Name: Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Apprenez à quantifier les métastases pulmonaires chez les modèles murins de cancer du sein par PCR quantitative en temps réel. Cette méthode détecte l'ARNm tumoral spécifique pour mesurer précisément la progression métastatique.

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Le laboratoire Yeh est soutenu par un financement de la recherche à partir d&#39;un American Cancer Society institutionnel de subventions de recherche (IRG-97-219-14) sera décerné au Cancer Center Hollings à la MUSC, par le financement de la recherche à partir d&#39;un Département de la Défense subvention (W81XWH-11-2- 0229) à la MUSC, et par un prix de la Fondation Concern (à ESY).

Le protocole suit les lignes directrices et les normes de protection des animaux de l&#39;Université médicale de Caroline du Sud (MUSC) et son institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Dissection de la tumeur mammaire (en option selon les objectifs de l&#39;étude et si l&#39;analyse de la tumeur primaire ou veine de la queue injection a été effectuée). <ol><li> Euthanasier la souris en utilisant une dose létale de l&#39;isoflurane selon IACUC et la réglementation de l&#39;université. Confirmez euthanasie par dislocation chirurgicale. </li><li> Le panneau de mousse, broches avec broches de dissection en plaçant la souris sur son dos avec des membres propagation. </li><li> Pulvériser souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> En utilisant des pinces, saisir la partie inférieure de l&#39;animal au centre. </li><li> Utilisation de ciseaux, couper vers le haut vers le cou à travers la peau, en faisant attention de ne pas percer la cavité péritonéale de la souris. </li><li> Coupez la peau sur les jambes pour révéler le tissu tumoral. </li><li> Disséquer les tissus tumoraux et prÉSERVE par la méthode préférée, telles que le gel ou la fixation, pour une analyse ultérieure (pas discuté plus loin dans ce protocole). </li></ol></li><li> Lung dissection des tissus. <ol><li> Si le tissu tumoral a été récolté comme décrit ci-dessus, cerner tout excès de peau. </li><li> En utilisant des pinces, saisir péritoine à l&#39;extrémité inférieure de l&#39;animal et de commencer à couper vers le haut vers la base du cou. </li><li> Découpez soigneusement le long des côtés gauche et droit de la cage thoracique en faisant attention d&#39;éviter la rupture des vaisseaux sanguins qui peuvent saigner dans la cavité thoracique. Retirez les os des côtes en coupant à gauche et à droite à travers le diaphragme et supérieures des parties de la cage thoracique. </li><li> En utilisant des pinces saisir la trachée de la souris et tirer vers l&#39;avant. </li><li> Couper la trachée avec des ciseaux de dissection et de supprimer les poumons de souris. Remarque: Le cœur peut rester attaché au poumon. Si cela se produit, disséquer soigneusement coeur loin des poumons en prenant soin de collecter toutes les cinq lobes (voir la figure 1 </strong&gt;). </li><li> Lavez délicatement avec du PBS pour éliminer l&#39;excès de sang. </li></ol></li><li> Évaluation brute de tissu pulmonaire. <ol><li> Option 1: Dans l&#39;imagerie in vivo. <ol><li> Pour l&#39;imagerie de la luciférase, ~ 10 min avant l&#39;imagerie, les animaux donner une dose de 150 mg / kg de la luciférine par intraperitoneale (ip) injection. Poumons de l&#39;image in vivo chez des animaux anesthésiés ou lors de l&#39;enlèvement après dissection (figure 2) 5. </li></ol></li><li> Option 2: l&#39;évaluation brute. <ol><li> Examiner les poumons sous microscope stéréo pour visualiser nodules tumoraux. Remarque: Si les cellules sont GFP étiqueté, un stéréomicroscope capable de fluorescence contenant un cube de lumière avec des maxima d&#39;excitation / émission approprié (par exemple, près de 470/510 nm) pour détecter la GFP peut être utilisé pour examiner les poumons stéréoscopique pour la fluorescence avant le traitement. </li></ol></li><li> Si les poumons doivent être analysés immédiatement, passez à la section «RNA Isolation &#39;. Sinon, snap tissus gel utilisant LIQUazote id ou de la glace sèche. Conserver