Name: Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de lor nanorods (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Découvrez la préparation de véhicules cellulaires contenant des nanobâtonnets d'or pour l'imagerie photoacoustique des tumeurs. Cette méthode utilise les macrophages pour améliorer la stabilité des agents de contraste.

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Ce travail a été partiellement financé par Regione Toscana et de la Communauté européenne dans le cadre de la BUBBLE ERANET + Projects LUS et BI-TRE.

Note: Toutes les concentrations de nanotiges d&#39;or sont exprimés en termes de nominal Au molarités. A titre de comparaison avec d&#39;autres œuvres, notez que 1 M Au correspond à peu près à 20 uM nanotiges d&#39;or, dans notre cas. 1. Préparation de Cationic Or nanorods Remarque: La méthode commence avec la synthèse du bromure de cétrimonium (CTAB) -capped nanotiges d&#39;or par réduction autocatalytique de HAuCl 4 avec de l&#39; acide ascorbique, selon le protocole présenté par Nikoobakht et al 25 , et adapté en fonction des Ratto et al 26... Ensuite , ces nanotiges or sont modifiées afin d&#39;obtenir plus de biocompatibilité et de l&#39; affinité pour les membranes plasmatiques, par la combinaison de polyéthylène - glycol brins 10, 11, 27, 28 et des composés d&#39;ammonium quaternaire 22. <ol><li> Purifier 24 ml nanorods or CTAB-plafonnés à un Concentration de 450 uM Au par deux cycles de centrifugation (12 000 xg, 30 min) et décantation. Assurez-vous que le rapport du volume mort au volume initial est d&#39;environ 1/200 ou plus bas pour toutes les étapes de centrifugation dans ce protocole. Utiliser CTAB 500 um aqueuse comme une solution de lavage et enfin transférer les particules dans 6 ml de tampon acétate 100 mM à pH 5 contenant 500 uM de CTAB et 0,005% (v / v) de polysorbate 20. </li><li> Ajouter 30 pi 10 mM aqueux alpha-méthoxy-oméga-mercapto-poly (éthylène glycol) (MW ~ 5000) et laisser réagir pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 30 ul de 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromure de triméthylammonium dans du diméthylsulfoxyde et de laisser au repos pendant 24 heures à 37 ° C. </li><li> Ensuite, ajouter 18 ml de 0,005% (v / v) de polysorbate 20 dans de l&#39;eau et on purifie ces particules par quatre cycles de centrifugation (12 000 xg, 30 min) et décantation. Utiliser 0,005% (v / v) de polysorbate 20 dans l&#39;eau comme solution de lavage et enfin transférer les particules dans du PBS stérile 2,4 ml à un pH7.4. La concentration nominale finale de l&#39;or est de 4,5 mM. </li></ol> 2. Chargement des macrophages murins avec or nanorods <ol><li> Utiliser la lignée cellulaire de monocytes / macrophages J774A.1 et du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 1 mM de glutamine, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine en tant que milieu de culture. Plate 5 x 10 5 cellules dans quatre boîtes de Pétri de 60 mm de diamètre et leur permettre de se développer pendant 24 heures, de manière à être subconfluent au moment du détachement (voir étape 2.2). <ol><li> Tout au long du protocole, de maintenir les cellules dans des conditions standard de culture (37 ° C, 5% de CO2, 95% d&#39; air et 100% d&#39; humidité relative). Utilisez une hotte à flux laminaire et de l&#39;équipement de protection individuelle approprié pour manipuler les cellules. </li></ol></li><li> Après 24 h, charger les cellules avec cationiques nanotiges