Identification des nanoparticules d'oxyde de métal dans des échantillons histologiques par cartographie Darkfield Microscopie et hyperspectrale Enhanced

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les nanoparticules d’oxyde métallique dans les échantillons histologiques par microscopie à fond noir et cartographie hyperspectrale. Pour ce faire, il suffit d’abord d’identifier une région d’intérêt dans un échantillon de contrôle positif contenant des nanoparticules et de capturer une image en fond noir. La deuxième étape consiste à créer une image hyperspectrale ou un cube de données de la région d’intérêt à l’aide de la caméra hyperspectrale.

Ensuite, une bibliothèque spectrale de référence est créée à partir du cube de données de contrôle positif, qui est filtré par rapport à un contrôle négatif pour supprimer les faux positifs. La dernière étape consiste à utiliser la bibliothèque spectrale de référence pour cartographier des échantillons expérimentaux afin d’identifier et de localiser des nanoparticules de même composition. En fin de compte, la microscopie à fond noir améliorée et la cartographie hyperspectrale sont utilisées pour identifier les nanoparticules d’oxyde métallique dans les échantillons histologiques de manière plus rapide et moins exigeante en ressources que d’autres techniques telles que la microscopie électronique.

Cette méthode offre plusieurs avantages par rapport aux techniques conventionnelles d’imagerie et de caractérisation des nanomatériaux telles que la microscopie électronique. Dans ce cas, la préparation des échantillons est généralement minimale et non destructive. L’acquisition et l’analyse d’images nécessitent moins de temps et d’argent, et peuvent être appliquées à l’imagerie des nanoparticules dans une variété de matrices.

Les personnes connaissaient que la méthodologie avait parfois du mal à le faire, car la création d’échantillons de contrôle positif et de bibliothèques spectrales de référence appropriés était à la fois difficile et chronophage. Mais une fois ces premières étapes terminées, les échantillons expérimentaux peuvent être évalués assez rapidement. Si cette méthode peut donner un aperçu de la pénétration cutanée des nanoparticules, elle peut également être appliquée à d’autres échantillons biologiques tels que le lavage broncho-alvéolaire et les frottis sanguins, ainsi qu’à des échantillons non biologiques, tels que les filtres utilisés dans les évaluations de l’exposition professionnelle.

La démonstration de cette technique sera faite par Plar Sosa, un étudiant en médecine de mon laboratoire, qui commencera par brancher et allumer la source lumineuse, le contrôleur de scène, la caméra optique, la caméra hyperspectrale et le système informatique. Ensuite, soulevez l’étage et le condenseur en position de fonctionnement et appliquez soigneusement trois à cinq gouttes d’huile d’immersion de type A sur la lentille du condenseur. Si des bulles se créent, essuyez l’huile et appliquez-la à nouveau sur l’objectif.

Ensuite, positionnez l’échantillon sur la platine et soulevez lentement le condenseur jusqu’à ce que l’huile d’immersion entre en contact avec la face inférieure de la lame. Cela se remarquera à travers l’anneau d’éclairage qui s’éclaircit rapidement où l’huile entre en contact avec la lame. Une fois le condenseur en place, passez à l’objectif 10 x, puis faites la mise au point et alignez le condenseur pour maximiser la luminosité si nécessaire, ajustez les boutons d’alignement du condenseur pour centrer le point lumineux.

Ouvrez le logiciel d’imagerie optique. Concentrez l’échantillon à l’aide du bouton de mise au point de l’objectif fin. Trouvez ensuite une région qui vous intéresse.

Ajustez la mise au point du condenseur si nécessaire pour équilibrer l’éclairage. Cliquez sur l’onglet Paramètres dans la barre de menu et cliquez sur le bouton Capture d’image. Pour l’événement de capture.

Sélectionnez le format d’image souhaité et attribuez-lui un nom de fichier. De plus, sélectionnez la valeur par défaut du time-lapse, puis cliquez sur OK. Ensuite, allez dans le menu d’exposition et sélectionnez les paramètres d’exposition qui créent l’image la plus contrastée.

