Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca ²⁺ In Aged neurones de l'hippocampe

L’objectif général de cette procédure est d’étudier le remodelage du calcium dans le cerveau vieillissant à l’aide de l’imagerie par fluorescence et bioluminescence du calcium cytosolique et mitochondrial dans des cultures à long terme de neurones de l’hippocampe, qui est considéré comme un modèle de vieillissement neuronal. Cette méthode peut aider à comprendre des questions clés dans le domaine du vieillissement, telles que la façon dont le remodelage du calcium intracellulaire contribue à l’excitotoxicité et aux dommages neuronaux, tous deux liés à la surcharge en calcium. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible de suivre de près le remodelage calcique dans des neurones individuels en utilisant des cultures à différents DYS in vitro à partir du même échantillon, la duplication de cette technique à travers ou le traitement d’un accident vasculaire cérébral ou d’une maladie cellulaire, car il s’agit d’une nouvelle cible variable liée à la surcharge en calcium dans les maladies liées à cet agent.

Après avoir regardé cette vidéo, Jésus a une bonne compréhension de la façon d’effectuer une imagerie de fluorescence et de réminiscence du calcium cytosolique et mitochondrial dans des cultures à court et à long terme de neurones de l’hippocampe de rat. Pour commencer cette procédure, répartissez les lamelles sur une bande de paraform dans une boîte de Pétri. Appliquez ensuite 200 microlitres de poly D lycine à raison d’un milligramme par millilitre sur chaque lamelle et traitez toute la nuit.

Le lendemain, lavez les lamelles avec de l’eau stérile double distillée toutes les 15 minutes pendant 90 minutes dans des conditions stériles. Placez les lamelles dans le multi et maintenez-les dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 jusqu’à utilisation. Pour isoler les neurones de l’hippocampe, ouvrez le crâne des petits rats nouveau-nés avec des ciseaux stériles, extrayez le cerveau avec une spatule et lavez-le rapidement dans le milieu F 12 du jambon.

Ensuite, faites une coupe diagonale avec le scalpel dans chaque hémisphère et transférez-la dans la boîte de Pétri contenant les jambons F 12 medium au microscope. Jetez les méninges. Identifiez soigneusement l’hippocampe à un endroit concave caractéristique sur le cortex.

Ensuite, séparez l’hippocampe du cortex en le retirant soigneusement et en le retirant à l’aide de ciseaux oculaires. Ensuite, transférez les morceaux d’hippocampe dans un flacon contenant 1,8 millilitre de solution de pepane préfiltrée. Incuber-les à 37 degrés Celsius en secouant doucement de temps en temps pendant 15 minutes.

Ajoutez ensuite 90 microlitres de la solution d’ADN. Ajoutez 50 microgrammes par millilitre et incubez-les pendant 15 minutes supplémentaires. Après cela, transférez le tissu dans un tube à centrifuger de 10 millilitres et lavez les fragments avec un milieu de culture neurobasal frais.

Obtenez une suspension cellulaire en passant les fragments de tissu dans une pipette en plastique de cinq millilitres. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 160 G pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le supinate à l’aide d’une pipette de pâturage stérile en plastique et suspendez soigneusement la pastille dans un millilitre de milieu de culture neurobasal à l’aide d’une pipette automatisée d’un millilitre.

Ensuite, mesurez la densité cellulaire à l’aide d’une chambre de comptage Neubauer. Ajoutez 10 microlitres de suspension cellulaire et comptez le nombre de cellules au microscope. Effectuez ensuite les calculs correspondants pour obtenir 40 à 80 microlitres de suspension de cellules, ce qui contient environ 30 000 cellules.

Dans la plaque à quatre puits contenant 500 microlitres de milieu neurobasal, environ 30 000 cellules ont été jouées à chaque puits contenant des lamelles de verre. Conservez-les dans l’incubateur pendant deux à cinq jours in vitro pour les jeunes neurones ou plus de 15 jours in vitro pour les neurones âgés. Dans cette procédure, incubez les cellules avec moins de 2h00 du matin pendant 60 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Transférez ensuite les lamelles dans la chambre de profusion. Après cela, placez la chambre de profusion avec la lamelle dans le support sur le microscope inversé. Sélectionnez le champ microscopique et perfuser les cellules en continu avec le HBS préchauffé.

Par la suite, l’epi illumine les cellules à 340 et 380 nanomètres. Alternativement, enregistrez ensuite la lumière émise à 520 nanomètres toutes les cinq à 10 secondes avec une caméra fluorescente, qui est filtrée par un miroir fira two diic. Pour analyser les images fluorescentes enregistrées, ouvrez d’abord le fichier de l’expérience à l’aide du logiciel Aqua Cosmos, cliquez sur rapport et sélectionnez la plage de rapport souhaitée.

Calculez le rapport pixel par pixel dans les images résultantes afin d’obtenir une séquence d’images de rapport. Soustrayez ensuite l’arrière-plan en ajustant le bouton d’élimination de l’arrière-plan. Après cela, appuyez sur démarrer le calcul.

