Name: Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca 2+ In Aged neurones de lhippocampe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Découvrez l'imagerie de fluorescence et bioluminescence pour étudier le calcium sous-cellulaire dans les neurones âgés de l'hippocampe de rat. Cette méthode permet d'analyser le remodelage calcique et son rôle dans l'excitotoxicité liée au vieillissement neuronal.

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Ce travail a été soutenu par le Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) et la Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 et BIO/VA33/13), Espagne. La MCR a été soutenue par la Junta de Castilla y Leòn (Espagne) et le Fonds social européen. Nous remercions le regretté Dr Philippe Brûlet (1947-2013) pour le plasmide mitochondrial GFP Aequorin.

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été manipulés dans des protocoles approuvés par le centre de logement des animaux de l&#39;Université de Valladolid, en accord avec la Convention européenne 123 / Conseil de l&#39;Europe et de la directive 86/609 / CEE. 1. Culture à court et à long terme des neurones de l&#39;hippocampe de rat <ol><li> Préparation de la poly-D-lysine recouvert de 12 mm des lamelles de verre. <ol><li> Stériliser 12 mm lamelles de verre de diamètre dans l&#39;éthanol pendant au moins 24 heures. Laissez-les sécher dans des conditions stériles. </li><li> Répartir les lamelles sur une bande de parafilm dans une boîte de Petri. Recouvrir la surface de chaque lamelle avec 200 ul de 1 mg / ml de poly-D-lysine. Autoriser le traitement O / N. </li><li> Le lendemain, laver les lamelles avec de l&#39;eau stérile distillée deux fois toutes les 15 min pendant 90 min dans des conditions stériles. </li><li> Remplir une plaque de quatre puits multiple à avec 500 pi de Neurobasal milieu de culture par puits. Neurobasal milieu de culture doit être complétée par10% de sérum de veau fœtal, 2% de B27, 1 ug / ml de gentamicine et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Placez les lamelles dans la plaque multiple à. Les maintenir dans une humidifié 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Isolement des neurones de l&#39;hippocampe de rats nouveau-nés. <ol><li> Préparer 1,8 ml de solution de papaïne (directement acheté) dans un flacon (20 ul / ml) dans des conditions stériles: Pour obtenir une concentration finale de 20 ul / ml, ajouter environ 40 ul de la papaïne dans 1,8 ml de Hank plus 0,6% de BSA (pi doivent être calculés selon les conditions des fabricants). 0,6% de BSA de Hank est préparée en mélangeant 85 ml de milieu HBSS avec 15 ml d&#39;albumine de sérum bovin à 4% (BSA, préparé résolution de 4 g de BSA dans 100 ml de HBSS). Préparer dans une hotte stérile. </li><li> Incuber la papaïne dans Hank plus 0,6% de BSA pendant 30 minutes à 37 ° C avant utilisation. Filtrer la solution à l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,22 um avant utilisation. </li><li> Préparer le milieu F-12 de Ham en ajoutant DulbeccoModifié Moyen poudre de Eagle (13,5 g par litre) dans 900 ml d&#39;eau stérile doublement distillée. Ensuite, ajoutez 6 g HEPES et 336 mg de NaHCO 3 et ajuster le pH à 7,42 en utilisant NaOH 4 N. Ajouter de l&#39;eau stérile afin d&#39;obtenir une solution à 1 L et filtrer à l&#39;aide d&#39;une polyéthersulfone 0,20 um (PSE) Bottle Top filtre. Effectuer ce processus dans une hotte stérile. Enfin saturer la solution avec CO 2 dans des conditions stériles avant utilisation. Solutions de conserver à 4 ° C et les utiliser réfrigérés. </li><li> Euthanasier nouveau-né (P0) ratons par décapitation et laver la tête en milieu HBS stérile. Ouvrez le crâne à l&#39;aide de ciseaux stériles. Extraire le cerveau avec une spatule et laver rapidement en F-12 du milieu de Ham. </li><li> Faire une coupe en diagonale à l&#39;aide d&#39;un scalpel dans chaque hémisphère (figure 1B), et de la porter à une boîte de Pétri contenant F-12 du milieu de Ham. </li><li> Méninges Jeter soigneusement avec l&#39;aide de pinces à dissection et sous une loupe. </li> &lt;li&gt; Identifier