d&#39;or et les préparer à être intégré dans des films de chitosane: <ol><li> Afin de permettre aux particules d&#39;être absorbées par les cellules, ajouter une portion aliquote de 4,5mM Au nanotiges d&#39;or cationique dans PBS dans chaque boîte de Pétri, de manière à parvenir à une concentration finale de 100 uM Au. Laissez les boîtes de Pétri en incubation pendant 24 heures. </li><li> Ensuite, observer les cellules sous un microscope optique pour confirmer leurs bonnes conditions et le téléchargement. Les cellules doivent présenter leur morphologie normale et un certain nombre de vésicules intracellulaires sombres. Détacher les cellules par un racleur, fusionner ceux de deux boîtes de Petri, afin d&#39;obtenir une quantité appropriée de cellules pour les étapes suivantes (au moins 2 x 10 6 cellules) et centrifuger les (120 x g, 6 min) pour éliminer toute excès de nanotiges d&#39;or cationiques. Le culot cellulaire devrait ressembler presque noir. </li><li> Suspension le culot dans 2 ml de PBS et compter les cellules par l&#39;utilisation d&#39;une chambre Bürker. Centrifuger une suspension contenant 2 x 10 6 cellules (120 xg, 6 min) et fixe leur culot dans 2 ml de 3,6% (p / v) de formaldehyde dans du PBS pendant dix minutes à la température ambiante. Enfin, lavez cette pastille à trois reprises par centrifugation (120 xg, 6 min) afin d&#39;éliminer le fixateur. En utilisant du PBS comme solution de lavage. </li></ol></li></ol> 3. Embedment de Macrophages en chitosane Films Remarque: Les propriétés particulières de chitosane 26, 27, 28, 29 sont exploités pour produire des fantômes biomimétiques contenant des macrophages colorés avec nanotiges d&#39;or cationiques. En ce qui concerne d&#39; autres hydrogels tels que l&#39; agarose, le chitosane permet des films qui sont beaucoup plus forts et plus mince, ce qui est essentiel pour la microscopie PA 6. La fabrication de ces fantômes est effectuée selon des protocoles antérieurs 29, 30, 31 , avec quelques modifications imposées par les 30 suivants. <ol><li> Préparer un acidifiée (pH 4,5, obtenu par addition d&#39;acide acétique) et visqueux à 3% (p / v) de chitosan de faible poids moléculaire (poids moléculaire moyen de 120 kDa), la solution, bien mélanger etlaisser homogénéiser pendant 24 heures à 40 ° C. </li><li> Ensuite, mélanger les macrophages murins contenant nanotiges d&#39;or cationique (2 x 10 6 cellules) avec 500 pi de solution de chitosane. </li><li> Afin d&#39;obtenir ~ 50 um d&#39; épaisseur fantômes, verser 250 mg du mélange dans 1,91 cm 2 moules en polystyrène et les laisser sous un courant d&#39;azote pendant 24 heures. Par la suite, le traitement de ces échantillons avec 500 ul de NaOH 1 M, afin d&#39;induire la réticulation, et les rincer avec 10 ml d&#39;eau ultrapure. </li></ol> 4. Contrôle de la stabilité de la conversion Photoacoustique Remarque: La stabilité de conversion PA est étudiée au moyen d&#39;expériences PA avec la configuration fait maison qui est décrite dans la référence 6. <ol><li> Suspendre un film de chitosan contenant les macrophages dans l&#39;eau déminéralisée, par exemple par l&#39;utilisation d&#39;un support en plastique immergé dans une boîte de Petri, de manière à garder une distance d&#39;environ 5 mm du fond de la plaque. Mettez cette plaque sur un étage XY micrométriqueafin de contrôler la position de l&#39;échantillon. </li><li> Focaliser un faisceau laser avec ~ 5 durée nsec d&#39;impulsion en résonance avec la bande