Name: Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a quantificar metástases pulmonares em modelos tumorais mamários de camundongo usando PCR em tempo real. Este método detecta mRNA específico de células tumorais com alta sensibilidade.

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O laboratório Yeh é suportado por financiamento da investigação de uma Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional (IRG-97-219-14) concedido à Hollings Cancer Center em MUSC, pelo financiamento da pesquisa de uma concessão do Departamento de Defesa (W81XWH-11-2- 0229) em MUSC, e por um prêmio da Fundação Concern (a ESY).

O protocolo segue as diretrizes e padrões de cuidados de animais da Medical University of South Carolina (MUSC) e seu Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Dissecção do tumor mamário (opcional, dependendo objetivos do estudo e se a análise do tumor primário ou veia da cauda injeção foi realizada). <ol><li> Euthanize rato usando uma dose letal de anestesia isoflurano acordo com IACUC e regulação universidade. Confirme a eutanásia por deslocamento cirúrgico. </li><li> Na placa de espuma, o pino com pinos de dissecação, colocando o mouse sobre as suas costas com membros spread. </li><li> Spray de rato com etanol 70%. </li><li> Usando fórceps, agarrar a parte inferior do animal no centro. </li><li> Usando tesoura, corte para cima do pescoço através da pele, tendo o cuidado de não perfurar a cavidade peritoneal do rato. </li><li> Cortar pele nos membros para revelar o tecido do tumor. </li><li> Dissecar tecido tumoral e preserva por método preferido, como o congelamento ou fixação, para análise posterior (não discutido neste protocolo). </li></ol></li><li> Dissecção do tecido pulmonar. <ol><li> Se o tecido tumoral foi colhido como descrito acima, o pino para baixo qualquer excesso de pele. </li><li> Usando fórceps, compreender peritoneu na extremidade inferior do animal e iniciar o corte para cima para a base do pescoço. </li><li> Corte cuidadosamente ao longo dos lados esquerdo e direito da caixa torácica tomando cuidado para evitar cortar quaisquer vasos sanguíneos que podem sangrar para dentro da cavidade torácica. Retirar as costelas por corte para a esquerda e para a direita através do diafragma e porções superiores da caixa torácica. </li><li> Utilizando uma pinça agarrar a traqueia do rato e puxar para a frente. </li><li> Atingir a traquéia com tesouras de dissecação e remover pulmões de rato. Nota: O coração pode permanecer ligado ao pulmão. Se isso ocorrer, dissecar cuidadosamente coração longe de pulmões tendo o cuidado de recolher todos os cinco lóbulos (ver Figura 1 </strong&gt;). </li><li> Lavar cuidadosamente com PBS para remover o excesso de sangue. </li></ol></li><li> Gross avaliação do tecido pulmonar. <ol><li> Opção 1: in vivo de imagens. <ol><li> Para imagiologia de luciferase, ~ 10 minutos antes da imagem, os animais dar um 150 mg / kg de dose de luciferina por injecção intraperitoneal (ip). Pulmões de imagem in vivo em animais anestesiados, ou após a sua remoção após a dissecação (Figura 2) 5. </li></ol></li><li> Opção 2: avaliação Gross. <ol><li> Examinar pulmões sob microscópio estéreo para visualizar nódulos tumorais. Nota: Se as células são GFP marcado, um estereomicroscópio capaz de fluorescência contendo um cubo de luz com os máximos de excitação / emissão adequados (por exemplo, perto de 470/510 nm) para detectar a GFP pode ser utilizado para examinar pulmões estereoscopicamente por fluorescência antes do processamento. </li></ol></li><li> Se os pulmões estão a ser analisadas imediatamente, vá para a seção &#39;RNA Isolation&#39;. Caso contrário, encaixe tecido congelamento usando liquID de azoto ou gelo seco. Armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento