1,75 ml de milieu de préparation dans 5 ml polystyrène tubes ronds de fond. Ajouter 250 ul BiotSélection en cocktail. Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Vortex les particules magnétiques (du kit de plate-forme d&#39;isolement cellulaire) pendant 30 secondes pour remettre en suspension des particules. Ajouter 500 pi de particules magnétiques à la suspension cellulaire. Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Placer le tube dans l&#39;aimant. Attendre 3 min. </li><li> Inversez l&#39;aimant sur un nouveau 5 ml polystyrène tubes ronds en bas pour recueillir les cellules non marquées souhaitées. Ne pas prendre la dernière goutte suspendue dans le tube. Les cellules non désirées restent dans le tube à l&#39;intérieur de l&#39;aimant. Jeter ce tube en déchets biologiques dangereux. </li><li> Placez le nouveau tube dans l&#39;aimant. Attendre 3 min. </li><li> Inverser l&#39;aimant sur un nouveau tube de 15 ml à vis pour collecter les cellules non marquées souhaitées. Ne pas prendre la dernière goutte suspendue dans le tube. </li><li> Complète le volume à 5 ml avec du DMEM sans rouge de phénol. </li></ol> 3. L&#39;étiquetage des neutrophiles <ol><li> Ajouter 0,5 pi d&#39;un colorant orange, tels que téléphone mobile Tracker Orange (concentration de travail1 pm, SACSM - chlorométhyl-rodol-acétate, stock 10 mM dans le DMSO). Incuber 2 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 2,5 ml de milieu de préparation. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Surnageant défausse. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de préparation, dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Prendre une aliquote de compter avec hématocytomètre. </li><li> Incuber 5 min à 37 ° C. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1 ml de PBS. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C à laver. </li><li> Surnageant défausse. Resuspendre le culot que 10x10 6 cellules par 100 pi de PBS. Garder sur la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;injection intraveineuse. REMARQUE: les cellules doivent être iv injecté le plus rapidement possible. 6-12x10 6 neutrophiles / souris sont habituellement obtenue. </li></ol> 4. Préparation de la souris pour Microscopie intravitale REMARQUE:.. Etape 4.1) et 4.2) doit être effectué au début de l&#39;expérience, afin d&#39;éviter le temps d&#39;attente prolongée des neutrophiles marqués sur ice. <ol><li> Peser le CR1 GFP souris CX 3 (8-12 semaine ancienne). </li><li> Préparer 800 ul d&#39;anesthésiques kétamine (60 mg / kg, xylazine 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg dans du PBS). </li><li> Anesthésier la souris. Ip d&#39;injection avec 200 pl / 20 g de souris. Anesthésie de contrôle par l&#39;orteil pincement et en cochant la fréquence respiratoire. </li><li> Injecter neutrophiles (10x10 6 cellules dans 100 pi de PBS) par voie intraveineuse en utilisant les veines de la queue latérales ou le sinus rétro-orbitaire, à la convenance de l&#39;expérimentateur. </li><li> Placez la souris sur le coussin chauffant et protéger les yeux avec du gel oculaire. </li><li> Une lamelle de verre (diamètre 35 mm) est placé dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm, qui a un trou 30 mm de diamètre. Utiliser l&#39;huile est de maintenir la boîte de culture de tissu en contact avec la lamelle. </li><li> Inciser la peau abdominale avec des ciseaux pour exposer le péritoine. Inciser péritoine avec des ciseaux pour exposer intestin. </li><li> Ajouter 200 ul de PBS (pré-chauffée à 37 ° C) dans la peritoneal cavité. Prenez la souris dans votre main et tournez face vers le bas, de sorte que l&#39;intestin sort de la cavité péritonéale avec une légère pression. Placer la souris dans la boîte de culture tissulaire. </li><li> Deroll doucement l&#39;intestin avec des cotons-tiges stériles sur la lamelle afin d&#39;exposer les vaisseaux mésentériques. </li><li> Couper des mouchoirs en papier dans les bandes et les mouiller avec 37 ° C chauffé PBS. Immobiliser l&#39;intestin avec les morceaux de tissus en papier pour diminuer les mouvements résultant de péristaltisme. </li><li> Mettre le plat de culture de tissus et de la souris à l&#39;intérieur de la chambre thermostatée 37 ° C sur la scène du microscope inversé plateau sur mesure. Présentez une seringue contenant des anesthésiques sc dans la patte arrière. NOTE: En outre, la souris peut recevoir de l&#39;oxygène (0,5 L / min) avec un masque. </li><li> La souris de contrôle pour l&#39;anesthésie par orteil pincement et la vérification de la fréquence respiratoire toutes les 30 min. Si nécessaire, fournir un coup de pouce d&#39;anesthésiques (20 pi) de bien entretenir l&#39;anesthésie. NE PASE: Le séchage de la vascularisation doit être évitée. Par conséquent, son humidité est