2.9: Pluripotence induite

Les cellules souches pluripotentes induites, comme les cellules souches embryonnaires humaines, peuvent se différencier en presque n’importe quelle cellule du corps, et sont donc très prometteuses dans le domaine de la médecine régénérative.

Les cellules souches embryonnaires humaines, ou CSEh, sont obtenues à partir d’embryons préimplantatoires, tandis que les cellules somatiques entièrement différenciées sont utilisées pour générer des cellules souches pluripotentes induites, également appelées CSPi.

Dans cette vidéo, vous allez découvrir les principes de base de la génération d’iPSC, un protocole étape par étape pour induire la pluripotence dans les cellules différenciées, et certaines des nombreuses applications et modifications en aval de ce protocole.

Commençons par discuter des principes qui sous-tendent la génération d’iPSC à partir de types de cellules somatiques.

Les cellules différenciées, comme les cellules de la peau ou les neurones, sont celles dont le sort est décidé. Ils s’engagent à remplir une fonction particulière. D’autre part, les cellules souches pluripotentes sont celles dont le sort est indécis, et elles peuvent se différencier en n’importe quel type de cellule.

Le processus de changement de l’identité d’une cellule déjà différenciée en un état pluripotent est appelé reprogrammation cellulaire. Il s’agit de modifier le modèle d’expression des gènes dans la cellule, car le nombre et les types de protéines produites par une cellule jouent un rôle majeur dans la définition de l’identité d’une cellule.

L’une des façons d’induire la reprogrammation cellulaire est d’induire l’expression de certains facteurs de transcription. Les facteurs de transcription sont des protéines qui se lient à des séquences régulatrices au sein d’un gène. Certaines de ces séquences sont appelées « promoteurs » et favorisent donc la transcription d’un gène. Quelques facteurs de transcription peuvent influencer l’expression de nombreux gènes, ce qui a un impact énorme sur l’identité cellulaire.

Les quatre facteurs de transcription classiques dont il a été démontré qu’ils induisent la pluripotence sont Oct4, Sox2, cMyc et Klf4. Ces facteurs sont également connus sous le nom de facteurs Yamanaka, du nom du chercheur qui a découvert leurs effets de reprogrammation.

Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour induire l’expression de ces facteurs de transcription. La méthode la plus courante et la plus efficace est l’utilisation d’un virus modifié pour délivrer les gènes du facteur de transcription dans le noyau, où ils s’intégreront dans le génome.

Dans cette méthode, les gènes codant pour les quatre facteurs Yamanaka sont emballés individuellement dans différents rétrovirus et ajoutés à des cellules différenciées. Lorsque les cellules sont exposées à des virus modifiés, une petite fraction de cellules différenciées est infectée par les quatre virus porteurs de facteurs de transcription. Ils commencent à se dédifférencier jusqu’à ce que de grands amas sphériques de cellules souches pluripotentes se forment. La formation de grappes aide les iPSC à créer un microenvironnement similaire aux cellules souches in vivo, et donc à maintenir leur pluripotence.

Puisque vous comprenez maintenant les principes de base qui sous-tendent la génération d’iPSC, passons en revue un protocole général pour induire la pluripotence dans les fibroblastes embryonnaires de souris, ou MEF, à l’aide d’un système de transduction virale.

Avant de commencer cette procédure, notez que les virus peuvent infecter les cellules de votre corps, il est donc extrêmement important de suivre les directives de sécurité.

Pour commencer le processus de transfection, le milieu de culture est retiré d’une plaque contenant une forte densité de MEF, et les cellules sont lavées avec une solution tampon. Ensuite, une solution contenant une enzyme dégradant les protéines, comme la trypsine, est ajoutée pour soulever les cellules du fond de la boîte. Le milieu de culture est ensuite ajouté à la plaque et les cellules détachées sont transférées dans un tube à centrifuger.

Après la centrifugation, la pastille est remise en suspension dans le milieu de culture. Ensuite, les cellules sont comptées et la concentration est ajustée afin qu’un nombre optimal de cellules puissent être infectées par le virus le lendemain. Incuber les cellules pendant la nuit.