de ARN Nota: Para a análise representativa, RNA foi isolado utilizando um kit de isolamento de RNA (ver Lista de Materiais). Embora a análise atual usa o produto de um fabricante específico, uma variedade de kits de isolamento estão disponíveis a partir de vários fornecedores de confiança. Além disso, métodos de centrifugação não baseados kit também são uma opção. ADNc deve também ser preparado a partir de uma amostra de ARN de controlo positivo, tal como uma linha celular ou de plasmídeo, por análise da curva padrão. Alternativamente, um controlo positivo específico para o conjunto de sonda cartilha podem ser adquiridos (ver Lista de Materiais). <ol><li> Se estiver usando tecido previamente congelada, reunir tecido congelado em gelo seco. </li><li> Homogeneizar o tecido usando um dos seguintes métodos, tais como: almofariz e pilão moagem realizada por mão sobre gelo seco após tecido em nitrogênio líquido congelamento; homogeneizador de tecido ou dispositivo de dissociação mecânicapor sugestão do fabricante; sonicação, ou outro método preferido. Nota: Para a análise representativa, o método preferido de homogeneização é de sonicação. <ol><li> Para a análise apresentada na Figura 3, preparar tampão de lise (fornecido no kit de isolamento de ARN) e 2-mercaptoetanol a uma razão de 20 ul de 2-mercaptoetanol a cada 1 ml de tampão de lise. Tecido Ressuspender em 300 ul de tampão de lise, suplementado com 2-mercaptoetanol para cada 30 g de tecido e sonicado durante 10 seg com sonicador fixado em 30% de amplitude. </li><li> Se estiver usando almofariz e pilão, tecido chão ressuspender em tampão de lise de 300 mL após a moagem. </li></ol></li><li> Adicionar 10 ul de proteinase K para 590 ul de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM). Adicionar 600 ul de solução de proteinase K a cada 300 ul (ou seja, para cada 30 mg) de tecido. Incubar durante 10 min à TA. Nota: O tempo de digestão pode variar. </li><li> Centrifugar as amostras a ≥13.000 g durante 10 min para remover os detritos. </li><li> Transferir o sobrenadante para tubos novos. </li><li> Adicionar 450 uL de etanol (96% -100%) para cada 900 ul de sobrenadante para precipitar o ARN. </li><li> Transferir 700 ul da mistura de ligado / etanol para a coluna. </li><li> Centrifugar as amostras a ≥13,000 g durante 1 minuto para ligar RNA para a coluna. </li><li> Descarte os resíduos líquidos e adicionar sobrenadante restante para a coluna e girar novamente. </li><li> Uma vez que todo o lisado é fiado através da coluna, adicionar 350 ul de tampão de lavagem 1 para a parte superior das amostras de coluna e centrifugar a ≥13,000 g durante 30 seg. </li><li> Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior. </li><li> Prepare ADNase por mistura de 5 unidades de ADNase I enzima com 5 ul de ADNase 10x e 40 ul de ADNase / ARNase isenta de água por amostra (volume total de 50 ul / amostra). </li><li> Adicionar 50 ul de DNase misturar a cada coluna e incuba-se durante 15 min à TA. </li><li> Adicionar 350 mL de tampão de lavagem 1 a coluna e centrifugar sampios em ≥13,000 g por 30 s. </li><li> Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior. </li><li> Adicionar 600 ul de tampão de lavagem 2 para a coluna e girar 30 seg a ≥13,000 g. </li><li> Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior. </li><li> Adicionar 250 ul de Tampão de Lavagem 2 e centrifuga-se durante 2 min a ≥13,000 g. </li><li> Coloque parte da coluna em um novo tubo de coleta e descarte tubo de recolha de idade. </li><li> Adicionar 50-100 ul de ARNase / ADNase isenta de água para a coluna e incuba-se durante 1 min. </li><li> Girar durante 1 min a ≥13,000 g. </li><li> Volte a executar eluato coletados por meio de coluna para aumentar o rendimento RNA. </li><li> Para uso imediato, manter as amostras