maintenue en mouillant régulièrement les mouchoirs en papier utilisés pour immobiliser l&#39;intestin à 37 ° C et réchauffé PBS. </li></ol> 5. Mesure des neutrophiles et des monocytes Comportement dans les navires enflammées in vivo en utilisant Microscopie intravitale <ol><li> Set lasers à 488- 561- et à la puissance la plus faible nécessaire pour éviter la phototoxicité induite par laser. Dans nos expériences, il est inférieur à 0,5%. Intensité de la GFP dans les monocytes et colorant orange dans les neutrophiles est si brillante que d&#39;habitude 0,3% est suffisant. NOTE: Cela représente une puissance laser de 0,15 à 0,25 mW avec notre système. </li><li> Acquérir des images de 512 x 512 pixels (soit 635 um) à 2.2 sec avec un sténopé ouverte en utilisant l&#39;objectif sèche du microscope inversé 20X. Utilisez un z-profondeur comprise entre 10 à 20 um, qui assure un signal suffisamment avec les puissances laser faible. REMARQUE: Nous effectuons habituellement des expériences avec un z-profondeur comprise entre 12 à 1656; m. Dans le cas des chiffres et des films présentés, la profondeur z-est de 20 um. Le contraste de phase permet l&#39;identification des parois endothéliales et l&#39;imagerie est effectuée sur les veines mésentériques. Comme les cellules de patrouille se déplacent assez lentement à une vitesse de 5 à 10 um / min 6, l&#39;enregistrement d&#39;un champ d&#39;intérêt toutes les 20 secondes est satisfaisant. Avec les réglages décrits, la platine motorisée permet l&#39;enregistrement de jusqu&#39;à 7 domaines d&#39;intérêt dans le même temps. </li><li> Placez la souris et les vaisseaux mésentériques dans la chambre de thermostat du microscope sont de leur permettre de se remettre de la préparation pendant 30 minutes avant l&#39;acquisition du premier film. Pendant ce temps, choisir plusieurs domaines d&#39;intérêt. Focus sur la surface luminale du vaisseau la plus proche de l&#39;objectif. Si nécessaire, profiter de la légère auto-fluorescence de l&#39;endothélium pour définir le focus. REMARQUE: Chirurgie lors de la préparation de la souris souligne légèrement l&#39;endothélium. Par conséquent, le produit laminé de neutrophiles et/ ou des monocytes peuvent être observés dans la première préparation suivante de 15 min de la souris. </li><li> Enregistrer un premier film pendant 30 min dans des conditions d&#39;état stable, une image toutes les 20 secondes. REMARQUE: Le logiciel acquiert chaque champ d&#39;intérêt en 2.2 sec et la platine motorisée se déplace automatiquement d&#39;un champ à l&#39;autre. Elle remonte à la première position dans les 20 secondes pendant les 30 min de l&#39;enregistrement du film. </li><li> Pour lancer inflammation des vaisseaux sanguins, ajouter une goutte de 20 pi de PBS contenant 100 ug de TLR2 / TLR1 agoniste PAM3CSK4 12 directement sur ​​les vaisseaux imagées. </li><li> Contrôler la mise au point pour chaque domaine d&#39;intérêt. NOTE: Dans le cadre de l&#39;acquisition, il ya toujours de légers changements de focalisation sur l&#39;axe z. Malgré le 10-20 um z profondeur, ce qui peut entraîner une diminution de l&#39;intensité de fluorescence. Par conséquent, recentrer manuellement chaque champ d&#39;intérêt à la fin de chaque film, si nécessaire. Enregistrez des vidéos pendant 30 min-périodes et jusqu&#39;à 3 h pourtal après l&#39;initiation de l&#39;inflammation. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, les souris anesthésiée sacrifice par dislocation cervicale. </li></ol> 6. génération de fichiers vidéo et de suivi des leucocytes REMARQUE: Le logiciel d&#39;acquisition Nikon génère .nd2 fichiers, mais la procédure suivante serait similaire avec d&#39;autres logiciels et les marques. <ol><li> Exportation de fichiers que la série TIFF. </li><li> Accédez au logiciel ImageJ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Importez la série de tiff. Chaque canal dans un fichier différent. </li><li> Appliquer un filtre médian avec un rayon de 2.0 pixel pour les canaux vert et rouge pour réduire le bruit de fond (Processus&gt; Filtres&gt; médians ...). </li><li> Convertir des fichiers en binaire (Processus&gt; Binary&gt; Faire binaire). Activer le logiciel pour calculer le seuil pour chaque image. </li><li> Fusionner canaux dans un seul séries d&#39;images (Image&gt; Couleur&gt; Fusionner les couches ...). Sélectionnez les monocytes dans le degrécanal n, les neutrophiles dans le canal rouge et la lumière transmise dans le canal gris. </li><li> Convertir images empilées en couleurs RVB (Image&gt; Couleur&gt; pile pour RGB). </li><li> Enregistrer le fichier .avi que </li><li> Les données sont importées et compilées dans un logiciel Imaris (Bitplane). Mouvements de monocytes et les neutrophiles sont ensuite suivis à l&#39;aide de l&#39;Assistant Suivi Spot. </li></ol>