l&#39;hippocampe dans un emplacement concave caractéristique sur le cortex utilisant loupe. Ensuite, séparer l&#39;hippocampe du cortex en tirant délicatement d&#39;une frontière et de la retirer de sa position à l&#39;aide des ciseaux pour les yeux. </li><li> Transférer le tissu hippocampique à une plaque 4-bien rempli avec le milieu dépourvu de Ca 2+ et Mg 2+ stérile de Hank plus 0,6% de BSA et laver tissu hippocampique. Sans enlever les médias couper le tissu en petits morceaux (environ 2 x 2 mm) en utilisant les mêmes ciseaux oculaires. </li><li> Transférer des morceaux de l&#39;hippocampe dans un flacon contenant 1,8 ml de solution de papaïne pré-filtrée. Puis les incuber à 37 ºC avec occasionnelle, agitant doucement. 15 min plus tard, ajouter 90 ul de solution de DNase I (50 ug / ml final) et incuber pendant 15 min supplémentaires. </li><li> Transférer le tissu à un tube de centrifugeuse de 10 ml et laver les fragments avec des produits frais Neurobasal milieu de culture. Obtenir suspension cellulaire en passant des fragments de tissu à travers un 5 ml en plastique pipette. </li><li> Centrifugeuse suspension de cellules à 160 g pendant 5 min. Retirer le surnageant avec une pipette Pasteur stérile en plastique et suspendre pastille soigneusement avec une pipette automatique de 1 ml dans 1 ml de milieu de culture Neurobasal. </li><li> Mesurer la densité cellulaire en utilisant une chambre de comptage Neubauer. Mettez la lamelle de verre au-dessus de la chambre de Neubauer. Ajouter 10 ul de suspension cellulaire. Assurez-vous que la suspension de cellules pénètre dans la chambre de manière uniforme et sans faire de bulles. Comptez le nombre de cellules sous le microscope et effectuer des calculs correspondants pour obtenir une baisse appropriée de 40-80 ul contenant 30 x 10 3 cellules. Le nombre total de cellules dépendra du nombre d&#39;animaux utilisés. </li></ol></li><li> À court terme et à long terme de la culture des neurones d&#39;hippocampe de rat. <ol><li> Sur la plaque de quatre puits contenant multiple à 500 pi de Neurobasal milieu de culture préparé avant et conservés dans l&#39;incubateur, la plaque d&#39;environ 30 x 10 3 cellules dans une chute d&#39;environ 50 pi à chaquepuits de la plaque contenant une boîte multiple poly-D-lysine-enduit, 12 mm lamelle de verre de diamètre. </li><li> Maintenir cellules de l&#39;hippocampe primaires dans un humidifié 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur pendant 2-5 jours in vitro (DIV, à court terme, les cultures jeunes) ou&gt; 15 DIV (à long terme, les cultures âgées) avant les expériences sans changer la culture médias. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescence Imaging de cytosolique de Ca 2+ Concentration <ol><li> Préparation des solutions d&#39;essai pour l&#39;imagerie de fluorescence. <ol><li> Préparer une solution saline externe tamponnée HEPES (HBS) contenant, en mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 glucose, le sodium-10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Préparer un exempt externe, Mg 2+, une solution saline tamponnée HEPES (HBS) solution contenant, en mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, le glucose 10 et 10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Résolvez saline NMDA dans Mg 2+ exempt, tamponné HEPES (HBS) à une final concentration de 100 uM et de compléter avec 10 uM glycine. </li><li> Préparer une solution HBS contenant KCl au lieu de NaCl en résolvant (en mM): 145 KCl, MgCl2 1, CaCl2 1, le glucose et 10 HEPES 10 (pH 7,42). </li></ol></li><li> Chargement des cellules de l&#39;hippocampe avec sonde fluorescente de calcium fura2 / AM. <ol><li> Prenez la culture cellulaire contenant des lamelles de l&#39;incubateur et les laver avec un milieu à température ambiante HBS en les transférant à une nouvelle plaque de quatre puits contenant multiple à 500 pi de HBS par puits. </li><li> Incuber les cellules avec fura2 / AM 4 pm (préparés dans le même milieu HBS) pendant 60 min à température ambiante (25 ° C) dans un endroit sombre. </li><li> Après 