à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Isolement de l&#39;ARN Remarque: Pour l&#39;analyse représentative, ARN a été isolé en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ARN (voir liste des matières). Bien que l&#39;analyse actuelle utilise le produit d&#39;un fabricant spécifique, une variété de kits d&#39;isolement sont disponibles auprès de plusieurs fournisseurs dignes de confiance. En outre, des procédés de centrifugation à base non-kit sont également une option. ADNc devrait également être préparé à partir d&#39;un échantillon d&#39;ARN témoin positif, par exemple une lignée cellulaire ou un plasmide, par analyse de la courbe étalon. Alternativement, un contrôle positif spécifique pour l&#39;amorce sonde jeu peut être acheté (voir liste des matières). <ol><li> Si vous utilisez un tissu préalablement congelé, recueillir des tissus congelés sur glace sèche. </li><li> Homogénéiser les tissus en utilisant l&#39;une des méthodes suivantes telles que: mortier et un pilon de broyage effectué à la main sur de la glace sèche après le tissu dans de l&#39;azote liquide de congélation; homogénéisateur de tissu ou dispositif de dissociation mécaniquepar la suggestion du fabricant; traitement aux ultrasons, ou toute autre méthode préférée. Remarque: Pour l&#39;analyse représentative, la méthode préférée d&#39;homogénéisation est sonication. <ol><li> Pour l&#39;analyse présentée dans la figure 3, préparer un tampon de lyse (fourni dans le kit d&#39;isolement d&#39;ARN) et du 2-mercaptoéthanol à raison de 20 pl de 2-mercaptoéthanol pour chaque 1 ml de tampon de lyse. Tissu Remettre en suspension dans 300 pi de tampon de lyse supplémenté avec 2-mercaptoéthanol pour chaque 30 g de tissu et soniquer pendant 10 sec avec sonicator fixé à 30% d&#39;amplitude. </li><li> Si vous utilisez mortier et un pilon, tissu fondamental de remettre en suspension dans un tampon de lyse 300 pi après broyage. </li></ol></li><li> Ajouter 10 pi de proteinase K à 590 ul de tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Ajouter la solution K 600 pi de proteinase à tous les 300 pi (ie pour chaque 30 mg) de tissu. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Note: Le temps de digestion peut varier. </li><li> Centrifuger les échantillons à ≥13000 g pendant 10 min pour éliminer les débris. </li><li> Transférer le surnageant dans des tubes neufs. </li><li> Ajouter 450 ul d&#39;éthanol (96% -100%) pour chaque tranche de 900 ul de surnageant pour précipiter l&#39;ARN. </li><li> Transférer 700 pl de mélange lysat / éthanol à la colonne. </li><li> Centrifuger les échantillons à ≥13,000 g pendant 1 min à ARN se lient à la colonne. </li><li> Jeter les déchets liquides et ajouter le reste du surnageant à la colonne et tourner à nouveau. </li><li> Une fois que tout le lysat est mis en rotation à travers la colonne, ajouter 350 ul de tampon de lavage 1 de la partie supérieure des échantillons de colonne et centrifuger à ≥13,000 g pendant 30 s. </li><li> Jeter le liquide de la colonne et de remplacer la partie supérieure. </li><li> Préparer DNase en mélangeant 5 unités de DNase I enzyme avec 5 pi de DNase 10x et 40 pi de DNase / RNase eau libre par échantillon (volume total de 50 pl / échantillon). </li><li> Ajouter 50 ul de DNase se mélangent à chaque colonne et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 350 pi de tampon de lavage 1 à la colonne et centrifuger samples à ≥13,000 g pendant 30 sec. </li><li> Jeter le liquide de la colonne et de remplacer la partie supérieure. </li><li> Ajouter 600 pi de tampon de lavage 2 à la colonne et tourner 30 secondes à ≥13,000 g. </li><li> Jeter le liquide de la colonne et de remplacer la partie supérieure. </li><li> Ajouter 250 pi de tampon de lavage 2 et centrifuger 2 min à ≥13,000 g. </li><li> Mettre une partie de colonne dans nouveau tube collecteur et jeter ancien tube collecteur. </li><li> Ajouter 50-100 ul de RNase / DNase eau libre à la colonne et incuber pendant 1 min. </li><li> Spin pendant 1 min à ≥13,000 g. </li><li> Re-exécuter éluat recueillies à travers la colonne pour augmenter le rendement de l&#39;ARN. </li><li> Pour une utilisation immédiate, conserver des échantillons