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<li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109(2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les méthodes décrites dans ce manuscrit fournissent une approche cohérente pour étudier efficacement monocytes et le comportement des neutrophiles dans les veines mésentériques dans des conditions stables et inflammatoires. L&#39;étape cruciale de la préparation est l&#39;immobilisation de l&#39;intestin avec des tissus PBS-mouillées. Si effectué correctement, les vaisseaux mésentériques sont joliment exposés sur la lamelle pour l&#39;acquisition d&#39;image. Cela permet la sélection de plus...

<html> Neutrophiles et des monocytes sont des cellules du système immunitaire inné qui circulent en continu dans le sang. Lors de blessure ou d&#39;infection, les signaux inflammatoires induisent diapédèse leucocytaire dans les tissus endommagés et infectés, en entamant le présent mémoire une réponse immunitaire cellulaire 3.1. La rapidité de la mobilisation des leucocytes détermine le résultat positif des réponses immunitaires. Ces processus complexes reposent sur ​​des molécules spécifiques (par exemple, sélectines, des chimiokines de l&#39;endothélium lié) présents sur l&#39;endothélium enflammé qui aident à l&#39;établissement de contacts entre les adhésifs leucocytes circulants et l&#39;endothélium 1-3 .Pour obtenir un aperçu sur les molécules impliquées dans le leucocyte recrutement cascade, il est important de visualiser la cinétique de recrutement de cellules et de suivre le comportement de chaque cellule / population. Une méthode efficace consiste à microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d&#39;intérêt. contenu &quot;&gt; À ce jour, plusieurs approches en utilisant la microscopie intravitale ont été développés à l&#39;image du système vasculaire 4,5. Par exemple, l&#39;imagerie du derme de l&#39;oreille vasculaire ou des veines mésentériques par microscopie confocale intravitale a été utilisé pour identifier le comportement de patrouille de Ly6C murin faibles monocytes et humaine CD14 dim CD16 + monocytes sur la face luminale de vaisseaux sanguins dans des conditions d&#39;état d&#39;équilibre de 6-8. Le modèle de système vasculaire crémaster de la souris est souvent utilisé pour surveiller le comportement des neutrophiles ou Ly6C inflammatoire élevés monocytes dans des conditions inflammatoires ou ischémiques chez les souris transgéniques. Dans ce cas, crémaster est stimulée par injection de intrascrotale IL1β, CCL2, TNFß ou fMLP. Après 2-4 heures, les tissus sont ensuite chirurgicalement extériorisés et analysés par microscopie confocale intravitale 9-11. Le protocole suivant décrit un procédé pour surveiller les monocytes et neutrophiles dans le même temps à toutefluorescence inversé de microscope confocal. En outre, notre méthode en détail comment l&#39;image du même navire avant (d&#39;état d&#39;équilibre) et après l&#39;inflammation et comment suivre la cinétique de recrutement des leucocytes. A cet effet, nous utilisons le CX 3 CR1 souris GFP / poids, dont les monocytes expriment eGFP, iv injecté avec une orange neutrophiles murins marqués par un colorant. En utilisant un microscope confocal inversé, il est possible (1) pour suivre et analyser les patrouilles Ly6C faibles monocytes dans des conditions stables et (2) de suivre le recrutement de deux monocytes et neutrophiles dans le même navire après une inflammation locale. Ici, nous créons les conditions inflammatoires en utilisant l&#39;agoniste TLR2 / TLR1 PAM3CSK4 12. En outre, comme l&#39;imagerie peut aider à déterminer le rôle de molécules spécifiques d&#39;intérêt dans les différentes étapes de la cascade de recrutement des leucocytes si elle est effectuée sur des souris knock-out spécifiques ou en présence d&#39;anticorps bloquants 6,9,13.