60 min, laver lamelles avec un milieu HBS frais. </li></ol></li><li> Enregistrement des images de fluorescence cytosolique [Ca2 +] dans des cellules en culture. <ol><li> Allumez la lampe, microscope, système de perfusion, un appareil photo de fluorescence et l&#39;ordinateur. </li><li> Placez les lamelles dans une plate-forme pour thermostatéouverts 12 mm lamelles de verre sur la scène du microscope inversé et sélectionnez un champ microscopique en utilisant un objectif 40X (huile, NA: 1,3). Perfuser cellules en continu avec préchauffé (37 ºC) moyen HBS en l&#39;absence ou la présence de substances d&#39;essai. Maintenir le débit à une vitesse d&#39;environ 5-10 ml / min. Remarque: Cellule système de perfusion de cellules vivantes est montée dans une plate-forme ouverte pour thermostaté 12 mm lamelles de verre. 8 lignes du système de perfusion par gravité équipé d&#39;un dispositif de commande de soupape est utilisé pour perfuser les solutions. Une pompe à vide est responsable de l&#39;enlèvement tout support excès. Les solutions sont chauffées au moyen d&#39;un système de chauffage en tube. </li><li> Capturer une image de fond avec l&#39;obturateur fermé à deux longueurs d&#39;onde d&#39;excitation. </li><li> Epi-éclairer cellules alternativement à 340 et 380 nm. La lumière d&#39;enregistrement émise à 520 nm toutes les 5 à 10 secondes avec un appareil photo de fluorescence, qui est filtré par un miroir dichroïque fura-2. </li><li> Lorsque la période d&#39;enregistrement est terminé, mémoriser la séquence complète oimages f émis à 520 nm dans l&#39;ordinateur pour une analyse ultérieure. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des images fluorescentes enregistrées. <ol><li> Ouvrez le fichier de l&#39;expérience. Utilisation du logiciel de aquacosmos, cliquez sur &quot;Ratio&quot; et sélectionnez la plage de rapport désiré. Calculer le pixel par rapport à des pixels les images résultantes pour obtenir une séquence d&#39;images de rapport. </li><li> Soustraire fond en ajustant le &#39;élimination de fond ». De calcul de démarrage &#39;Press. </li><li> Appuyer sur le bouton et d&#39;effacer les anciennes régions d&#39;intérêt séquence tous les temps »(Rois). Pour l&#39;analyse quantitative des cellules individuelles, établir de nouvelles régions d&#39;intérêt ou ROI correspondant aux neurones individuels. Moyenne de toutes les valeurs de rapport à chaque pixel correspondant à chaque ROI et chaque image afin d&#39;obtenir un enregistrement de valeurs de fluorescence de rapport pour chaque ROI (cellules). </li><li> Pour représenter graphiquement les enregistrements individuels exporter les valeurs rapport de fluorescence correspondant à chaque ROI à un progr graphiqueun m. </li><li> Faites les calculs correspondants pour estimer la taille de la hausse du ratio fluorescences en réponse à chaque stimulation à l&#39;aide d&#39;une analyse de données approprié et graphiquement logiciel. </li></ol></li></ol> 3. La bioluminescence imagerie de mitochondrial Ca 2+ Concentration <ol><li> La transfection de neurones hippocampiques en culture avec le plasmide mitGAmut. REMARQUE: Les cellules sont transfectées avec le premier plasmide contenant une séquence mitGAmut de mitochondries ciblée et une aequorine mutée manque un site de liaison de Ca2 + fusionné à la protéine fluorescente verte (GFP). Cette construction détecte fortes augmentations en Ca2 + mitochondrial absorption et permet d&#39;identifier les cellules transfectées par la fluorescence de la GFP. Le plasmide a été développé et a aimablement fourni par P. Brûlet et ses collègues 18 (CNRS, Paris). <ol><li> Préparer Neurobasal TF, contenant Neurobasal milieu de culture, sans sérum de veau foetal, B27, gentamicet 2 mM de L-glutamine. </li><li> Préparer 50 ul de Neurobasal TF ainsi 2,5 ul réactif de transfection dans un flacon (solution A). Préparer 50 ul de Neurobasal TF plus 4 ug mitGAmut plasmide dans un flacon (solution B). Ajouter délicatement la solution B en solution A. Laisser le mélange pendant 20 min, sans agitation. </li><li> Transférer les lamelles contenant