Une fois que les cellules se sont installées sur leur nouvelle boîte, les anciens milieux sont remplacés par des milieux frais, et des virus modifiés contenant les facteurs de transcription souhaités sont ajoutés à la plaque. Les cellules sont ensuite incubées avec les virus pendant suffisamment de temps pour permettre à l’infection d’avoir lieu. Après l’incubation, le milieu contenant les virus libres est retiré et remplacé par un milieu de cellules souches embryonnaires frais.

Pendant 2-3 semaines après la transformation, les cellules doivent être cultivées à 37 ? dans un incubateur, et les milieux de culture doivent être remplacés quotidiennement.

Après cette période, les colonies d’iPSC qui ressemblent à des colonies de cellules souches embryonnaires devraient devenir suffisamment grandes pour être détectées. Les colonies peuvent être transférées dans une plaque fraîche contenant un milieu avec des facteurs de croissance appropriés, et laissées pousser davantage. Afin de confirmer la pluripotence, une partie de la population cellulaire est colorée avec des marqueurs de pluripotence.

Maintenant que vous avez vu comment générer des iPSC à partir de cellules différenciées, examinons quelques applications en aval et les modifications de cette méthode très utile.

Une caractéristique importante des iPSC est qu’elles peuvent être utilisées pour générer presque n’importe quelle cellule du corps. Cet exemple montre la génération de cellules musculaires cardiaques, appelées cardiomyocytes, à partir d’iPSC. Pour ce faire, les iPSC sont transférées sur des plaques non adhérentes qui leur permettent de former des corps embryoïdes, qui sont des agrégats de cellules souches pluripotentes. Les corps embryoïdes sont cultivés dans un milieu spécialisé contenant du sérum et de l’acide ascorbique, ce qui améliore la différenciation cardiaque. Une différenciation réussie peut être facilement observée lorsque certaines cellules commencent à battre.

Étant donné que les iPSC peuvent potentiellement se différencier en n’importe quel type de cellule, elles peuvent également former un organisme entier, comme une souris. Cela peut être fait à l’aide d’un test appelé complémentation tétraploïde. Tout d’abord, un embryon tétraploïde, un embryon contenant quatre jeux de chromosomes, est formé par la fusion de deux cellules d’un embryon précoce à l’aide d’un champ électrique. L’embryon tétraploïde est laissé se développer jusqu’au stade de blastocyste. Les iPSC sont ensuite injectées dans le blastocyste, qui est ensuite transplanté dans une femelle receveuse pour la gestation. Les cellules tétraploïdes ne sont capables de former que des structures extraembryonnaires comme le placenta, de sorte que les animaux résultant de cette méthode sont entièrement dérivés des iPSC.

Certains chercheurs modifient la procédure de reprogrammation pour rendre plus efficace le processus d’identification des cellules reprogrammées avec succès. Par exemple, dans cette expérience, des MEF capables d’exprimer une protéine fluorescente verte sous l’influence du promoteur Oct4 ont aidé les chercheurs à identifier facilement les cellules qui ont acquis la pluripotence.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la génération de cellules souches pluripotentes induites. Cette vidéo a passé en revue les principes de cette procédure et un protocole étape par étape pour générer des iPSC à partir de cellules différenciées. Nous avons également examiné comment cette méthode pourrait être appliquée ou modifiée pour des expériences en laboratoire.

La découverte des iPSC a eu un impact énorme sur le domaine de la biologie des cellules souches, car elle a un énorme potentiel pour développer des thérapies pouvant être utilisées pour traiter les troubles dégénératifs. Bien que de nombreux progrès aient été réalisés avec les CSPi, l’obstacle qui reste à franchir est le risque de cancer associé. Les procédures de reprogrammation actuelles ont le potentiel d’entraîner une croissance cellulaire non régulée pouvant entraîner un cancer. Par conséquent, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour utiliser réellement les iPSC en clinique. Comme toujours, merci d’avoir regardé !