<table><tbody><tr><td>Tubes à fond rond en polystyrène de 5 ml&nbsp ;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&nbsp ; &nbsp ; DT :4mm&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT :1mm&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Aimant</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Souris Kit d’enrichissement des neutrophiles</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion Type A</td><td>Nikon</td><td></td><td>n’importe quelle huile visqueuse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Life Box Système de contrôle de la température</td><td>Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Nikon A1R</td> Microscope inversé <td>Nikon</td><td>A1R</td><td>, platine x/y/z motorisée, logiciel NIS elements PBS</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>sans rouge de phénol DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>tout milieu sans rouge de phénol convient</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>reconstitue dans le</td></tr><tr><td>sérum de rat</td> PBS <td>Technologies de cellules</td><td></td> souches <td>incluses dans EasySep Kit d’enrichissement des neutrophiles de souris Boîte de</td></tr><tr><td>culture tissulaire 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Réponse immunitaire efficace dépend de mobilisation rapide des leucocytes du sang vers le site de l&#39;infection ou de blessure. Enquêter la migration des leucocytes in vivo est cruciale pour la compréhension de la base moléculaire de la migration des leucocytes transendotheliale et l&#39;interaction avec l&#39;endothélium vasculaire. Une approche puissante implique microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d&#39;intérêt. Ici, nous présentons un protocole pour les monocytes et les neutrophiles d&#39;imagerie dans la gfp CR1 / poids iv de la souris injectée avec CX 3 oranges neutrophiles marqués par un colorant avec un microscope confocal inversé. Films time-lapse recueillies auprès de 30 minutes à plusieurs heures d&#39;imagerie permettre à l&#39;analyse du comportement des leucocytes dans les veines mésentériques sous les deux conditions stables et inflammatoires. Nous décrivons également les étapes pour induire localement inflammation des vaisseaux sanguins avec TLR2 / TLR1 agoniste Pam3SK4 et surveiller la subsequent recrutement des neutrophiles et des monocytes. La technique présentée peut également être utilisé pour contrôler d&#39;autres populations de leucocytes et étudier molécules impliquées dans le recrutement des leucocytes ou la traite à l&#39;aide d&#39;autres stimuli ou des souris transgéniques.

Le manuscrit décrit un protocole optimisé pour contrôler facilement le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques de souris anesthésiées en temps réel. L&#39;utilisation d&#39;une chambre de 37 ° C-thermostatée est impératif de maintenir la température de la souris et également en raison du mouvement des leucocytes dépendant de la température. Préparation de la souris est affiché sur la figure 1. La figure 2 montre l&#39;ensemble de la zone vu au micros...