les neurones hippocampiques à de nouvelles plaques Multidish contenant 200 pi de Neurobasal TF frais. </li><li> Ajouter goutte à goutte 100 pi de solution A + B sur chaque lamelle. Incuber pendant 30 min. Retirer le moyen. Laver une fois les cellules avec Neurobasal TF frais. Retourner les lamelles à l&#39;original Neurobasal milieu de culture. </li><li> Les neurones de culture pour une 24 heure supplémentaire à 37 ° C et 5% de CO 2 après la transfection pour permettre l&#39;expression efficace et le ciblage de la sonde. </li></ol></li><li> Préparation de solutions de test pour l&#39;imagerie par bioluminescence. <ol><li> Préparer des solutions HBS contenant NMDA 100 um ou 145 mM de KCl queci-dessus (étape 2.1). Préparer une solution contenant HBS mM Ca 2+, plus 10 digitonine 100 um. </li></ol></li><li> Reconstitution de aequorine mitochondries ciblée avec coelentérazine n. <ol><li> Lamelles de transfert contenant les neurones hippocampiques transfectées à une plaque de quatre puits contenant 200 pi de HBS. </li><li> Ajouter 4 ul de coelentérazine n (200 uM) à 200 ul de HBS pour une concentration finale de 4 uM et mélanger doucement. Incuber pendant 2 heures à température ambiante (25 ° C) et dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Enregistrement d&#39;images de bioluminescence de mitochondrial [Ca2 +]. <ol><li> Allumer le microscope, la lampe, le système de perfusion, de bioluminescence caméra et l&#39;ordinateur. </li><li> Transfert lamelles reconstituées à un (37 ºC) chambre de perfusion thermostaté et perfuser constamment avec une solution HBS préchauffé à un taux de 5-10 ml / min. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif 40X (huile, NA: 1,3), sélectionner un champ microscopique contenant des cellules exprimant l&#39;unpoaequorins comme indiqué par émission de fluorescence associée à l&#39;expression de la protéine fluorescente verte (GFP) en utilisant les filtres FITC. Un champ typique peut contenir 1-2 cellules transfectées. Capturer l&#39;image de fluorescence de la GFP, en utilisant une caméra CCD. </li><li> Éteignez la lumière du microscope. Retirer la boîte contenant dichroïque situé dans la voie de la lumière. Éteignez la lumière d&#39;excitation et fermer la boîte noire pour l&#39;obscurité complète. </li><li> Perfuser les cellules à 5-10 ml / min avec un milieu HBS avec ou sans solutions de test pré-chauffé à 37 ° C. </li><li> Capturer des images d&#39;émissions photoniques toutes les 10 s avec un appareil de comptage de photons manipulés avec un processeur d&#39;image. </li><li> À la fin de chaque expérience, perméabiliser les cellules avec 0,1 mM digitonine dans 10 mM de CaCl2 dans HBS afin de libérer toutes les émissions photoniques restants. Remarque: Ces émissions photoniques doivent être additionnés afin d&#39;estimer les émissions totales photoniques, une valeur requise pour l&#39;étalonnage de concentrations de Ca2 + &lt;./ li&gt; <li> Images de bioluminescence de magasin dans l&#39;ordinateur avec l&#39;image de fluorescence de la GFP associé capturés avant l&#39;imagerie à comptage de photons. </li></ol></li><li> L&#39;analyse d&#39;images de bioluminescence reflétant mitochondrial [Ca2 +]. <ol><li> Quantifier les émissions photoniques utilisant un logiciel spécifique. Émissions photoniques peuvent être convertis en Ca 2+ libre mitochondrial concentration ([Ca2 +] mit) en utilisant l&#39;algorithme décrit par Brini et al. 15. </li><li> Ouvrir l&#39;expérience et l&#39;image de fluorescence de la GFP. Sélectionnez régions d&#39;intérêt (ROI) avec l&#39;aide d&#39;un logiciel spécifique en dessinant la forme des cellules transfectées selon les images de fluorescence capturés au début de l&#39;expérience. </li><li> Collez les mêmes ROI sur chaque image. Le total des émissions photoniques dans chaque ROI sont calculées avec le logiciel spécifique pour obtenir la valeur d&#39;émission de luminescence (L) pour chaque cellule à chaque point dans le temps. </li><li> Ajouter tout le SIGE photoniquedes ions dans les images de bioluminescence, y compris ceux obtenus après