Ensuite, appuyez sur le bouton de séquence de temps et effacez les anciens retours sur investissement pour l’analyse quantitative des cellules individuelles. Établissez de nouveaux ROI ou les ROI correspondant aux neurones individuels. Pour représenter graphiquement les enregistrements individuels, exportez les valeurs de fluorescence du rapport correspondant à chaque retour sur investissement dans le programme de laboratoire Origin en cliquant sur graphique.

Cliquez ensuite sur calculer et enregistrez le fichier TXT. Après cela, faites le calcul correspondant pour estimer la taille de l’augmentation du rapport de fluorescence en réponse à chaque stimulation pour transfecter des neurones en culture avec le plasmide mutant MIT. Tout d’abord, préparez 50 microlitres de solution A contenant du réactif de transfection dans un flacon.

Ensuite, préparez 50 microlitres de solution B contenant le plasmide MIT ute dans un flacon. Ajoutez la solution B à la solution A et incubez pendant 20 minutes. Après cela, transférez les lamelles contenant des neurones de l’hippocampe dans de nouvelles boîtes multiples contenant 200 microlitres de TF neurobasal frais. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution A et B goutte à goutte sur chaque lamelle et incubez pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, retirez le fluide. Lavez les cellules avec du tf neurobasal frais. Une fois retourné, le couvercle se glisse dans le milieu de culture neurobasale d’origine et cultive les cellules pendant 24 heures après la transfection pour permettre une expression et un ciblage efficaces de la sonde.

Ensuite, ajoutez quatre microlitres de mastic TEREZIN N à 200 microlitres de HBS pour obtenir une concentration finale de quatre micromolaires. Mélangez délicatement et laissez incuber pendant deux heures à température ambiante dans l’obscurité. Après deux heures, transférez les glissières de couverture dans la chambre de perfusion et examinez en continu avec une solution HBS préchauffée.

Pour enregistrer les images de bioluminescence de la concentration de calcium mitochondrial, sélectionnez le champ microscopique contenant les cellules exprimant la corine APO comme le montre l’émission de fluorescence. Ensuite, éteignez la lumière du microscope. Retirez la boîte contenant le dichroïque située dans le chemin de la lumière.

Éteignez ensuite la lumière d’excitation et fermez la boîte sombre pour une obscurité totale. Perfuser les cellules avec du milieu HBS, avec ou sans solutions d’essai préchauffées à 37 degrés Celsius. Capturez ensuite les images d’émission photonique toutes les 10 secondes à l’aide d’une caméra de comptage de photons gérée par un processeur d’image.

Ensuite, ajoutez dig toin pour libérer tous les photons restants Pour analyser les images bioluminescentes reflétant le calcium mitochondrial. Ouvrez l’image de fluorescence GFP. Sélectionnez les zones d’intérêt individuelles en dessinant autour des cellules transfectées.

Ensuite, copiez et collez les mêmes ROI sur chaque image de la séquence. Captures d’écran. Après cela, exportez les valeurs d’émission photonique pour chaque retour sur investissement vers le logiciel spécifique pour le graphique de clics de calcul.

Afin de calculer les valeurs de chaque retour sur investissement, sélectionnez la valeur totale et utilisez le retour sur investissement actuel pour toutes les images. Ensuite, appuyez sur calculer, enregistrez le fichier texte et exportez les données. Ensuite, faites les calculs correspondants pour estimer la taille de l’augmentation du calcium mitochondrial en réponse à chaque stimulus montré.

Voici les images représentatives en fond clair et en pseudo couleurs de cultures à court et à long terme de neurones de l’hippocampe avant et après stimulation avec 100 micromolaires et des couleurs plus chaudes MDA reflétant une concentration élevée de calcium cytosolique. Ces traces montrent les enregistrements représentatifs sur cellule unique de la concentration cytosolique de calcium en réponse à 100 micromolaires et MDA dans des cultures à court et à long terme de neurones de l’hippocampe. Notez que les augmentations de la concentration cytosolique de calcium sont beaucoup plus importantes à long terme qu’à court terme sur les neurones cultivés.

Dans cette expérience, des neurones hippocampiques en culture ont été transfectés avec la korin ciblée par les mitochondries de faible affinité fusionnée à la GFP incubée avec quatre micromolaires de scellement de térezine, et soumis à une imagerie par bioluminescence de la concentration de calcium mitochondrial. Ici, les enregistrements qui montrent la libération de photo-émissions reflétant le calcium mitochondrial dans les neurones de l’hippocampe cultivés à court et à long terme. Une micromolaire MDA 100 a augmenté la concentration de calcium mitochondrial dans les neurones âgés, mais pas dans les jeunes neurones de l’hippocampe en culture.

D’autres méthodes, comme l’évaluation de la bonne gauche, peuvent être combinées à l’imagerie de fluorescence et de bioluminescence dans les mêmes cellules afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la susceptibilité aux cellules neuronales, le plomb associé au vieillissement, la neurodégénérescence et l’ischémie.