sur la glace et de procéder à la quantification. Pour une utilisation ultérieure, snap gel de la neige carbonique ou de l&#39;azote liquide. Conserver à -80 ° C congélateur jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> 3. First Strand Synthesis Remarque: Pour l&#39;analyse représentative, la transcriptase inverse (RT) a été réalisée une réaction Fkit de synthèse IRST Strand ADNc conçu pour QRT-PCR (voir la liste des matériaux). <ol><li> Si les échantillons ont déjà été prélevés, dégeler tubes sur la glace. </li><li> Mesurer la quantité d&#39;ARN en utilisant un spectrophotomètre. </li><li> Utilisation de 0,5-2 ug d&#39;ARN total, effectuez d&#39;abord la synthèse du brin utilisant la transcriptase inverse pour générer des ADNc stock. <ol><li> Dans tubes / PCR sans DNase RNase / plaques stériles, préparer le mélange de réaction (Tableau 1). Mélanger délicatement et centrifuger. Programmer une machine de PCR standard (Tableau 2). </li></ol></li><li> Diluer réaction fini au volume désiré (généralement 50-100 pi) avec de l&#39;eau sans nucléase stérile. </li></ol> 4. PCR en temps réel Remarque: Pour l&#39;analyse représentative, SYBR verte a été utilisée. Cependant, toute méthode préférée peut être substitué à la discrétion de l&#39;utilisateur. <ol><li> Utilisation d&#39;un ADNc de contrôle positif, mettre en place une courbe standard pour chaque jeu d&#39;amorces. <ol><li> Pour l&#39;analyse montre in Figure 3, préparer la courbe standard pour HER2 humain en utilisant recommandée par le fabricant ADNc de contrôle positif (voir liste des matières). Pour GAPDH de la souris, utiliser l&#39;ADNc contrôle négatif du poumon pour générer une courbe standard. Pour chaque sonde, diluer en série l&#39;ADNc 1: 4 pour générer 5 normes. </li></ol></li><li> Calculer le nombre d&#39;échantillons totaux, qui devrait inclure la courbe standard et échantillons expérimentaux. Remarque: Pour l&#39;analyse décrite ici, 2-3 répétitions expérimentales par échantillon ont été analysés. Norme analyse de la courbe a été effectuée pour générer un modèle de régression linéaire simple qui peut être appliqué pour déterminer la quantité relative de HER2 et GAPDH par échantillon pour calculer la quantité normalisée finale. Cette analyse fera également en sorte que le rendement de l&#39;amorce est adéquate pour l&#39;analyse à portée de main. </li><li> Dans un / tube stérile, RNase DNase, préparer Master Mix (tableau 3). <ol><li> Calculer master mix Amount par échantillon. Redoubler d&#39;efforts pour plus d&#39;un échantillon. Utilisez un mélange maître pour chaque gène expérimentale d&#39;intérêt, ainsi que d&#39;un contrôle interne tels que GAPDH. Utilisation des amorces pour GAPDH à une concentration finale de 200 nM. Remarque: Le contrôle interne est particulièrement utile quand on essaie de faire la distinction entre l&#39;origine des cellules humaines et de souris. Remarque: la concentration de la Reine pour HER2 a été optimisé et déterminée par le fabricant. </li></ol></li><li> Préparer plaque d&#39;essai contenant 1 pl des ADNc correspondant à chaque échantillon standard ou expérimentale. Allouer au moins 1 ADNc échantillon / puits pour chaque sonde primaire. Ajouter 19 pi de mélange maître par puits pour chaque sonde primaire. Remarque: Pour les données représentatives de la figure 3, les échantillons d&#39;ADNc ont été analysés en double pour chaque sonde primaire et tracées à la moyenne des deux échantillons. </li><li> Exécutez réaction dans la machine QRT-PCR en utilisant recommandé ou déjà testé le protocole PCR. Voir le tableau 4 </strong&gt; pour le protocole PCR utilisée pour les données représentatives de la figure 3 et la figure 4. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY et MAA sont pas employés par FirstString Research Inc. et ne détiennent aucun intérêt financier dans la société. FirstString Research Inc. a fourni les données d&#39;imagerie luciférase qui a été présenté dans ce manuscrit. GSG est président et chef de la direction de FirstString recherche. CLG est un employé de FirstString recherche. GSG et CLG ont des options de souscription d&#39;actions émises par FirstString recherche.