em gelo e proceder à quantificação. Para uso posterior, pressão congelamento de gelo seco ou nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C congelador até ser necessário. </li></ol> 3. First Strand Synthesis Nota: Para a análise representativa, a reacção de transcriptase inversa (RT) realizou-se um Fkit de síntese de irst Strand cDNA projetado para QRT-PCR (ver Lista de Materiais). <ol><li> Se as amostras foram coletadas anteriormente, descongelar tubos em gelo. </li><li> Medir a quantidade de ARN utilizando um espectrofotómetro. </li><li> Usando 0,5-2 ug de ARN total, realizar a síntese da primeira cadeia utilizando transcriptase reversa para gerar ADNc de estoque. <ol><li> Em estéreis, tubos de RNase / PCR isento de ADNase / placas, preparar a mistura de reacção (Tabela 1). Misture delicadamente e centrifugar. Programar uma máquina de PCR padrão (Tabela 2). </li></ol></li><li> Diluir reação acabado de volume desejado (geralmente 50-100 ul) usando água livre de nuclease estéril. </li></ol> 4. PCR em tempo real Nota: Para a análise representativa, verde SYBR foi usado. No entanto, qualquer método preferido pode ser substituído, a critério do usuário. <ol><li> Usando um cDNA de controlo positivo, configurar uma curva padrão para cada conjunto de primers. <ol><li> Para a análise mostrada in Figura 3, preparar a curva padrão para HER2 humano usando o fabricante recomenda cDNA controle positivo (ver Lista de Materiais). Para GAPDH do rato, utilizar o ADNc de pulmão de controlo negativo para gerar uma curva padrão. Para cada teste, diluir em série do cDNA 1: 4 para gerar 5 padrões. </li></ol></li><li> Calcular o número de amostras no total, o que deveria incluir a curva padrão e amostras experimentais. Nota: Para a análise aqui descrita, foram analisados ​​2-3 experiências em replicado por amostra. A análise da curva padrão foi feita para gerar um modelo de regressão linear simples que pode ser aplicado para determinar a quantidade relativa de HER2 e GAPDH por amostra para calcular a quantidade normalizada final. Esta análise irá também assegurar que a eficiência de iniciadores é o adequado para a análise à mão. </li><li> Em um, RNase tubo estéril / isenta de ADNase, preparar mix master (Tabela 3). <ol><li> Calcule mestre mix amount por amostra. Escala-se de mais de uma amostra. Usar uma mistura principal para cada gene experimental de interesse, bem como um controlo interno, tal como GAPDH. Use iniciadores para GAPDH, a uma concentração final de 200 nM. Nota: O controle interno é particularmente útil quando se tenta distinguir entre a origem de células humanas e mouse. Nota: concentração Primer para HER2 foi otimizado e determinado pelo fabricante. </li></ol></li><li> Prepare a placa de teste contendo 1 ul ADNc correspondentes a cada amostra padrão ou experimental. Aloque pelo menos uma amostra de cDNA / bem para cada sonda primer. Adicionar 19 ul de mistura principal por poço para cada sonda primer. Nota: Para os dados representativos na Figura 3, as amostras de cDNA foram analisadas em duplicado para cada sonda de iniciador e representada graficamente como a média das duas amostras. </li><li> Reação executado em máquina QRT-PCR utilizando recomendada ou previamente testado protocolo de PCR. Ver Tabela 4 </sTrong&gt; para o protocolo de PCR utilizado para os dados representativos na Figura 3 e na Figura 4. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY e MAA não são empregados por FirstString Research Inc. e não ter qualquer interesse financeiro na empresa. FirstString Research Inc. forneceu os dados de imagem luciferase que foi apresentado neste manuscrito. GSG é presidente e CEO da FirstString Research. CLG é um empregado de FirstString Research. GSG e CLG têm opções de ações emitidas por FirstString Research.