plasmonique longitudinale des nanotiges d&#39;or (par exemple, provenant d&#39; un oscillateur paramétrique optique pompé par la troisième harmonique d&#39;un laser Nd Q-switché: YAG laser avec une longueur d&#39;onde de 400 - 2500 durée nm et impulsion de 5 nanosecondes) perpendiculaire à la surface du film avec un diamètre de spot ~ 300 um. <ol><li> Placer un atténuateur en face de la sortie du laser pour régler la fluence du laser et en utilisant un diviseur de faisceau pour focaliser une partie du faisceau laser à un compteur d&#39;énergie (par exemple, un détecteur pyroélectrique) , et surveiller les variations de fluence. Maintenir la fluence optique en dessous de ~ 1 mJ / cm 2 par impulsion pendant l&#39;alignement. Porter des lunettes de sécurité laser appropriée chaque fois que le laser est activé. </li></ol></li><li> Trempez un transducteur à ultrasons (plage de fréquence de 1 - 20 MHz) dans la boîte de Pétri ~ 2 mm hors de la surface du film et ajuster sa position en utilisant les traductions micrométriqueset les étapes de rotation pour maximiser le signal émis PA à partir du film. </li><li> Déterminer une fluence de la sonde F LO qui ne porte pas atteinte à l&#39;échantillon 6: <ol><li> Irradier un point de l&#39;échantillon aléatoire à une fluence environ 1 mJ / cm 2 par impulsion pour au moins 500 impulsions. Pour chaque impulsion, PA acquérir le signal correspondant à partir du transducteur à ultrasons et la fluence laser provenant du compteur d&#39;énergie à un oscilloscope. Nom de la fluence moyenne comme essai F LO. </li><li> Calculer l&#39;intensité du signal PA en tant que son amplitude crête à crête en fonction du nombre d&#39;impulsions. Afin de contrepoids aux fluctuations d&#39;intensité du laser, de normaliser l&#39;amplitude de chaque signal PA au rapport de sa propre fluence procès F LO. Analyser l&#39;évolution de l&#39;intensité normalisée PA en fonction du nombre d&#39;impulsions et de vérifier sa stabilité dans le temps. </li><li> Dans le cas d&#39;instabilité, répétez les étapes 4.4.1 à 4.4.3 avec une valeur inférieure de F LO <sup&gt; procès. Dans le cas de la stabilité, répétez - les avec une valeur de procès F LO supérieur de ~ 10%, jusqu&#39;à ce qu&#39;une perte de stabilité se pose. Réglez la sonde fluence F LO que la deuxième valeur la plus élevée de l&#39; épreuve F LO qui assure la stabilité. </li></ol></li><li> Mesurer un seuil fluence remodelant: <ol><li> Choisir un autre point de l&#39;échantillon aléatoire et sonder une intensité moyenne PA (I LO a) plus de 500 impulsions à F LO. </li><li> Définir une fluence nominale supérieure à F LO et de fournir 50 impulsions. Nom de leur fluence moyenne comme F exc. </li><li> Sonde à nouveau une intensité moyenne PA (I LO b) de plus de 500 impulsions à F LO. Calculer le ratio R = I LO b / I LO a. Une valeur de R inférieure à l&#39;unité donne la preuve d&#39;un changement irréversible des propriétés optiques de l&#39;échantillon. </li><li> Utilisez la scène XY micrométrique pour déplacer le film et changer le point de l&#39;échantillon au hasard. Répétez les étapes 4.5.1 à 4.5.4 avec différentes valeurs de F exc, de manière à prendre quelques valeurs de R ci - dessous, autour et au-dessus de l&#39; unité. 15 points sont raisonnables. </li><li> Parcelle R en fonction de F exc et identifier le seuil de reprofilage fluence F th en tant que valeur lorsque R commence à varier d&#39;une au - delà de l&#39; incertitude statistique. 6 </li></ol></li></ol>