Ici, le niveau est réglé sur 0,0 %Le gain est réglé sur 2,8 décibels et la vitesse d’obturation est réglée sur 56 millisecondes secondes. Capturez l’image en cliquant sur le bouton d’image dans la barre de menus. Changez l’objectif à 40 x et 100 x.

Pour capturer des images à des grossissements plus élevés, assurez-vous que le guide de lumière est dirigé vers la caméra hyperspectrale, puis ouvrez le logiciel d’imagerie hyperspectrale pour l’acquisition des cubes de données HSI dans le logiciel, ouvrez Microscope hyperspectral dans la barre de menus et sélectionnez Commandes du microscope HSI. C’est là que se situent l’agrandissement de l’objectif et le chemin de sécurité. Ensuite, modifiez la capture de zone dans les paramètres et modifiez le nombre de lignes.

Dans cette étude, nous avons utilisé 720 pour régler le temps d’exposition. Ici, nous avons utilisé 0,25 seconde. Laissez tout le reste par défaut et cliquez sur l’aperçu HSI pour afficher l’image.

Observez le graphique d’intensité résultant représentant l’intensité de la longueur d’onde la plus élevée lorsque l’utilisateur se déplace sur l’axe x du centre du champ de la caméra. Déplacez le curseur pour générer un contour précis du graphique. Cela fera apparaître un indicateur d’intensité numérique sur la gauche.

Concentrez l’image sur la base de cet aperçu en ajustant la mise au point fine de l’objectif pour affiner les pics de cette image. Ensuite, optimisez l’intensité lumineuse en ajustant la luminosité de la source, la mise au point du condenseur, ou annulez l’aperçu et ajustez le temps d’exposition dans le logiciel. Cliquez sur capturer et observer comme quatre nouvelles fenêtres avec les noms disponibles.

Liste des groupes. Zoom numéro un. Le numéro un, le défilement et la bande RVB numéro un apparaissent.

Maximisez la fenêtre de bande RVB numéro un car il s’agit du cube de données, qui sera utilisé pour toutes les références futures. Droite? Cliquez sur ce cube de données, enregistrez-le en tant que fichier tiff et cliquez sur OK. Faites un clic droit dans la fenêtre de l’image du cube de données et cliquez avec le bouton gauche sur le spectre du profil Z.

Lorsque la fenêtre contextuelle du profil spectral apparaît à gauche, cliquez sur les pixels d’intérêt sur la cible du cube de données. Les plus brillants sont ceux qui peuvent être identifiés avec certitude comme représentant le matériel d’intérêt. Dans le menu d’analyse des particules, sélectionnez l’outil de filtrage des particules pour identifier les particules présentes dans le cube de données.

Dans le nouvel ensemble de fenêtres contextuelles, le maximum spectral doit dépasser la valeur, il est donc supérieur aux pixels d’arrière-plan, mais inférieur aux matériaux d’intérêt. Le maximum de données valides est de 16 000. Dans la fenêtre de l’outil de révision du filtre de particules, cliquez sur Sélectionner tout.

Cliquez ensuite sur exporter vers la bibliothèque spectrale et attribuez un nom à votre bibliothèque spectrale. Après avoir sélectionné un échantillon à servir de contrôle négatif, obtenez plusieurs cubes de données à partir de l’échantillon. À l’aide de la caméra hyperspectrale, au moins une caméra est nécessaire, mais il est possible d’en capturer davantage.

Pour augmenter la sélectivité avec le cube de données de contrôle négatif ouvert, cliquez sur Bibliothèque spectrale de filtre Dans le menu d’analyse situé sur la barre d’outils principale du programme, cliquez sur Ouvrir un nouveau fichier et sélectionnez la bibliothèque spectrale créée précédemment pour le contrôle positif comme fichier d’entrée, cliquez sur OK. Dans la fenêtre de la bibliothèque spectrale de filtre cyto viva. Cliquez sur l’image et choisissez le nom du fichier de sortie de la bibliothèque spectrale de référence, puis cliquez sur OK.

