Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

L'objectif général de cette procédure est de détecter la quantité d'un ARNm spécifique provenant de cellules tumorales dans le poumon, comme méthode d'analyse de la métastase. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue une mesure quantitative de la métastase. Pour réaliser une dissection pulmonaire, après avoir euthanasié une souris à l'aide d'une dose létale d'isoflurane conformément au protocole indiqué, placez la souris sur une planche en mousse, en position dorsale, avec les membres étendus, puis fixez-la à la planche à l'aide d'épingles de dissection.

Après avoir pulvérisé la souris avec de l'éthanol, utilisez une pince pour saisir la partie inférieure de l'animal au niveau du centre, puis, avec des ciseaux, incisez vers le haut en direction du cou à travers la peau, en prenant soin de ne pas percer la cavité péritonéale de la souris. Saisissez maintenant le péritoine à l'extrémité inférieure de l'animal et commencez à inciser vers le haut jusqu'à la base du cou. Incisez soigneusement le long des côtés gauche et droit de la cage thoracique, en veillant à ne pas sectionner les vaisseaux sanguins qui pourraient saigner dans la cavité thoracique.

Retirez les os des côtes en coupant à gauche et à droite, à travers le diaphragme et les parties supérieures de la cage thoracique. Ensuite, à l’aide de pinces, saisissez la trachée de la souris et tirez vers l’avant, puis utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner la trachée avant de retirer les poumons de la souris. Utilisez du PBS pour rincer délicatement le tissu pulmonaire.

Ensuite, après l'évaluation macroscopique du tissu pulmonaire conformément au protocole écrit, si les poumons doivent être analysés immédiatement, passez à l'isolement de l'ARN. Pour isoler l'ARN à partir du tissu, commencez par homogénéiser le tissu en utilisant l'une des méthodes indiquées dans le protocole écrit. Préparez le tampon de lyse à partir d'un kit d'isolement de l'ARN, puis ajoutez 20 microlitres de captoéthanol tumoral à chaque millilitre de tampon de lyse.

Ressuspendre tous les 30 grammes de tissu dans 300 microlitres de tampon de lyse, puis soniquer le tissu pendant 10 secondes avec un sonicateur réglé à 30 % d'amplitude. Ajouter 10 microlitres de protéinase K à 590 microlitres de tampon TE, puis ajouter 600 microlitres de ce tampon à 300 microlitres de tissu soniqué. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, centrifuger les échantillons à une force gravitationnelle supérieure ou égale à 13 000 ×g pendant 10 minutes afin d'éliminer les débris. Puis transférer le surnageant dans de nouveaux tubes. Ajouter 450 microlitres d'éthanol à chaque 900 microlitres de surnageant pour précipiter l'ARN.

Ensuite, transférez 700 microlitres du mélange lysat-éthanol sur une colonne à ARN. Faites une nouvelle centrifugation à une vitesse supérieure ou égale à 13 000 ×g pendant une minute afin de fixer l'ARN sur la colonne. Puis jetez le liquide résiduaire et ajoutez le surnageant restant sur la colonne, puis effectuez une nouvelle centrifugation.

Ensuite, ajoutez 350 microlitres de tampon de lavage un dans la partie supérieure de la colonne, puis centrifugez les échantillons pendant 30 secondes. Jetez le liquide résiduaire et replacez la colonne dans le tube. Préparez la DNase en mélangeant cinq unités d'enzyme DNase un avec cinq microlitres de tampon DNase 10X et 40 microlitres d'eau sans DNase ni RNase par échantillon.

Ajouter 50 microlitres de mélange d'ADNase à chaque colonne, puis incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, ajouter 350 microlitres de tampon de lavage un aux colonnes et centrifuger les échantillons pendant 30 secondes. Après avoir éliminé la solution de déchets, ajouter 600 microlitres de tampon de lavage deux et centrifuger pendant 30 secondes supplémentaires.

Jetez le liquide avant d'ajouter 250 microlitres de tampon de lavage deux, puis centrifugez pendant deux minutes. Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte et ajoutez 50 à 100 microlitres d'eau sans RNase ni DNase sur la colonne. Après une incubation d'une minute, centrifugez pendant une minute.

Repasser l'éluat recueilli à travers la colonne afin d'augmenter le rendement en ARN. Pour une utilisation immédiate, maintenir les échantillons sur de la glace. Pour une utilisation ultérieure, les congeler rapidement sur de la glace sèche ou dans de l'azote liquide, puis les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.

À l'aide d'un spectrophotomètre, quantifiez l'ARN. Ensuite, dans des tubes ou plaques PCR stériles, sans RNase ni DNase, utilisez de 0,5 à 2 microgrammes d'ARN total pour préparer le mélange de réaction pour la première transynthèse, comme indiqué dans ce tableau. Mélangez et centrifugez doucement, puis programmez un thermocycleur standard selon le programme indiqué ici.

Lorsque la réaction est terminée, utilisez de l'eau stérile et sans nucléase pour diluer la réaction terminée au volume souhaité. Pour réaliser une PCR en temps réel, utilisez un ADNc témoin positif, tel que l'ADNc humain de HER2, afin d'établir une courbe standard pour chaque jeu d'amorces en préparant de une à quatre dilutions sérielles de l'ADNc pour générer cinq étalons. Ensuite, calculez le nombre total d'échantillons, qui doit inclure la courbe standard et les échantillons expérimentaux.

Ensuite, dans des tubes stériles sans RNase ni DNase, préparez un mélange maître pour chaque gène expérimental d'intérêt, ainsi que pour un témoin interne, tel que gapdh. Préparez une plaque de test contenant un microlitre de DNase C pour chaque échantillon standard ou expérimental. Allouez au moins un échantillon d'ADNc par puits, pour chaque couple amorces-sonde.

Ajouter 19 microlitres de mix maître par puits, pour chaque amorce-sonde. Cette expérience de bioluminescence démontre que les poumons de souris traités avec l'ACT1, qui cible la protéine des jonctions gap Connexine 43, apparaissent négatifs pour l'activité de la luciférase, suggérant l'absence de cellules tumorales dans le tissu. Toutefois, l'analyse des coupes H&E du tissu pulmonaire révèle des micrométastases qui n'ont pas été mises en évidence par la luciférase, ce qui indique que l'imagerie par luciférase n'est pas suffisamment sensible pour détecter de faibles nombres de cellules tumorales.

Les résultats présentés ici proviennent d'une expérience de qRT-PCR utilisant une sonde spécifique de HER2 afin de détecter les cellules tumorales humaines HER2 et JIMT1 dans le tissu pulmonaire à partir de cellules initialement transplantées dans la couche grasse mammaire de la souris. Bien qu'aucune métastase visiblement apparente n'ait été observée sur l'un des poumons, la qRT-PCR a détecté des métastases dans deux des onze échantillons. Sur cette figure, une analyse par courbe standard a été réalisée afin de déterminer les niveaux relatifs de HER2 normalisés par rapport à l'ARNm de gapdh pulmonaire murin dans une série de nombres cellulaires.

Les résultats indiquent que la qRT-PCR, utilisant la sonde HER2, était suffisamment sensible pour détecter les niveaux de HER2 dans aussi peu que 10 cellules. Enfin, cette analyse de régression montre le nombre relatif de cellules dans chaque échantillon pulmonaire, y compris les contrôles positifs et négatifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit heures, si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre des précautions pour préserver l'intégrité de l'ARN pendant l'isolement de l'ARN et la réaction de la transcriptase inverse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment détecter les métastases dans un tissu pulmonaire entier par PCR quantitative en temps réel.