Este protocolo descreve o uso de qRT-PCR para avaliar a metástase de células de tumor mamário de pulmão utilizando um modelo de xenoenxerto de ratinho. Reconhece-se que outras técnicas, incluindo a imagem de bioluminescência, estão disponíveis e também são eficazes para detectar metástase apesar de ter os seus próprios valores e limitações. Os dados apresentados sugerem que qRT-PCR proporciona uma medida eficaz de detecção de ARNm derivado de tumor dentro de tecido pulmonar para a quantificação de metástases total. Prop...

Análise de qRT-PCR, como é proposto um método para avaliar a metástase tumoral. Este método é proposto como uma alternativa para os usuários que estão interessados ​​em avaliar a metástase, mas não podem ter acesso ao equipamento específico, como in vivo equipamentos de imagem ou uma fluorescência estereoscópio capaz. Uma discussão de métodos vulgarmente utilizados é apresentada seguido por uma demonstração de como a análise de QRT-PCR pode ser usado tanto como um separado ou como um método para avaliar companheiro metástase. Este procedimento tem o potencial de fornecer uma análise quantitativa de carga metastático. Métodos padrão de análise bruta, incluindo a visualização dos pulmões sob microscópio estereoscópico, bem como cortes seriados seguido por hematoxilina e eosina (H &amp; E) coloração do tecido pulmonar, são quantificáveis, mas dependem fortemente de parâmetros definidos pelo usuário para a contagem 2-5. Ao avaliar os pulmões inteiros usando um microscópio estereoscópico, metástases superfície apenas as grandes são visible e análise requer o investigador ter conhecimento razoável da estrutura anatômica pulmonar para determinar o que constitui uma lesão metastática. Marcação fluorescente de células de tumor com um marcador, tais como GFP e o uso de um microscópio estereoscópico que contém um cubo de luz com os máximos de excitação / emissão adequados (por exemplo perto de 470/510 nm para GFP) auxilia neste processo, mas apenas nódulos tumorais de superfície são detectáveis . Além disso, a fluorescência a partir de contaminação do sangue, o que é visível sob os mesmos parâmetros como GFP, pode levar a falsa identificação de possíveis lesões metastáticas. Seccionamento do pulmão seguido por H &amp; E coloração de visualizar metástase pulmonar é um método útil para avaliar micrometástases e outros processos microscópicos incluindo a infiltração de células imunes, mas muitas vezes requer o uso de todo o tecido pulmonar para inclusão em parafina, seccionamento, e procedimentos de coloração. Portanto, os procedimentos a jusante não são ideais seguindo este metod. Embora quantificável, este procedimento requer que o investigador para avaliar um grande número de secções de pulmão coradas por animal para assegurar que a análise é responsável por toda a estrutura 3D do pulmão. Consequentemente, este tipo de exame é demorado, pode levar a contagem de erro, e análise depende fortemente de investigador discrição. Vários em técnicas de imagem in vivo (por exemplo, ressonância magnética, PET, SPECT) são usados ​​atualmente para executar ou testar os processos biológicos em modelos de roedores experimentais 8. In vivo a imagem de bioluminescência é um método comum usado para adquirir uma visão bruta de metástase 9. Esta técnica é geralmente aplicado para avaliar a presença de actividade repórter da luciferase, devido à acumulação de células tumorais, que são modificados para conter um elemento de resposta de luciferase, que residem em órgãos específicos, como na glândula mamaria depois da implantação de células de tumor e o pulmão após a metástase espontânea 10. A visualização da actividade de luciferase repórter é induzida pela presença de substrato luciferina (D-luciferina). A luciferase catalisa a descarboxilação oxidativa de D-luciferina para oxiluciferina gerando bioluminescência. Enquanto informativo, este método é limitado por vários factores, incluindo a estabilidade do substrato (isto é, curta meia-vida), a distribuição adequada do substrato, o qual depende da forma como é entregue a animais experimentais, e baixa sensibilidade de detecção 9. Um mérito principal desta técnica é que é não-invasiva, pode ser realizada em animais vivos, e pode conduzir à detecção de metástases de células de tumor em vários órgãos que podem não ter sido normalmente colhido em dissecção 9,10. Um aspecto positivo de técnicas de imagiologia in vivo é que o tecido de pulmão não é perturbada permitindo procedimentos secundários como parafina ou como aqui apresentado, a análise de qRT-PCR. No entanto, porque qRT-PCR é theoretically uma medida mais sensível de detecção, a avaliação bruta pode não revelar baixos números de células tumorais presentes no pulmão. Embora útil, as técnicas de imagiologia descritos acima podem ser substituídos ou suplementados com o método de qRT-PCR actualmente descrito. QRT-PCR tem o potencial de proporcionar uma medida sensível de ARNm derivado de tumores dentro de um pulmão.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de RNA GeneJet</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Transcrição Reversa Supermix para QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio PrimePCR SYBR Green: ERBB2, Humano&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Modelo PrimePCR para SYBR Green Assay: ERBB2, Humano&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Sequência</td><td></td><td></td><td>de primer para-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

