Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

L’objectif global de cette procédure de microscopie confocale intravitale est de surveiller la dynamique des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et les conditions inflammatoires chez la souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que la base moléculaire de la migration des leucocytes, le recrutement et l’interaction avec l’endothélium vasculaire. Les principaux avantages de cette technique sont la possibilité de suivre et d’analyser la patrouille de monocytes bas LY 60 dans des conditions d’état étatiste, et de suivre le recrutement des monocytes et des neutrophiles dans le même vaisseau Après des stimuli inflammatoires locaux démontrant la procédure sera Stefan ler le technicien du laboratoire Pour préparer une préparation de cellule unique à partir de moelle osseuse, Stérilisez les pattes arrière d’une souris de huit à 12 semaines avec de l’éthanol à 70 %, puis utilisez un scalpel pour récolter les fémurs et le tibia lorsque tous les os ont été déconnectés.

Rincez les cuisses avec de l’éthanol à 90 % et transférez les os dans un plat de culture rempli de PBS. Ensuite, dans une hotte de culture, utilisez le scalpel pour nettoyer les fémurs et le tibia et pour les séparer au niveau de l’articulation du genou. Ensuite, coupez les extrémités des os et utilisez une seringue d’un millilitre construite avec un milieu de préparation équipé d’une aiguille de calibre 23 pour rincer la moelle de chaque os dans un tube conique de 50 millilitres.

Perturbez les agrégats cellulaires en les repassant à travers la pointe de l’aiguille, puis amenez le volume total de la suspension cellulaire à 25 millilitres avec une préparation fraîche, faites tourner les cellules dans le milieu, puis réanimez. Suspendez le palais dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace. Après 30 secondes, arrêtez la lyse avec 10 millilitres de préparation. Douleur moyenne.

Faites tourner à nouveau les cellules et Resus suspend la pastille. Deux millilitres supplémentaires de milieu de préparation pour enrichir les neutrophiles par sélection négative. Tout d’abord, incubez les cellules de la moelle osseuse avec 150 microlitres de cocktail d’enrichissement en neutrophiles de souris sur de la glace pendant 10 minutes.

A la fin de l’incubation à 10 millilitres de rouge de phénol libre dmem. Retournez le tube une fois et faites tourner les cellules. Remettre le granulé en suspension dans 1,75 millilitres de milieu de préparation et transférer les cellules dans un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres.

Ensuite, incubez les cellules avec 250 microlitres de biotine sélection cocktail sur glace pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, nous suspendons les particules magnétiques du kit d’isolement cellulaire avec 30 secondes de vortex. Ensuite, incubez les cellules avec 500 microlitres de particules sur de la glace pendant 10 minutes.

À la fin de l’incubation, placez le tube dans l’aimant. Après trois minutes, retournez l’aimant dans un nouveau tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres. Pour collecter les cellules non marquées, placez le tube des cellules non marquées dans l’aimant.

Après trois minutes, retournez l’aimant dans un tube conique de 15 millilitres pour transférer les cellules non marquées en laissant la dernière goutte dans le tube. Portez ensuite le volume à cinq millilitres avec du rouge de phénol frais sans dm. Ajoutez maintenant un demi-microlitre du colorant cytoplasmique approprié, tel que le traceur de cellules orange utilisé ici, aux cellules à 37 degrés Celsius.

Après deux minutes, à 37 degrés Celsius, lavez les cellules avec 2,5 millilitres de milieu de préparation et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de préparation dans un tube de 1,5 millilitre, comptez les cellules puis incuberez-les pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir fait tourner les cellules, nous suspendons la pastille dans un millilitre de PBS suivi d’une autre centrifugation pendant que les cellules tournent. Utilisez de l’huile pour fixer une lamelle en verre de 35 millimètres à une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres avec un trou de 30 millimètres de diamètre.

Ensuite, remettez le granulé en suspension à une fois 10 aux sept cellules par 100 microlitres de PBS et placez les cellules sur de la glace dès que possible après l’étiquetage. Injectez les cellules neutrophiles marquées par voie intraveineuse dans une souris anesthésiée de huit à 12 semaines CX, trois CR et une souris GFP, et placez la souris sur un coussin chauffant. Ensuite, appliquez immédiatement une pommade sur les yeux de l’animal et utilisez des ciseaux pour ouvrir la peau abdominale, exposant le péritoine, incisez le péritoine avec les ciseaux pour exposer l’intestin.

Administrez ensuite 200 microlitres de PBS à 37 degrés Celsius dans la cavité péritonéale et retournez la souris face vers le bas sur la boîte de culture tissulaire pour retirer les intestins de la cavité péritonéale avec une légère pression. Ensuite, à l’aide de cotons-tiges stériles, enroulez soigneusement les intestins sur la lamelle pour exposer les vaisseaux mésentériques et immobilisez le tissu avec des morceaux de papier de soie imbibé de 37 degrés Celsius PBS pour diminuer les mouvements résultant du péristaltisme. Il est très important de prendre votre temps pour immobiliser soigneusement l’intestin avec des tissus pondérés par PBS.

Sinon, les mouvements résultant du péristaltique pendant l’acquisition de l’image ruineront l’expérience. Ensuite, transférez la boîte de culture tissulaire et la souris dans une chambre thermostatique à 37 degrés Celsius sur une platine de trace faite sur mesure d’un microscope inversé et administrez une deuxième série d’anesthésiques par voie intramusculaire à la patte arrière. Réglez maintenant les lasers appropriés sur la puissance la plus basse nécessaire pour éviter la phototoxicité induite par le laser et laissez la souris se reposer pendant 30 minutes.

Lorsque l’animal s’est rétabli, enregistrez le premier film pendant 30 minutes dans des conditions d’état stable. Ensuite, pour initier l’inflammation des vaisseaux sanguins, distribuez une goutte de 20 microlitres de PBS contenant 100 microgrammes du TLR deux TLR un agoniste PAM trois CSK quatre directement sur les vaisseaux imagés. Enfin, acquérir un second film en prenant soin de contrôler la mise au point après ajout de l’agoniste car l’inflammation induit des modifications de la largeur de l’endothélium, modifiant ici la mise au point de l’axe Z, les différentes étapes de traitement d’image pour le premier point temporel d’un film acquis en conditions d’état stationnaire, comme nous venons de le démontrer, sont montrées dans ce film.

La patrouille des monocytes verts du LASIK cilo dans des conditions d’état stationnaire peut être visualisée avec des neutrophiles rouges observés circulant dans la circulation sanguine. Ici. Le même champ d’intérêt est montré 90 minutes après l’ajout de PAM trois CSK quatre, entraînant le recrutement massif de neutrophiles et de monocytes sur la paroi endothéliale, que les monocytes scannent méticuleusement à l’aide du logiciel approprié, les trajets exacts des monocytes et des neutrophiles. La patrouille de l’endothélium peut être suivie avant et après le début de l’inflammation.

Il est important de noter qu’une perte de focalisation sur l’axe Z ou un déplacement XY peut survenir à la suite de mouvements intestinaux ruinant l’expérience. Cette technique peut être modifiée en utilisant différents modèles de souris génétiquement modifiées ou en injectant des anticorps bloquants ou des médicaments pharmaceutiques pour déterminer le rôle de molécules d’intérêt spécifiques dans le comportement des leucocytes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller la dynamique des leucocytes saturants dans les veines mésentériques.