perméabilisation digitonine, en utilisant le logiciel spécifique, pour obtenir une image de bioluminescence contenant toutes les émissions photoniques. </li><li> La valeur des exportations des émissions photoniques pour chaque région d&#39;intérêt à un logiciel spécifique pour les calculs. Pour ce faire, cliquez sur &quot;Graph&quot; afin de calculer les valeurs de bioluminescence pour chaque ROI à chaque fois. Sélectionnez «valeur totale» et «utiliser ROI actuelle à toutes les images. Appuyez sur &#39;Calculer&#39;. Enregistrez le &#39;txt.file&#39; et exporter des données vers une feuille de calcul. Pour chaque ROI, [Ca 2+] mit est calculé en utilisant l&#39;algorithme suivant: [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; où, R = [L / (L totale λ)] 1 / n L est la luminescence émise au moment de la mesure dans chaque région d&#39;intérêt. L total estla luminescence totale restant après l&#39;addition des chiffres présents dans le tissu à ce moment au moment de la mesure pour chaque région d&#39;intérêt. λ, TR K, K R et n sont des constantes dont les valeurs dépendent combinaison de aequorine (type sauvage ou muté) et coelenterazin utilisé (type sauvage ou de type n) ainsi que la température 16 enregistrement. Pour la combinaison utilisée ici (muté AEQ et coelenterzine n), à 37 ºC, nous avons utilisé les valeurs suivantes: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 et λ = 0,138. </li></ol></li><li> Faites les calculs correspondants pour estimer la taille des hausses de bioluminescence en réponse à chaque stimulus utilisant une analyse de données approprié et graphiquement logiciel. </li></ol>

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<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), 1067(2009).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a d’intérêts concurrents ou conflictuels.

Le remodelage de Ca 2+ intracellulaire homéostasie dans le cerveau de vieillissement a été liée à la perte cognitive, une susceptibilité accrue aux lésions ischémiques, excitotoxicité et la neurodégénérescence. Pour vérifier cette hypothèse in vitro, les procédures d&#39;imagerie de CA sont disponibles. Malheureusement, cultures viables de vieux neurones de l&#39;hippocampe ne sont pas fiables. Récemment, il a été observé que les cultures à long terme de neurones d&#39;hippocampe de rat de...

L&#39;excitotoxicité est l&#39;un des mécanismes les plus importants qui contribuent à une lésion neuronale et la mort cellulaire dans injurieux neurologiques tels que l&#39;ischémie, et dans certaines maladies neurodégénératives telles que la maladie d&#39;Alzheimer 1. Ce type de neurotoxicité est principalement médiée par le glutamate agissant sur ​​Ca 2+ -permeable, les récepteurs NMDA (NMDAR ionotropique) 2. L&#39;exposition des neurones cultivés à glutamate peut entraîner des excitotoxicité 3, ce qui provoque l&#39;apoptose neuronale 4. Nous et d&#39;autres avons précédemment rapporté que la vulnérabilité neuronale à l&#39;apoptose induite par le NMDA peut changer avec le développement in vitro et le vieillissement de 5-8. Il est largement admis que l&#39;augmentation de la libre cytosolique-concentration de Ca 2+ ([Ca 2+] CYT) conduit à l&#39;activation des cellules. Toutefois, si cette hausse est trop élevée et / ou assez soutenue, il peut déclencher la mort cellulaire 9. En outre, il a été proposéque excitotoxicité nécessite Ca 2+ mitochondrial absorption 10, puisque le traitement des neurones avec un neurones découplant mitochondrial protégées contre induite par le glutamate mort cellulaire 11. Si mitochondries prennent trop de Ca 2+, de l&#39;ouverture du pore de transition mitochondrial perméabilité peut se produire, conduisant à la libération de cytochrome c et d&#39;autres facteurs pro-apoptotiques, et induisant l&#39;apoptose. Nous avons récemment montré que cette mitochondrial Ca2 + absorption est directement liée à la sensibilité dépendant de l&#39;âge à l&#39;excitotoxicité, en mesurant directement NMDA induite par Ca2 + mitochondrial absorption dans les neurones hippocampiques individuelles 