avaliação de metástases pulmonares em rato mamárias tumorais models por quantitative pcr em tempo real

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

A doença metastática é a propagação de células tumorais malignas do local do tumor primário para um órgão distante e é a principal causa de morte do cancro associado 1. Os lugares mais comuns de propagação metastática incluem pulmão, linfonodo, cérebro e ossos 2. Mecanismos que conduzem metástase são áreas de intensa pesquisa sobre o câncer. Consequentemente, os ensaios eficazes para medir a carga metastático em locais distantes de metástases são fundamentais para a investigação do cancro. Avaliação de metástases do pulmão em modelos de tumor mamário é geralmente realizada por observação qualitativa bruta de tecido de pulmão a seguir a dissecção. Métodos quantitativos de avaliação de metástase está actualmente limitado a ex vivo e em técnicas de imagem com base vivo que exigem parâmetros definidos pelo usuário. Muitas dessas técnicas são em todo o organismo, em vez de nível do nível celular 3-6. Embora os métodos de imagem mais recentes utilizando microscopia multi-fotão somos capazes de avaliar MetasTasis a nível celular 7, estes procedimentos altamente elegantes são mais adequados para avaliar os mecanismos de difusão em vez de uma avaliação quantitativa da carga metastática. Aqui, um método in vitro simples para avaliar quantitativamente a metástase é apresentado. Usando quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), o ARNm específico de células de tumor pode ser detectado no tecido do pulmão do rato.

Além do tempo que demora a efectuar a inoculação inicial de células de tumor no animal experimental e de se realizar, na análise primária do tumor in vivo, a colheita de tecido, o isolamento do ARN e a análise qRT-PCR é um procedimento de 1-2 dias (Figura 1) . Um exemplo de análise bruta é imagiologia bioluminescente para avaliar células tumorais dentro do tecido pulmonar. Aqui, um experiment...