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<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+coated+with+multilayer+polyelectrolyte+as+contrast+agents+for+multimodal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+laser+assisted+microvascular+repair+and+end-to-end+anastomosis+by+means+of+indocyanine+green-infused+chitosan+patches%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study.</a> Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

La notion de cibler les macrophages associés aux tumeurs est en train de devenir un concept puissant pour lutter contre le cancer 34, 35, 36. Ici, au lieu de leur destruction, ces cellules sont recrutés en tant que véhicules cellulaires pour apporter nanotiges d&#39;or dans une tumeur, par l&#39;exploitation de leur tropisme. Cette perspective exige une conception réfléchie des particules, leur intégration dans les cellules et leur caractérisation. Nous avons consta...

Au cours de la dernière décennie, diverses particules plasmoniques telles que nanotiges d&#39;or, nanobilles et nanocages, ont reçu une attention considérable pour les applications en optique biomédicale 1, 2, 3, 4. En contradiction avec les nanosphères d&#39;or standard, ces particules nouvelles résonnent dans la fenêtre proche infrarouge (NIR) qui prévoit la plus profonde pénétration optique à travers le corps et le plus haut contraste optique sur les composants endogènes 1. Cette fonction a suscité un intérêt pour des applications innovantes, telles que la photoacoustique (PA) imagerie et l&#39;ablation photothermique du cancer. Cependant, plusieurs problèmes freinent la pénétration clinique de ces particules. Par exemple, leur activation optique tend à induire leur surchauffe et de modifier leurs formes fonctionnelles vers des profils plus sphériques, qui entraîne un photoinstabilité 5, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Une autre question qui domine le débat scientifique est leur administration systémique dans les tumeurs. En particulier, nanotiges d&#39;or combinent tailles qui sont idéales pour imprégner les tumeurs qui présentent une perméabilité accrue et la rétention et la facilité de conjugaison avec des sondes spécifiques de marqueurs malignes. Par conséquent, leur préparation pour une injection directe dans la circulation sanguine est perçue comme un système réalisable 10, 11, 12, 13. Cependant, cette voie reste problématique, avec la plupart des particules devenant capturées par le système phagocytaire mononucléaire 10, 11, 12. En outre, un autre problème réside dans la stabilité optique et biochimique des particules après circulation à travers le corps 14. Lorsque les particules perdent leur stabilité et de l&#39; agrégat colloïdale, leurs caractéristiques plasmon et la dynamique du transfert de chaleur peuvent souffrir de couplage plasmonique 15, </sup&gt; 16, 17 et contre-surchauffe 18. Plus récemment, la notion d&#39;exploiter le tropisme des macrophages associés aux tumeurs est apparue comme une solution de rechange à puce 19, 20, 21. Ces cellules détiennent une capacité innée à détecter et infiltrer les tumeurs avec une grande spécificité. Par conséquent, un point de vue peut être d&#39;isoler ces cellules d&#39;un patient, de les charger avec nanorods or in vitro, puis de les injecter dans le patient, avec l&#39;intention de les utiliser comme véhicules cellulaires en charge de la livraison. Un autre avantage serait de gagner plus de contrôle sur la stabilité optique et biochimique des particules, en raison de leur interface biologique serait construit in vitro. Pourtant, les performances de ces véhicules cellulaires comme agents de contraste optiques ont besoin d&#39;une analyse critique. Dans ce travail, nous décrivons la préparation et les questions critiques de Cellulvéhicules ar contenant nanotiges d&#39;or pour l&#39;imagerie PA du cancer. PEGylés nanotiges d&#39;or sont modifiées avec des composés d&#39;ammonium quaternaire 22, afin d&#39;obtenir un profil cationique qui devrait favoriser leurs interactions avec les membranes plasmatiques 23, 24. Ces particules subissent l&#39;absorption efficace et non spécifique de la plupart des types cellulaires, nous l&#39;espérons, sans interférer beaucoup avec leurs fonctions biologiques. macrophages murins sont chargés avec jusqu&#39;à moins de 200, 000 nanotiges d&#39;or cationiques par cellule, qui deviennent confinées dans les vésicules d&#39;endocytose serrés. Cette configuration devrait se poser problème, en raison de la menace de couplage plasmonique et le contre-surchauffe à l&#39;intérieur de ces vésicules. Par conséquent, les macrophages sont noyés dans des hydrogels biopolymères qui imitent les tissus biologiques, afin de vérifier que la majeure partie de la stabilité de la conversion PA des particules est retenue dans le transfert du milieu de croissance des vésicules d&#39;endocytose. effectivles critères de mesure de e sont élaborés afin de mesurer la stabilité de la conversion PA dans des conditions d&#39;intérêt immédiat pour l&#39;imagerie PA. Un seuil remodelage est réglé au début même de l&#39;instabilité optique après un train de 50 impulsions laser avec le taux de répétition typique de 10 Hz. Nous sommes convaincus que ces résultats peuvent donner une impulsion pour le développement de nouvelles stratégies pour délivrer des particules plasmoniques à des tumeurs.