Ce protocole décrit l&#39;utilisation de QRT-PCR pour évaluer mammaire métastatique des cellules tumorales dans le poumon en utilisant un modèle de xénogreffe de souris. Il est reconnu que d&#39;autres techniques, y compris l&#39;imagerie bioluminescente, sont disponibles et sont également efficaces pour détecter les métastases malgré leurs propres valeurs et limites. Les données présentées suggèrent que QRT-PCR fournit une mesure efficace de la détection de l&#39;ARNm d&#39;origine tumorale dans le tissu pulmonaire pou...

Analyse QRT-PCR est proposée comme méthode d&#39;évaluation de la métastase tumorale. Cette méthode est proposé comme une alternative pour les utilisateurs qui sont intéressés à évaluer les métastases, mais peuvent ne pas avoir accès à des équipements spécifiques tels que les équipements d&#39;imagerie in vivo ou un stéréoscope capable de fluorescence. Une discussion des méthodes couramment utilisées est présenté suivi d&#39;une démonstration de la façon dont l&#39;analyse QRT-PCR peut être utilisée soit comme distinct ou comme une méthode complémentaire pour évaluer les métastases. Cette procédure a le potentiel de fournir une analyse quantitative de la charge métastatique. Les méthodes standard d&#39;analyse brute, y compris la visualisation des poumons sous un stéréomicroscope ainsi que le sectionnement de série suivie par hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) coloration du tissu pulmonaire, sont quantifiables, mais dépendent fortement de paramètres définis par l&#39;utilisateur pour compter 2-5. Lors de l&#39;évaluation poumons entiers en utilisant une loupe binoculaire, seules les grandes métastases de surface sont visiFIL et l&#39;analyse nécessite l&#39;enquêteur d&#39;avoir une connaissance raisonnable des poumons structure anatomique pour déterminer ce qui constitue une lésion métastatique. Le marquage fluorescent des cellules tumorales avec un marqueur tel que la GFP et l&#39;utilisation d&#39;un microscope stéréoscopique qui contient un cube de lumière avec des maxima d&#39;excitation / émission approprié (par exemple, près de 470/510 nm pour GFP) assiste dans ce processus, mais seulement nodules tumoraux de surface sont détectables . En outre, la fluorescence de la contamination du sang, qui est visible dans les mêmes paramètres que la GFP, peut conduire à une fausse identification de lésions métastatiques possibles. Sectionnement du poumon, suivi par coloration H &amp; E pour visualiser une métastase pulmonaire est une méthode utile pour évaluer les micrométastases et les autres processus microscopiques, y compris l&#39;infiltration des cellules immunitaires, mais nécessite souvent l&#39;utilisation du tissu du poumon entier pour inclusion dans la paraffine, de sectionnement, et des procédures de coloration. Par conséquent, les procédures en aval ne sont pas idéales suite de cette méthoré. Bien quantifiable, cette procédure nécessite l&#39;enquêteur d&#39;évaluer un grand nombre de sections pulmonaires colorées par animal pour assurer que les comptes de l&#39;analyse de la structure du poumon 3D entier. Par conséquent, ce type d&#39;examen est consommatrice de temps, peut conduire à des erreurs de comptage, et l&#39;analyse repose largement sur la discrétion d&#39;investigateur. Plusieurs techniques d&#39;imagerie in vivo (par exemple, IRM, PET, SPECT) sont actuellement utilisés pour effectuer ou de tester les processus biologiques dans des modèles rongeurs expérimentaux 8. Dans l&#39;imagerie bioluminescente in vivo est une méthode couramment utilisée pour acquérir une vision brute de métastases 9. Cette technique est généralement appliquée pour évaluer la présence de l&#39;activité de rapporteur de luciférase due à l&#39;accumulation de cellules tumorales, qui sont conçus pour contenir un élément de réponse de la luciférase, qui résident dans des organes spécifiques tels que la glande mammaire après l&#39;implantation des cellules tumorales et les poumons lors de métastase spontanée 10. La visualisation de l&#39;activité rapporteur de la luciférase est induite par la présence du substrat de luciférine (D-luciférine). La luciférase catalyse la décarboxylation oxydative de D-luciférine pour générer oxyluciférine bioluminescence. Bien qu&#39;il soit informatif, cette méthode est limitée par plusieurs facteurs, y compris la stabilité du substrat (c.