Ensuite, cliquez sur le nom de fichier de votre cube de données de contrôle négatif en tant qu’image source. Le logiciel analysera la bibliothèque spectrale et supprimera chaque spectre correspondant à n’importe quel spectre du cube de données de contrôle négatif. Obtenez des cubes de données à partir des échantillons expérimentaux avec le cube de données expérimentales ouvert.

Cliquez sur le menu spectral dans le sous-menu des méthodes de mappage Ouvrez le mappeur d’angle spectral. Sélectionnez le nom du cube de données expérimental dans la fenêtre contextuelle, puis cliquez sur OK. Si aucun nom de fichier n’est répertorié, cliquez sur Ouvrir un nouveau fichier et choisissez le cube de données expérimental.

Cliquez ensuite sur OK dans la fenêtre contextuelle appelée Collection des membres finaux, SAM, cliquez sur Importer dans la barre de menus. Sélectionnez ensuite dans le fichier de la bibliothèque spectrale. Ouvrez la bibliothèque spectrale de référence précédemment créée et cliquez sur OK.

Dans la nouvelle fenêtre contextuelle nommée Bibliothèque spectrale d’entrée, cliquez sur sélectionner tous les éléments, cliquez sur OK. Ensuite, faites un clic droit sur la couleur et sélectionnez. Appliquer les couleurs par défaut à tous, cliquez sur Sélectionner tout, puis sur Appliquer, puis choisissez le nom du fichier de sortie et cliquez sur OK.

Ouvrez le menu de superposition dans la fenêtre du cube de données et sélectionnez classification. Accédez ensuite au nom du fichier de sortie et cliquez sur OK. Dans le menu interactif de la fenêtre d’outils de classe, ouvrez le menu d’options et sélectionnez les classes de fusion pour créer un jeu de couleurs unifié.

Afin de faciliter l’analyse des données à l’aide d’un autre logiciel, sélectionnez un seul spectre dans la liste des classes de base. Sélectionnez ensuite toutes les classes sauf non classifiées pour les fusionner dans la base. Cliquez ensuite sur OK.

Ensuite, cliquez sur la couleur de base sélectionnée et tous les spectres correspondants seront affichés dans cette couleur. Pour obtenir une image amatique qui montrera les spectres correspondants sur un fond noir, cliquez sur la case des couleurs non classées, qui est noire Par défaut, l’avantage le plus significatif de la technique est sa capacité à identifier les nanoparticules d’oxyde métallique dans les échantillons histologiques par microscopie à fond noir et cartographie hyperspectrale. Ces images illustrent ce processus à l’aide d’échantillons histologiques de peau.

Alors que certaines particules sont facilement visibles dans le champ noir, l’image optique, d’autres particules sont détectées à l’aide de l’imagerie hyperspectrale. On voit ici du tissu cutané porcin dans la couche de l’épiderme, qui a été exposé à des nanoparticules d’Illumina. Un amas de nanoparticules à contraste élevé a été trouvé déposé sur la couche cornée de la couche dermique, qui a été exposée à des nanoparticules de silice.

Plusieurs nanoparticules à contraste élevé peuvent être observées déposées sur le tissu conjonctif. Enfin, dans le tissu sous-cutané, qui a été exposé aux nanoparticules de Syrie. Plusieurs nanoparticules dispersées à contraste élevé peuvent être observées déposées le long de l’identification des nanoparticules d’adipocytes à l’aide de cette méthode.

Dans d’autres échantillons de tissus tels que les poumons, le foie, la rate, les reins et les ganglions lymphatiques, il est possible. Suite à cette procédure, une analyse d’image peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le nombre de particules et l’emplacement des particules. Certaines considérations et inconvénients, tels que la nécessité de contrôles hautement spécialisés et les limites de la résolution de l’imagerie photonique, doivent être mis en balance avec ceux des méthodes conventionnelles.

Lors de la sélection des techniques analytiques les plus appropriées pour étudier des questions de recherche spécifiques, nous avons choisi de démontrer cette application particulière car elle a le potentiel de compléter la recherche actuelle et future en nanotoxicologie. Il peut également éclairer la recherche sur l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’excrétion des nanoparticules dans les organes et les tissus.