<table><tbody><tr><td>Bromure d’hexadécyltriméthylammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>Pour synthétiser des nanotiges d’or Chlorure</td></tr><tr><td>d’or(III) trihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>Pour synthétiser des nanotiges d’or</td></tr><tr><td>Nitrate d’argent Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>Pour synthétiser des nanotiges d’or</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Pour synthétiser des nanotiges d’or</td></tr><tr><td>Borohydrure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Pour synthétiser des nanograines d’or</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>Pour pégyler des nanotiges d’or. Poids moléculaire environ 5 000 Da.</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Pour pégyler des nanotiges d’or et solubiliser du chitosane</td></tr><tr><td>Acétate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Pour PEGyler des nanotiges d’or</td></tr> <tr><td>(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-bromure de triméthylammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>Pour modifier des nanotiges d’or avec des composés d’ammonium quaternaire</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Pour solubiliser (11-mercaptoundécyl)-N,N,N-bromure de triméthylammonium</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Pour centrifuger les nanotiges d’or pégylées</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Pour suspendre les nanotiges d’or avant l’incubation avec des cellules et pour traiter les pastilles de cellules</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Lignée cellulaire murine monocyte/macrophage</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>À ajouter au milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>À ajouter au milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>À ajouter au milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Culture cellulaire Racleur</td></tr><tr><td>de cellules</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>Pour détacher les cellules</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>Pour fixer les cellules</td></tr><tr><td>Chitosane, de faible poids moléculaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>désacétylé à 75-85 %. Poids moléculaire environ 120 000 Da.</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>Pour insolubiliser le chitosane et générer l’hydrogel</td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire en polystyrène</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Utilisé comme moule pour fabriquer des hydrogels de chitosane</td></tr><tr><td>Oscillateur paramétrique optique pompé par la troisième harmonique d’un laser Nd :YAG Q-switched</td><td>Continuum, Santa Clara, USA</td><td>Surelite OPO plus</td><td>Source d’excitation optique pour les tests photoacoustiques</td></tr><tr><td>Détecteur pyroélectrique&nbsp ;</td><td>Gentec, Québec, Canada</td><td>QE8SP</td><td>Pour surveiller la fluence optique pour les tests photoacoustiques</td></tr><tr><td>Hydrophone à aiguille pré-amplifié</td><td>Precision Acoustic, Dorset, Royaume-Uni</td><td>Modèle avec diamètre de capteur de 1 mm et gamme de fréquences de 1 à 20 MHz</td><td>Pour mesurer les signaux photoacoustiques</td></tr></tbody></table>

préparation et photoacoustique analyse des véhicules cellulaires contenant de l&#39;or nanorods

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

nanotiges d&#39;or sont attrayants pour une gamme d&#39;applications biomédicales telles que l&#39;ablation photothermique et l&#39;imagerie photoacoustique du cancer, grâce à leur absorbance optique intense dans la fenêtre proche infrarouge, une faible cytotoxicité et le potentiel de la maison dans les tumeurs. Cependant, leur livraison à des tumeurs reste encore un problème. Une approche innovante consiste en l&#39;exploitation du tropisme des macrophages associés aux tumeurs qui peut être chargé avec nanotiges d&#39;or in vitro. Ici, nous décrivons la préparation et l&#39;inspection photoacoustique des véhicules cellulaires contenant nanotiges d&#39;or. PEGylés nanotiges d&#39;or sont modifiées avec des composés d&#39;ammonium quaternaire, afin d&#39;obtenir un profil cationique. En cas de contact avec les macrophages murins dans des boîtes de Petri ordinaires, ces particules se trouvent à subir une utilisation massive dans des vésicules d&#39;endocytose. Ensuite, ces cellules sont noyés dans des hydrogels biopolymères, qui sont utilisés pour vérifier que la stabilité de la conversion photoacoustiquedes particules est retenue dans leur inclusion dans des véhicules cellulaires. Nous sommes convaincus que ces résultats peuvent fournir une nouvelle source d&#39;inspiration pour le développement de nouvelles stratégies pour délivrer des particules plasmoniques à des tumeurs.

Ici, la faisabilité des véhicules cellulaires contenant nanotiges d&#39;or pour l&#39;imagerie PA du cancer est montré ainsi que les résultats typiques du protocole. Les images TEM dans la figure 1 montrent l&#39;aspect habituel des particules après l&#39; étape 1 et de leurs véhicules cellulaires après l&#39; étape 2. La préparation des particules et des cellules pour l&#39; imagerie TEM est décrit ailleurs <...

Nous montrons la préparation et abordons la faisabilité de véhicules cellulaires contenant des nanotiges d’or pour l’imagerie photoacoustique du cancer.

Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de l&#39;or nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser des véhicules cellulaires contenant des nanobâtonnets d'or comme stratégie innovante pour acheminer des particules plasmoniques vers des tumeurs. Notre protocole peut aider à répondre à des questions clés concernant le développement d'approches photoacoustiques et photothermiques pour l'imagerie et le traitement du cancer à l'aide d'agents de contraste exogènes. Cette méthode repose sur le tropisme des microphages associés aux tumeurs pour acheminer les particules plasmoniques vers les tumeurs.L'idée consiste à isoler ces cellules à partir d'un patient, à les charger in vitro avec des particules plasmoniques, puis à les réinjecter dans leur hôte dans le but de les utiliser comme réservoirs d'œstrogènes. L'un des avantages de cette approche est la possibilité d'obtenir un meilleur contrôle sur la stabilité optique et biochimique des particules, car leur interface biologique est entièrement construite in vitro. Pour commencer, purifiez six millilitres de nanobâtonnets d'or capés au cétrominium à une concentration en or de 450 micromolaire, en utilisant deux centrifugations, suivies d'un décantage et d'un lavage dans du bromure de cétrominium aqueux à 500 micromolaire.Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de tampon acétate 100 millimolaire contenant du bromure de cétrimonium et du polysorbate 20 dans le récipient contenant le culot de particules d'or. Puis, ajoutez 7,5 microlitres de polyéthylène glycol alpha-méthoxy-omega-mercapto 10 millimolaire dans l'eau et laissez réagir pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres de bromure de mercaptoundécyl triméthylammonium 100 millimolaire dans le diméthylsulfoxyde.Ensuite, laisser la réaction reposer pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, ajouter 4,5 millilitres de polysorbate 20 à 0,005 % dans l'eau. Maintenant, à l'aide de cette solution douce de polysorbate 20, purifier les particules en utilisant quatre cycles de centrifugation et de décantation.Enfin, transférez les particules dans 600 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate stérile. La concentration nominale d'or doit désormais être de 4,5 millimolaire. Pour préparer les cellules, ensemencez deux boîtes de 60 millimètres avec un demi-million de cellules macrophagiques monocytaire dans un milieu de Dulbecco modifié complété et faites-les croître pendant 24 heures.Après 24 heures, remplacez le milieu cellulaire par du milieu frais, supplémenté avec les nanobâtonnets d'or cationiques préparés, pour une concentration finale de 100 micromolaire d'or dans chaque boîte de Pétri. Poursuivez ensuite l'incubation pendant encore 24 heures. Le jour suivant, examinez les cellules au microscope.Elles doivent présenter une morphologie normale et de nombreuses vésicules intracellulaires sombres. Si les cellules ont un bon aspect, lavez-les avec du milieu frais, détachez-les à l’aide d’un racloir et regroupez les cellules provenant de deux boîtes pour obtenir au moins deux millions de cellules dans un même échantillon. Ensuite, centrifugez les échantillons à 120 G pendant 6 minutes afin d’éliminer tout excès de nanobâtonnets d’or cationiques.Jetez les surnageants. Les culots cellulaires doivent apparaître presque noirs. Suspendez les culots dans deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate et dénombrez les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer.Ensuite, mélanger les suspensions contenant deux millions de cellules et centrifuger à 120 G pendant six minutes. Resuspendre les culots dans deux millilitres de formaldéhyde à 3,6 % dans une solution saline tamponnée au phosphate, et laisser fixer les cellules pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, éliminer le fixateur par trois lavages avec une solution saline tamponnée au phosphate.Un jour avant de commencer cette procédure, préparez 500 microlitres d'une solution acide de chitosane à faible masse moléculaire à 3 % en poids par volume. Ajustez le pH à 4,5 par ajout d'acide acétique. Pour bien mélanger la solution, laissez-la homogénéiser pendant 24 heures à 40 degrés Celsius.Le lendemain, mélanger les macrophages murins préparés avec les nanobâtonnets d'or avec les 500 microlitres de la solution de chitosane. Afin d'obtenir des fantômes de 50 microns d'épaisseur, charger 250 milligrammes du mélange dans des moules en polystyrène de 1,9 centimètre carré. Laisser reposer les échantillons sous une hotte pendant 24 heures.Le lendemain, traitez les échantillons avec 500 microlitres d'hydroxyde de sodium aqueux 1 molaire, afin d'induire