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Le but global de cette procédure de microscopie confocale intravitale est de surveiller la dynamique des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques chez la souris, en conditions d'équilibre et inflammatoires. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que quelles sont les bases moléculaires de la migration des leucocytes, de leur recrutement et de leur interaction avec l'endothélium vasculaire. Les principaux avantages de cette technique sont la possibilité de suivre et d'analyser la surveillance exercée par les monocytes LY6C bas en conditions d'équilibre, ainsi que de suivre le recrutement des monocytes et des neutrophiles vers le même vaisseau après une stimulation inflammatoire locale. La démonstration de la procédure sera effectuée par Stefan Ler, technicien du laboratoire. Pour préparer une suspension monocellulaire à partir de moelle osseuse, stériliser les membres postérieurs d'une souris âgée de huit à douze semaines à l'aide d'éthanol à 70 %, puis utiliser un scalpel pour prélever les fémurs et les tibias. Une fois tous les os désinsérés,Rincez les pattes avec de l'éthanol à 90 % et transférez les os dans une boîte de culture remplie de PBS. Ensuite, dans une hotte de culture, utilisez un scalpel pour nettoyer les fémurs et les tibias et les séparer au niveau de l'articulation du genou. Puis, coupez les extrémités des os et utilisez une seringue de un millilitre chargée de milieu de préparation, équipée d'une aiguille de 23 gauge, pour rincer la moelle de chaque os dans un tube conique de 50 millilitres.Disperser les agrégats cellulaires en les faisant repasser par l'extrémité de l'aiguille, puis porter le volume total de la suspension cellulaire à 25 millilitres avec du milieu frais, centrifuger les cellules, puis les resuspendre. Suspendre le tissu dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges et transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres placé sur de la glace. Après 30 secondes, arrêter la lyse en ajoutant 10 millilitres de milieu de préparation.Faire centrifuger à nouveau les cellules et resuspendre le culot dans deux millilitres supplémentaires de milieu de préparation afin d'enrichir les neutrophiles par sélection négative. Incuber d'abord les cellules de la moelle osseuse avec 150 microlitres de cocktail d'enrichissement des neutrophiles murins sur de la glace pendant 10 minutes.À la fin de l'incubation, ajouter 10 millilitres de DMEM sans rouge de phénol. Retourner le tube une fois et centrifuger les cellules. Resuspendre le culot dans 1,75 millilitre de milieu de préparation et transférer les cellules dans un tube rond en polystyrène de 5 millilitres.Ensuite, incuber les cellules avec 250 microlitres de cocktail de sélection à la biotine sur de la glace pendant 10 minutes. À la fin de l'incubation, nous mettons en suspension les particules magnétiques du kit d'isolement cellulaire par vortexage pendant 30 secondes. Puis, incuber les cellules avec 500 microlitres des particules sur de la glace pendant 10 minutes.À la fin de l'incubation, placer le tube dans l'aimant. Après trois minutes, retourner l'aimant dans un nouveau tube rond en polystyrène de cinq millilitres. Pour recueillir les cellules non marquées, placer le tube contenant les cellules non marquées dans l'aimant.Après trois minutes, retourner l'aimant dans un tube conique de 15 millilitres afin de transférer les cellules non marquées, en laissant la dernière goutte dans le tube. Ensuite, ajuster le volume à cinq millilitres avec du DM frais sans rouge de phénol. Ajouter ensuite 0,5 microlitre du colorant cytoplasmique approprié, tel que le traceur cellulaire orange utilisé ici, aux cellules à 37 degrés Celsius.Après deux minutes à 37 degrés Celsius, laver les cellules avec 2,5 millilitres de milieu de préparation et resuspendre le culot dans un millilitre de milieu de préparation dans un tube de 1,5 millilitre, compter les cellules, puis les incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir centrifugé les cellules, nous resuspendons le culot dans un millilitre de PBS, suivi d'une autre centrifugation pendant que les cellules tournent. Utiliser de l'huile pour fixer un coverslip en verre de 35 millimètres à une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres de diamètre comportant un trou de 30 millimètres de diamètre.Ensuite, resuspendre le culot à une concentration de 1 × 10⁷ cellules par 100 microlitres de PBS et placer les cellules sur de la glace dès que possible après marquage. Injecter intraveineusement les cellules de neutrophiles marquées dans un souris CX3CR1 GFP anesthésiée âgée de huit à douze semaines, puis placer la souris sur un tapis chauffant. Appliquer immédiatement une pommade sur les yeux de l'animal et utiliser des ciseaux pour ouvrir la peau abdominale, exposer le péritoine, puis inciser le péritoine avec les ciseaux afin d'exposer l'intestin.Ensuite, administrer 200 microlitres de PBS à 37 degrés Celsius dans la cavité péritonéale et retourner la souris face contre le plat de culture pour extraire les intestins de la cavité péritonéale à l’aide d’une pression douce. Puis, à l’aide de cotons stériles, enrouler soigneusement les intestins sur la lamelle afin d’exposer les vaisseaux mésentériques et immobiliser le tissu avec des morceaux de papier absorbant humidifiés au PBS à 37 degrés Celsius afin de réduire les mouvements dus à la péristaltisme. Il est très important de prendre le temps nécessaire pour immobiliser soigneusement l’intestin à l’aide de morceaux de papier absorbant lestés au PBS.Sinon, les mouvements résultant de la péristaltique pendant l'acquisition des images compromettront l'expérience. Ensuite, transférez la boîte de culture tissulaire et la souris dans une chambre thermostatée à 37 degrés Celsius placée sur une platine spécialement conçue pour un microscope inversé, puis administrez une seconde dose d'anesthésique par voie intramusculaire dans la patte arrière. Réglez maintenant les lasers appropriés à la puissance la plus faible nécessaire pour éviter la phototoxicité induite par le laser et laissez la souris se reposer pendant 30 minutes.Lorsque l'animal s'est rétabli, enregistrez le premier film pendant 30 minutes dans des conditions d'état stable. Ensuite, pour induire l'inflammation des vaisseaux sanguins, déposez une goutte de 20 microlitres de PBS contenant 100 microgrammes de l'agoniste PAM trois CSK quatre des TLR deux et TLR un directement sur les vaisseaux observés. Enfin, acquérez un second film en veillant à contrôler la mise au point après l'ajout de l'agoniste, car l'inflammation induit des modifications de la largeur de l'endothélium, altérant ainsi la mise au point sur l'axe Z. Les différentes étapes du traitement d'image pour le premier point temporel d'un film acquis dans des conditions d'état stable, telles que vient de l'être démontré, sont montrées dans ce film.La surveillance des monocytes LASIK cilo verts dans des conditions d'état stable peut être visualisée avec les neutrophiles rouges observés en circulation dans le flux sanguin. Ici, le même champ d'intérêt est montré 90 minutes après l'ajout de PAM trois CSK quatre, entraînant le recrutement massif de neutrophiles et de monocytes vers la paroi endothéliale, que les monocytes explorent méticuleusement à l'aide d'un logiciel approprié, permettant de suivre précisément les trajectoires des monocytes et des neutrophiles. La surveillance de l'endothélium peut être tracée avant et après le déclenchement de l'inflammation.Il est important de noter qu'une perte de focalisation sur l'axe Z ou un déplacement XY peut survenir en raison de mouvements intestinaux compromettant l'expérience. Cette technique peut être davantage modifiée en utilisant différents modèles de souris génétiquement modifiées ou en injectant des anticorps bloquants ou des médicaments pharmaceutiques afin de déterminer le rôle de molécules spécifiques d'intérêt dans le comportement des leucocytes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de surveiller la dynamique des leucocytes saturés dans les veines mésentériques.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