-à demi-vie courte), la distribution adéquate de substrat qui dépend de la façon dont elle est livrée à des animaux de laboratoire, et une faible sensibilité de la détection 9. Un mérite principal de cette technique est qu&#39;il est non-invasif, peut être réalisée sur des animaux vivants, et peut conduire à la détection de métastases de cellules tumorales dans des organes multiples qui peuvent ne pas avoir été normalement récoltées à dissection 9,10. Un aspect positif de vivo techniques d&#39;imagerie en est que le tissu pulmonaire est non perturbées permettant procédures secondaires comme inclusion dans la paraffine ou comme présenté ici, l&#39;analyse QRT-PCR. Toutefois, en raison QRT-PCR est theoretically une mesure plus sensible de la détection, l&#39;évaluation brute ne peut révéler un faible nombre de cellules tumorales présentes dans le poumon. Bien qu&#39;utiles, les techniques d&#39;imagerie décrites ci-dessus peuvent être substitués ou complétés par la méthode QRT-PCR actuellement décrit. QRT-PCR a le potentiel de fournir une mesure sensible de l&#39;ARNm d&#39;origine tumorale dans un poumon.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Kit d’isolement de l’ARN</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix pour QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Essai vert PrimePCR SYBR : ERBB2, Humain&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Modèle PrimePCR pour le test SYBR Green : ERBB2, Human&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh séquence d’amorces</td><td></td><td></td><td>pour-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par pcr quantitative en temps réel

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

La maladie métastatique est la propagation des cellules tumorales malignes du site primaire du cancer à un organe éloigné et est la cause principale du cancer du décès associés 1. Des sites communs de dissémination métastatique comprennent poumons, ganglions lymphatiques, le cerveau et la moelle 2. Les mécanismes qui conduisent les métastases sont des zones intenses de recherche sur le cancer. Par conséquent, les dosages efficaces pour mesurer la charge métastatique dans des sites éloignés de métastases sont essentiels pour la recherche sur le cancer. Évaluation des métastases pulmonaires dans des modèles de tumeurs mammaires est généralement effectuée par l&#39;observation qualitative brute de tissu pulmonaire après dissection. Les méthodes quantitatives d&#39;évaluation des métastases sont actuellement limités à ex vivo et des techniques d&#39;imagerie in vivo en fonction nécessitant des paramètres définis par l&#39;utilisateur. Un grand nombre de ces techniques sont au niveau de l&#39;organisme entier plutôt qu&#39;au niveau cellulaire 6.3. Bien que les nouvelles méthodes d&#39;imagerie utilisant la microscopie multi-photons sont en mesure d&#39;évaluer metasTASIS au niveau cellulaire 7, ces procédures très élégantes sont plus adaptés à l&#39;évaluation des mécanismes de diffusion plutôt que l&#39;évaluation quantitative de la charge métastatique. Ici, une méthode in vitro simple d&#39;évaluer quantitativement la métastase est présenté. Utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR), de l&#39;ARNm spécifique de cellules tumorales peut être détecté dans le tissu pulmonaire de souris.