la réticulation, puis rincez-les avec 10 millilitres d'eau ultra-pure. Analysez la stabilité de la conversion photoacoustique à l'aide d'un microscope photoacoustique sur mesure, équipé d'un oscillateur paramétrique optique, d'un atténuateur permettant de régler le flux optique et d'un transducteur ultrasonore. Commencez par suspendre le film de chitosane contenant les macrophages dans de l'eau déionisée à l'aide d'un support en plastique immergé dans un réservoir d'eau.Déterminez un fluence de sonde qui n'endommage pas l'échantillon et qui produit une émission photoacoustique avec un rapport signal-sur-bruit suffisant. Réglez un fluence d'essai et les paramètres d'acquisition. Pour chaque impulsion provenant du laser, enregistrez le signal photoacoustique correspondant provenant du transducteur ultrasonore.Calculez le rapport entre l'intensité photoacoustique et le fluence laser pour chaque impulsion. Analysez son évolution en fonction du nombre d'impulsions et vérifiez sa stabilité au cours du temps. En cas d'instabilité, répétez cette mesure avec un fluence d'essai plus faible.Dans le cas de stabilité, la fluence d'essai peut être utilisée comme fluence de sonde, à condition que son émission photoacoustique présente un rapport signal-sur-bruit approprié. Ensuite, mesurer une fluence seuil de remodelage. Choisir un point aléatoire de l'échantillon, régler le laser à la fluence de sonde et mesurer une intensité photoacoustique moyenne, A, sur 500 impulsions.Ensuite, augmentez le fluence nominal au-dessus du fluence de la sonde et délivrez 50 impulsions. Nommez leur fluence moyen F excitation. Réinitialisez le laser au fluence de la sonde et répétez la mesure, en prenant l'intensité photoacoustique moyenne, B, sur 500 impulsions.Maintenant, calculez le rapport R de B à A. Une valeur de R inférieure à l'unité indique qu'un changement irréversible s'est produit dans les propriétés optiques de l'échantillon. Ensuite, utilisez le plateau micrométrique pour déplacer le film et modifier aléatoirement le point de mesure de l'échantillon. Puis, répétez la mesure de R pour différentes valeurs de l'excitation F, afin d'obtenir plusieurs valeurs de R autour et en dessous de l'unité.Environ 15 points R constituent une collection raisonnable de données. Ensuite, tracer R en fonction de l'excitation F et identifier le seuil de remodelage comme étant le fluence pour lequel R s'écarte de l'unité sans incertitude. Généralement, les nanobâtonnets d'or cationiques subissent une accumulation massive dans les macrophages, qui conservent leur morphologie normale.Les particules se trouvent confinées dans des vésicules endocytiques étroites. Plus tard au cours du processus, l'inclusion dans l'hydrogel de chitosane ne semble pas affecter la morphologie cellulaire. Les cellules sont bien dispersées dans tout l'échantillon, comme observé sur une micrographie.Les contrôles des films de chitosane contenant des nanobâtonnets d'or sans cellules sont homogènes. Les bandes plasmoniques des nanobâtonnets d'or sont préservées dans leurs véhicules cellulaires. Des effets tels que le couplage plasmonique ou une absorption différente de particules de taille et de forme différentes n'ont pas joué un rôle important dans ces protocoles.Après la collecte des données, la tendance de R en fonction de l'excitation de F donne une indication sur les données et l'analyse nécessaires pour déterminer le seuil de F. Ici, le seuil de F a été déterminé à environ 11 millijoules par centimètre carré. Les mesures photoacoustiques étaient très précises, avec un rapport signal-sur-bruit supérieur à 20 sur 500 impulsions.Notre protocole est innovant par rapport aux méthodes existantes en ce qui concerne la conception des particules et l'étude de leur photostabilité. La modification de nanobâtonnets d'or PEGylés par des cations d'ammonium quaternaire assure une efficacité élevée d'absorption cellulaire tout en maintenant la stabilité colloïdale. La mesure de la stabilité de la conversion photoacoustique par la définition du seuil de remodelage est quantitative et reproductible.Étant donné que ces particules sont destinées à servir d'agents de contraste pour l'imagerie photoacoustique, une sonde photoacoustique est idéale pour tester leurs caractéristiques fonctionnelles. Les véhicules cellulaires de particules plasmoniques sont visibles comme agents de contraste pour l'imagerie photoacoustique. Leur photostabilité est identique à celle des particules plasmoniques libres.L'objectif de nos travaux actuels porte sur la physiologie de ces cellules, en accordant une attention particulière à leur viabilité et à leur activité chimiotactique.