Este protocolo descreve como usar quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorais representam metástases no tecido do pulmão do rato.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar a quantidade de um mRNA específico proveniente de células tumorais no pulmão, como um método para analisar metástase. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma medida quantitativa da metástase. Para realizar a dissecação do tumor pulmonar, após a eutanásia de um camundongo utilizando uma dose letal de isofluorano de acordo com o protocolo descrito, posicione o camundongo sobre uma placa de espuma com o dorso voltado para cima e as patas estendidas, utilizando pinos de dissecação para fixá-lo à placa.Após usar etanol para pulverizar o camundongo, utilize uma pinça para segurar a porção inferior do animal no centro e, com uma tesoura, corte em direção ao pescoço através da pele, tomando cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal do camundongo. Agora, segure o peritônio na extremidade inferior do animal e comece a cortar em direção à base do pescoço. Corte cuidadosamente ao longo dos lados esquerdo e direito da caixa torácica, tomando cuidado para não seccionar quaisquer vasos sanguíneos que possam sangrar na cavidade torácica.Remova os ossos das costelas cortando à esquerda e à direita, através do diafragma e das porções superiores da caixa torácica. Em seguida, utilizando pinça, segure a traqueia do camundongo e puxe para frente, e use tesoura de dissecação para seccionar a traqueia antes de remover os pulmões do animal. Use PBS para lavar suavemente o tecido pulmonar.Em seguida, após a avaliação macroscópica do tecido pulmonar de acordo com o protocolo descrito no texto, se os pulmões devem ser analisados imediatamente, prossiga para o isolamento de RNA. Para isolar RNA do tecido, inicie homogeneizando o tecido utilizando um dos métodos listados no protocolo descrito no texto. Prepare o tampão de lise a partir de um kit de isolamento de RNA e adicione 20 microlitros de captoetanol por mililitro de tampão de lise.Resuspenda cada 30 gramas de tecido em 300 microlitros de tampão de lise e, com um sonicador ajustado em 30% de amplitude, sonique o tecido por 10 segundos. Adicione 10 microlitros de proteinase K a 590 microlitros de tampão TE e adicione 600 microlitros do tampão a 300 microlitros de tecido sonicado. Incube em temperatura ambiente por 10 minutos.Em seguida, centrifugue as amostras a mais de ou igual a 13.000 ×g por 10 minutos para remover os resíduos. Então, transfira o sobrenadante para novos tubos. Adicione 450 microlitros de etanol a cada 900 microlitros de sobrenadante para precipitar o RNA.Em seguida, transfira 700 microlitros da mistura de lisado com etanol para uma coluna de RNA. Centrifugue novamente a maior ou igual a 13.000 ×g por um minuto para ligar o RNA à coluna. Em seguida, descarte o resíduo líquido e adicione o sobrenadante restante à coluna, e centrifugue novamente.Em seguida, adicione 350 microlitros do tampão de lavagem um à porção superior da coluna e centrifugue as amostras por 30 segundos. Descarte o resíduo líquido e recoloque a coluna no tubo. Prepare a DNase misturando cinco unidades da enzima DNase um com cinco microlitros do tampão 10X para DNase e 40 microlitros de água livre de DNase e RNase para cada amostra.Adicione 50 microlitros da mistura de DNase a cada coluna e incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, adicione 350 microlitros do tampão de lavagem um às colunas e centrifugue as amostras por 30 segundos. Após descartar a solução residual, adicione 600 microlitros do tampão de lavagem dois e centrifugue por mais 30 segundos.Descarte o líquido antes de adicionar 250 microlitros do tampão de lavagem dois e, em seguida, centrifugue por dois minutos. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta e adicione de 50 a 100 microlitros de água livre de RNase e DNase à coluna. Após uma incubação de um minuto, centrifugue por um minuto.Reaplique o eluato coletado na coluna para aumentar o rendimento de RNA. Para uso imediato, mantenha as amostras sobre gelo. Para uso posterior, congele rapidamente em gelo seco ou nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius até o momento do uso.Utilizando um espectrofotômetro, quantifique o RNA. Em seguida, em tubos ou placas PCR estéreis, livres de RNase e DNase, use de 0,5 a 2 microgramas de RNA total para preparar a mistura de reação para a primeira transsíntese, conforme mostrado nesta tabela. Misture e centrifugue suavemente, e programe uma termocicladora padrão utilizando o programa mostrado aqui.Quando a reação estiver concluída, utilize água estéril e livre de nucleases para diluir a reação finalizado ao volume desejado. Para realizar a PCR em tempo real, use um controle positivo de DNAc, como o HER2 humano, para montar uma curva padrão para cada conjunto de primers, preparando de uma a quatro diluições seriadas do DNAc a fim de gerar cinco padrões. Em seguida, calcule o número total de amostras, que deve incluir a curva padrão e as amostras experimentais.Em seguida, em tubos estéreis livres de RNase e DNase, prepare uma mistura-mestre para cada gene experimental de interesse, bem como um controle interno, como o gapdh. Prepare uma placa de teste contendo um microlitro de C DNase para cada amostra padrão ou experimental. Atribua pelo menos uma amostra de cDNA por poço, para cada par de iniciadores e sonda.Adicione 19 microlitros de mastermix por poço, para cada par de iniciador e sonda. Este experimento de bioluminescência demonstra que pulmões de camundongos tratados com ACT1, que tem como alvo a proteína da junção comunicante Connexina 43, parecem negativos para atividade de luciferase, sugerindo a ausência de células tumorais no tecido. No entanto, a análise de cortes corados com H&E do tecido pulmonar revela micrometástases que não foram iluminadas pela luciferase, indicando que a imagem de luciferase não é sensível o suficiente para detectar pequenos números de células tumorais.Mostrados aqui estão os resultados de um experimento de qRT-PCR, utilizando uma sonda específica para HER2, para detectar células tumorais humanas HER2 e JIMT1 em tecido pulmonar de células originalmente transplantadas na gordura mamária do camundongo. Embora nenhuma metástase visivelmente evidente tenha sido observada em nenhum dos pulmões, em duas das 11 amostras, a qRT-PCR detectou metástases. Nesta figura, foi realizada uma análise de curva padrão para determinar os níveis relativos de HER2 normalizados em relação ao gapdh do pulmão de camundongo em uma série de número de células.Os resultados indicam que a qRT-PCR, utilizando a sonda HER2, foi sensível o suficiente para detectar níveis de HER2 em apenas 10 células. Por fim, esta análise de regressão mostra o número relativo de células em cada amostra pulmonar, incluindo os controles positivo e negativo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em seis a oito horas, se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de tomar precauções para manter a integridade do RNA durante o isolamento do RNA e a reação de transcriptase reversa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar metástase em tecido pulmonar inteiro, por meio de PCR quantitativa em tempo real.