Au-delà du temps nécessaire pour effectuer l&#39;inoculation initiale des cellules tumorales dans l&#39;animal expérimental et si la scène, primaire dans l&#39;analyse de tumeur in vivo, la récolte des tissus, l&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;analyse QRT-PCR est un procédé de 1-2 jours (Figure 1) . Un exemple d&#39;analyse est l&#39;imagerie bioluminescente brut pour évaluer les cellules...

Ce protocole décrit l&#39;utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR) pour détecter l&#39;ARNm spécifique de cellules tumorales représentant métastase dans le tissu pulmonaire de souris.

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter la quantité d'un ARNm spécifique provenant de cellules tumorales dans le poumon, comme méthode d'analyse de la métastase. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue une mesure quantitative de la métastase. Pour réaliser une dissection pulmonaire, après avoir euthanasié une souris à l'aide d'une dose létale d'isoflurane conformément au protocole indiqué, placez la souris sur une planche en mousse, en position dorsale, avec les membres étendus, puis fixez-la à la planche à l'aide d'épingles de dissection.Après avoir pulvérisé la souris avec de l'éthanol, utilisez une pince pour saisir la partie inférieure de l'animal au niveau du centre, puis, avec des ciseaux, incisez vers le haut en direction du cou à travers la peau, en prenant soin de ne pas percer la cavité péritonéale de la souris. Saisissez maintenant le péritoine à l'extrémité inférieure de l'animal et commencez à inciser vers le haut jusqu'à la base du cou. Incisez soigneusement le long des côtés gauche et droit de la cage thoracique, en veillant à ne pas sectionner les vaisseaux sanguins qui pourraient saigner dans la cavité thoracique.Retirez les os des côtes en coupant à gauche et à droite, à travers le diaphragme et les parties supérieures de la cage thoracique. Ensuite, à l’aide de pinces, saisissez la trachée de la souris et tirez vers l’avant, puis utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner la trachée avant de retirer les poumons de la souris. Utilisez du PBS pour rincer délicatement le tissu pulmonaire.Ensuite, après l'évaluation macroscopique du tissu pulmonaire conformément au protocole écrit, si les poumons doivent être analysés immédiatement, passez à l'isolement de l'ARN. Pour isoler l'ARN à partir du tissu, commencez par homogénéiser le tissu en utilisant l'une des méthodes indiquées dans le protocole écrit. Préparez le tampon de lyse à partir d'un kit d'isolement de l'ARN, puis ajoutez 20 microlitres de captoéthanol tumoral à chaque millilitre de tampon de lyse.Ressuspendre tous les 30 grammes de tissu dans 300 microlitres de tampon de lyse, puis soniquer le tissu pendant 10 secondes avec un sonicateur réglé à 30 % d'amplitude. Ajouter 10 microlitres de protéinase K à 590 microlitres de tampon TE, puis ajouter 600 microlitres de ce tampon à 300 microlitres de tissu soniqué. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes.Ensuite, centrifuger les échantillons à une force gravitationnelle supérieure ou égale à 13 000 ×g pendant 10 minutes afin d'éliminer les débris. Puis transférer le surnageant dans de nouveaux tubes. Ajouter 450 microlitres d'éthanol à chaque 900 microlitres de surnageant pour précipiter l'ARN.Ensuite, transférez 700 microlitres du mélange lysat-éthanol sur une colonne à ARN. Faites une nouvelle centrifugation à une vitesse supérieure ou égale à 13 000 ×g pendant une minute afin de fixer l'ARN sur la colonne. Puis jetez le liquide résiduaire et ajoutez le surnageant restant sur la colonne, puis effectuez une nouvelle centrifugation.Ensuite, ajoutez 350 microlitres de tampon de lavage un dans la partie supérieure de la colonne, puis centrifugez les échantillons pendant 30 secondes. Jetez le liquide résiduaire et replacez la colonne dans le tube. Préparez la DNase en mélangeant cinq unités d'enzyme DNase un avec cinq microlitres de tampon DNase 10X et 40 microlitres d'eau sans DNase ni RNase par échantillon.Ajouter 50 microlitres de mélange d'ADNase à chaque colonne, puis incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, ajouter 350 microlitres de tampon de lavage un aux colonnes et centrifuger les échantillons pendant 30 secondes. Après avoir éliminé la solution de déchets, ajouter 600 microlitres de tampon de lavage deux et centrifuger pendant 30 secondes supplémentaires.Jetez le liquide avant d'ajouter 250 microlitres de tampon de lavage deux, puis centrifugez pendant deux minutes. Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte et ajoutez 50 à 100 microlitres d'eau sans RNase ni DNase sur la colonne. Après une incubation d'une minute, centrifugez pendant une minute.Repasser l'éluat recueilli à travers la colonne afin d'augmenter le rendement en ARN. Pour une utilisation immédiate, maintenir les échantillons sur de la glace. Pour une utilisation ultérieure, les congeler rapidement sur de la glace sèche ou dans de l'azote liquide, puis les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.À l'aide d'un spectrophotomètre, quantifiez l'ARN. Ensuite, dans des tubes ou plaques PCR stériles, sans RNase ni DNase, utilisez de 0,5 à 2 microgrammes d'ARN total pour préparer le mélange de réaction pour la première transynthèse, comme indiqué dans ce tableau. Mélangez et centrifugez doucement, puis programmez un thermocycleur standard selon le programme indiqué ici.Lorsque la réaction est terminée, utilisez de l'eau stérile et sans nucléase pour diluer la réaction terminée au volume souhaité. Pour réaliser une PCR en temps réel, utilisez un ADNc témoin positif, tel que l'ADNc humain de HER2, afin d'établir une courbe standard pour chaque jeu d'amorces en préparant de une à quatre dilutions sérielles de l'ADNc pour générer cinq étalons. Ensuite, calculez le nombre total d'échantillons, qui doit inclure la courbe standard et les échantillons expérimentaux.Ensuite, dans des tubes stériles sans RNase ni DNase, préparez un mélange maître pour chaque gène expérimental d'intérêt, ainsi que pour un témoin interne, tel que gapdh. Préparez une plaque de test contenant un microlitre de DNase C pour chaque échantillon standard ou expérimental. Allouez au moins un échantillon d'ADNc par puits, pour chaque couple amorces-sonde.Ajouter 19 microlitres de mix maître par puits, pour chaque amorce-sonde. Cette expérience de bioluminescence démontre que les poumons de souris traités avec l'ACT1, qui cible la protéine des jonctions gap Connexine 43, apparaissent négatifs pour l'activité de la luciférase, suggérant l'absence de cellules tumorales dans le tissu. Toutefois, l'analyse des coupes H&E du tissu pulmonaire révèle des micrométastases qui n'ont pas été mises en évidence par la luciférase, ce qui indique que l'imagerie par luciférase n'est pas suffisamment sensible pour détecter de faibles nombres de cellules tumorales.Les résultats présentés ici proviennent d'une expérience de qRT-PCR utilisant une sonde spécifique de HER2 afin de détecter les cellules tumorales humaines HER2 et JIMT1 dans le tissu pulmonaire à partir de cellules initialement transplantées dans la couche grasse mammaire de la souris. Bien qu'aucune métastase visiblement apparente n'ait été observée sur l'un des poumons, la qRT-PCR a détecté des métastases dans deux des onze échantillons. Sur cette figure, une analyse par courbe standard a été réalisée afin de déterminer les niveaux relatifs de HER2 normalisés par rapport à l'ARNm de gapdh pulmonaire murin dans une série de nombres cellulaires.Les résultats indiquent que la qRT-PCR, utilisant la sonde HER2, était suffisamment sensible pour détecter les niveaux de HER2 dans aussi peu que 10 cellules. Enfin, cette analyse de régression montre le nombre relatif de cellules dans chaque échantillon pulmonaire, y compris les contrôles positifs et négatifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit heures, si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre des précautions pour préserver l'intégrité de l'ARN pendant l'isolement de l'ARN et la réaction de la transcriptase inverse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment détecter les métastases dans un tissu pulmonaire entier par PCR quantitative en temps réel.

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