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Bioingénierie

Nous avons synthétisé nanostars étoile d'or en forme en utilisant une méthode de graines d'argent médiation croissance. Le diamètre de la nanostars varie de 200 à 300 nm et le nombre de conseils varient de 7 à 10. Les nanoparticules ont une surface large résonance plasmonique de mode centré dans le proche infrarouge.

Or Nanostar synthèse avec une méthode de graines Silver croissance Mediated

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de microscopie à fond noir (DFM) combinée à l’analyse de suivi des particules uniques (SPT) pour surveiller l’interaction des nanotiges d’or plasmoniques avec la membrane cellulaire d’une lignée cellulaire d’intérêt spécifique. L’analyse combinée DFM et SPT permet de visualiser le mouvement des nanobâtonnets à travers la membrane cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Microscopie à fond noir pour visualiser la dynamique de diffusion de nanobâtonnets sur la membrane cellulaire

Nous rapportons sur les techniques à micromotif nanoporeux films minces d'or via l'impression par stencil et la photolithographie, ainsi que des méthodes pour cultiver des cellules sur les modèles micro-usinés. En outre, nous décrivons des méthodes d'analyse d'images pour caractériser la morphologie du matériau et des cellules cultivées à l'aide électronique à balayage et les techniques de microscopie à fluorescence.

Microfabrication de Patterns d&#39;or nanoporeux d&#39;études sur l&#39;interaction cellule-matériau

Ce protocole décrit comment utiliser le chauffage transitoire associé à l’absorption optique de nanotiges d’or pour stimuler la différenciation et l’activité intracellulaire du calcium dans les cellules neuronales. Ces résultats ouvrent potentiellement de nouvelles applications dans les prothèses neurales et les études fondamentales en neurosciences.

Or nanotige assistée stimulation optique des cellules neuronales

Nous décrivons un procédé simple pour la production d'agrégats oligomères hautement stable de nanoparticules d'or par l'intermédiaire de la réduction de l'acide chloroaurique (HAuCl 4) avec du thiocyanate de sodium (NaSCN). Les oligoclusters ont une distribution de taille étroite et peuvent être produits avec un large éventail de tailles et de couches de surface.

Une méthode simple pour la Taille synthèse contrôlée de Stable oligomères grappes de nanoparticules d&#39;or dans des conditions ambiantes

Ce protocole décrit un procédé de préparation simple pour nanoparticules d'or intégré liposomes photosensibles avec les matériaux disponibles dans le commerce. Il montre également comment évaluer le processus de cavitation de microbulles des liposomes de synthèse sur le traitement de laser pulsé.

Synthèse de l&#39;or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation

Le présent document décrit un protocole pour la synthèse des nanotubes d'or, basée sur l'utilisation d'hydroquinone à titre d'agent réducteur, ainsi que les différents mécanismes de contrôle de leur taille et rapport d'aspect.

Hydroquinone Based Synthèse de l&#39;or nanorods

Nous décrivons une méthode de synthèse de nanoparticules or biocompatibles de 10 nm, fonctionnalisés par revêtement poly-éthylène glycol sur la surface. Ces particules peuvent être utilisés in vitro et in vivo pour livrer des produits thérapeutiques à échelle nanométrique des espaces cellulaires et extracellulaires qui sont difficiles d’accès avec des tailles de nanoparticules classiques.

Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS

Plasmoniques nanotiges en or peut être pris au piège dans les liquides et tourné aux fréquences kHz à l’aide de pinces optiques polarisées circulairement. Présentant les outils d’analyse de la dynamique brownienne et léger scatteringspectroscopy conduit à un puissant système de recherche et d’application dans de nombreux domaines de la science.

Construction et exploitation d’un système de moteur axée sur la lumière or nanotige Rotary

Une méthode fiable et facilement reproductible pour la préparation de neurocomanes d’or photoluminescents fonctionnables et de leur détection directe à l’intérieur des cellules HeLa par cytométrie de flux et microscopie confocale de balayage laser est décrite.

Synthèse des nanoamas d’or électroluminescents électroluminescents pour les applications biologiques

Ici, nous montrons l’utilisation de la microscopie traditionnelle en champ sombre pour surveiller la dynamique des nanorods d’or (AuNRs) sur la membrane cellulaire. L’emplacement et l’orientation des aunrs simples sont détectés à l’aide d’ImageJ et de MATLAB, et les états diffusifs des AuNRs sont caractérisés par une analyse unique du suivi des particules.

Visualisation de la dynamique diffusionnelle des nanorods d’or sur la membrane cellulaire à l’aide d’une microscopie darkfield nanoparticule unique

Découvrez la préparation de véhicules cellulaires contenant des nanobâtonnets d'or pour l'imagerie photoacoustique des tumeurs. Cette méthode utilise les macrophages pour améliorer la stabilité des agents de contraste.

Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de l'or nanorods

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