Validation d'un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

L’objectif global de cette expérience est d’illustrer l’utilité d’un modèle de souris transgénique, permettant l’expression inductible et ciblée d’un cache EGFP marqué par fluorescence, de deux peptides in vivo, et la perturbation résultante de complexes de liaison endogènes. Dans cette expérience, l’expression de la cache deux marquée par fluorescence sera ciblée sur les cellules de Perkin cérébelleuses. Cette approche génétique peut répondre à des questions clés sur le rôle des complexes de liens dans le positionnement nucléaire au sein de la plupart des tissus.

L’expression inductible et ciblée de E-G-F-P-K two présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il faut un seul schéma de reproduction de souris cayes avec n’importe quelle souche de croisière existante. Deuxièmement, cette approche contourne la périnatalité observée dans les modèles murins de mutations germinales des composants du complexe de liaison.

Enfin, cette méthode permet d’étudier la physiologie des complexes de liaison au sein de cellules ou de tissus spécifiques. In vivo. Chloe Potter, membre du laboratoire, vous montrera les différentes étapes nécessaires pour visualiser E-G-F-P-K deux dans les cellules Cérébelleuses de Burkin G.

Pour commencer, élever des souris clac Z avec du PCP, deux souris CRE pour produire du PCP, deux souris CAG C, deux souris comme décrit dans les publications précédentes. Lorsque les chiots résultants sont nés, effectuez le génotypage. Pour identifier ceux qui hébergent à la fois l’EGFP et les transgènes cris comme décrit précédemment, préparer 50 millilitres d’une solution de saccharose à 30 % dans du PBS et la conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’au jour du prélèvement des tissus à l’âge approprié, effectuer une perfusion cardio trans des souris sous anesthésie afin de préparer le tissu cérébral pour la dissection comme décrit dans le protocole écrit, placez le cerveau disséqué dans une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres avec 10 millilitres de PBS et séparez le cervelet du cerveau.

Ensuite, utilisez un scalpel pour disséquer le cervelet dans le plan sagittal et transférez les sections dans une solution à 30 % de saccharose et conservez-la à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Préparez une bouillie de glace sèche et deux méthylbutane. Laissez la température du bain s’équilibrer pendant cinq minutes.

Ensuite, remplissez un moule cryogénique avec un composé OCT et placez la moitié du cervelet disséqué dans le moule à l’aide d’un microscope de dissection et d’une paire de pinces. Positionnez le cervelet de manière à ce que la surface bi-disséquée qui se trouve près de la ligne médiane du cervelet soit tournée vers le haut dans le moule. Transférez ensuite le moule cryogénique dans la boue pour yeux secs pendant cinq minutes jusqu’à ce que le composé OCT ait formé une matrice blanche solide autour de l’échantillon de tissu.

Stockez l’échantillon encastré à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Étiquetez les lames de polylysine prétraitées pour prélever des coupes de tissus et montez le bloc de tissus cérébelleux sur le porte-tissus avec de l’OCT frais. Une fois le bloc fermement fixé, montez le porte-mouchoir et rasez des tranches de 40 micromètres pour éliminer l’excès d’OCT jusqu’à ce que le tissu soit atteint.

Réglez l’épaisseur à 15 micromètres et collectez les sections en contactant soigneusement la section OCT avec le côté revêtu de polylysine de la lame. Conservez les sections de tissu à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que vous procédiez à la coloration et à l’imagerie. Lorsque vous êtes prêt à continuer, décongelez les sections cérébelleuses dans l’obscurité pour éviter la décoloration des protéines fluorescentes.

À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, tracez un rectangle autour du périmètre des sections de tissus. Ajoutez environ 500 microlitres d’aldéhyde paraforme à 4 % dans les sections pendant cinq minutes pour postfixer le tissu. Ensuite, utilisez un aspirateur pour aspirer le fixateur, en faisant particulièrement attention à ne pas perturber les sections de tissu avec une pipette.

Appliquez doucement du PBS sur la lame sans perturber les sections de tissus. Après cinq minutes, utilisez la pipette sous vide pour retirer soigneusement le liquide, répétez le rinçage PBS au total trois fois. Ensuite, ajoutez environ 500 microlitres de solution de blocage aux lames et incubez-les pendant 10 minutes.

Retirez puis remplacez la solution bloquante par la même solution contenant une à 300 dilutions d’anticorps de liaison cal ou de deux anticorps nesin. Retirez ensuite la solution d’anticorps et rincez les lames avec du PB S3 fois. Incuber les lames pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité.

Ensuite, préparez une à 1000 dilutions de l’anti-US Alexa floor 5 94 pour les lames étiquetées de liaison de vache et de l’anti Alexa Fluor 5 94 pour le Nesprin deux lames étiquetées dans la solution de blocage et stockez les solutions dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires. Retirez délicatement le rinçage final PBS et couvrez les sections avec les anticorps secondaires dilués pendant une heure dans l’obscurité. Après l’incubation, retirer la solution d’anticorps secondaire.

Appliquez ensuite une coloration nucléaire telle que le DPI à 300 nanomolaires dans du PBS pendant cinq minutes. Ensuite, rincez les sections deux fois de plus dans PBS. Retirez autant de solution PBS que possible et couvrez la section du tissu avec une goutte de support de montage.

Placez une lamelle en verre sur la section du mouchoir en évitant les bulles d’air et laissez reposer 15 à 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Utilisez ensuite un microscope fluorescent pour visualiser la coloration des anticorps et les protéines fluorescentes. Pour les tranches cérébelleuses, utilisez un objectif 20 x ou 40 x.

Pour voir les deux jantes nucléaires E-G-F-P-C comme illustré ici, E-G-F-P-C deux peut être directement visualisé dans les coupes cérébelleuses dans le canal Fitzy. De plus, la colocalisation de l’EGFP avec la liaison de la vache, qui marque spécifiquement les cellules de Perkin, confirme que l’expression de E-G-F-P-C two est confinée aux cellules de Perkin au sein des cellules de Perkin. La cache EGFP deux est ciblée sur l’enveloppe nucléaire, comme l’indiquent les motifs RIM positifs à l’EGFP observés autour du noyau.

Dans cet exemple, l’expression du cache EGFP deux a été détectée dans plus de 70 % des cellules Perkin positives pour la liaison des vaches. Le cache EGFP deux déplace la nesprin endogène de l’enveloppe nucléaire par la saturation des domaines solaires disponibles. En conséquence, la NESIN endogène deux est déplacée de l’enveloppe nucléaire des cellules de Perkin exprimant le cache EGFP deux.

Alors que les cellules de Perkin qui n’expriment pas E-G-F-P-C deux conservent la nesine endogène deux à l’enveloppe nucléaire comme prévu, le contrôle interate, qui n’exprime pas la recombinase CRE affiche NESIN deux à l’enveloppe nucléaire de l’ensemble de la population de cellules bikini un. Des blocs de tissus CT sont donc disponibles. E-G-F-P-K deux peuvent être visualisés en quatre heures environ.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’étendue des conditions de fixation et/ou d’encastrement de la PFF peut affecter considérablement l’antigénicité de votre épitope. Il est donc très important de déterminer les conditions de fixation optimales qui préservent votre épitope spécifique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le modèle de souris transgénique CK two pour cibler l’expression de la noix de cajou VGFP sur des tissus spécifiques.