Dans cette vidéo, nous démontrons la visualisation en temps réel des interactions cellules sanguines-endothéliales dans les veines mésentériales d’un modèle murin injecté par voie intrapéritonéale avec du lipopolysaccharide.

Microscopie intravitale pour analyser les interactions cellules sanguines-endothéliales dans un modèle murin d’inflammation

Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Cette application simplifiée de la microscopie intravitale des veines du mésentère chez la souris peut être utilisée dans différents modèles d’inflammation pour observer les interactions leucocytes-endothéliales et plaquettes-leucocytes.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Ce protocole actuel utilise des rapporteurs fluorescents, le marquage in vivo et des techniques d’imagerie intravitale pour permettre la surveillance du processus dynamique d’amorçage des neutrophiles chez les animaux vivants.

Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

Le protocole décrit un nouveau modèle de chambre fenêtre du fémur murin qui peut être utilisé pour suivre le mouvement des cellules dans la moelle osseuse fémorale in vivo. La microscopie à fluorescence multiphotonique intravitale est utilisée pour imager trois composants de la moelle osseuse fémorale (système vasculaire, matrice de collagène et neutrophiles) au fil du temps.

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

La migration des neutrophiles repose sur le remodelage rapide et continu de la membrane plasmique en réponse au chimioattractant et à ses interactions avec le microenvironnement extracellulaire. Il s’agit d’une procédure basée sur la microscopie subcellulaire intravitale pour étudier la dynamique du remodelage membranaire dans les neutrophiles injectés dans l’oreille de souris anesthésiées.

Imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques

Ce protocole présente une méthode pour induire une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique et visualiser les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) dans les veinules mésentériques à l’aide de la microscopie intravitale. Le flux sanguin dans l’artère mésentérique supérieure a été limité pendant 1 h, suivi d’une reperfusion, permettant une quantification directe de l’adhésion leucocytaire et de la NETose.

Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale

Découvrez l'imagerie intravitale des neutrophiles et monocytes dans les veines mésentériques de souris anesthésiées. Cette technique permet d'étudier la migration des leucocytes et leurs interactions avec l'endothélium vasculaire en temps réel.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

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