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Este modelo ortotópico de cancro de próstata humana permite a quantificação do tamanho do tumor, as células tumorais, e a formação de metástases distinta circulante para o pulmão. Como as células deve escapar o principal órgão, entrar na corrente sanguínea, e implantar em um site secundário, este modelo recapitula efetivamente o cenário em seres humanos.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

O objetivo deste protocolo é estudar a tumorigênese mamária. Com esta técnica, os tumores mamários de camundongos são removidos e as células primárias são preparadas a partir dos tumores. Um protocolo de extração pulmonar está incluído para estudar metástases pulmonares. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo do embrião de camundongo está incluído.

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

Aqui descrevemos o modelo e a abordagem para estudar as funções dos macrófagos alveolares pulmonares na metástase do câncer. Para demonstrar o papel dessas células na metástase, foi utilizado o modelo singênico (4T1) de câncer de mama em conjunto com a depleção de macrófagos alveolares com lipossomas de clodronatos.

Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

Não faltam modelos pré-clínicos que avaliam a terapia adjuvante visando metástases de câncer de mama. Para abordar isso, desenvolvemos um modelo murino de metástase de adenocarcinoma mamário pulmonar de novo , em que as terapias administradas na configuração adjuvante (ressecção pós-cirúrgica de tumores primários) podem ser avaliadas quanto à eficácia no impacto de metástases pulmonares previamente semeadas.

Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de De Novo Metástase do câncer mamário

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

Apresentamos um modelo de câncer de mama murino ortotópico e modelo de mastectomia radical com tecnologia de bioluminescência para quantificar a carga do tumor para imitar a progressão do câncer de mama humano.

Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino

Este trabalho predefine um protocolo avançado para avaliar com precisão o carregamento de tumores por meio da detecção de sinais de proteína fluorescente verde e bioluminescência, bem como a integração da técnica de detecção molecular quantitativa.

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

A injeção intravenosa de células cancerígenas é frequentemente usada em pesquisas de metástase, mas a carga tumoral metastática pode ser difícil de analisar. Aqui, demonstramos um modelo de injeção de veias traseiras de metástase e incluímos uma nova abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático resultante.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Descrevemos um método mais consistente e rápido para quantificar a metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1 usando Fiji-ImageJ.

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Aprenda a quantificar metástases pulmonares em modelos tumorais mamários de camundongo usando PCR em tempo real. Este método detecta mRNA específico de células tumorais com alta sensibilidade.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

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