5, un procédé qui est indiqué dans cet article. L&#39;hippocampe, impliquée dans les processus physiologiques tels que l&#39;apprentissage, la mémoire et d&#39;autres processus cognitifs 12, est très vulnérable au vieillissement et les troubles neurodégénératifs 13. Il a été proposé que, après plusieurs semaines in vitro, en cultureneurones de l&#39;hippocampe montrent un certain nombre de caractéristiques typiques des neurones âgées de 14. En conséquence, les neurones d&#39;hippocampe en culture à long terme peuvent fournir un modèle global pour enquêter Ca 2+ mécanismes médiées de excitotoxicité accrue dans le vieillissement. L&#39;objectif global de la méthode présentée est, par conséquent, pour enquêter sur des changements substantiels dans l&#39;homéostasie intracellulaire de Ca2 + ou Ca 2+ remodelage dans le vieillissement du cerveau, y compris les réponses de l&#39;écart Ca induites par des agonistes des récepteurs NMDA dans un long-terme neurones d&#39;hippocampe en culture . Le procédé comprend une description détaillée de la culture des neurones d&#39;hippocampe de rat et de la surveillance des concentrations de Ca2 + cytosolique et mitochondriale par fluorescence et l&#39;imagerie par bioluminescence dans les neurones individuels, respectivement. Imagerie de fluorescence de Ca2 + cytosolique dans des neurones en culture est une procédure standard. Cependant, cette méthode est moins fiable pour souscellulaire, y compris les mesures de Ca2 + mitochondrial Ca 2+. Les raisons en sont le manque de ciblage des sondes synthétiques et d&#39;affinité inapproprié pour concentrations de Ca2 + qui peuvent changer dans les mitochondries du niveau de iM faible, même au niveau mM. L&#39;utilisation de Ca 2+ sondes à base de protéines comme par exemple l&#39;aequorine, a permis de cibler les organelles subcellulaires et à l&#39;utilisation de dérivés différentes affinités Ca2 + en utilisant différentes sondes ou cœlentérazines mutées dépourvues de Ca 2+ spécifique 15 sites de liaison. De cette manière, l&#39;imagerie par bioluminescence de cellules exprimant l&#39;aequorine mitochondriale ciblée peut permettre le contrôle des concentrations de Ca2 + mitochondrial dans des neurones individuels. Pourtant, cette procédure peut nécessiter l&#39;utilisation de caméras de comptage de photons ou des caméras CCD ultrasensibles pour la bioluminescence imagerie 16-18. Cette méthode peut donner de nouveaux résultats qui devraient être confirmée dans plus establMINE modèles de vieillissement du cerveau que, par exemple, des tranches de cerveau de vieux animaux.

<table><tbody><tr><td>Milieu de culture neurobasale Gibco</td><td></td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Milieu HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Ham F-12</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (du pancréas bovin)</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bobine fœtale</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre de 12 mm</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>plaques multi-paraboles à 4 puits</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Plats Petry</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 Microscope TV</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d’éclairage Xcite</td><td>Caméra à fluorescence EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER</td><td>Caméra</td> CCD à comptage de photons Hamamatsu <td></td><td></td></tr><tr><td>VIM Contrôleur de</td> soupape <td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8</td> Système de chauffage <td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B&nbsp ;</td><td>Warner Instruments Aquacosmos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence et bioluminescence imagerie des subcellular ca<sup&gt; 2+</sup&gt; in aged neurones de l&#39;hippocampe

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

La sensibilité à la mort cellulaire neuronale associée à la neurodégénérescence et l&#39;ischémie sont extrêmement augmentée dans le cerveau mais vieilli mécanismes responsables sont mal connus. L&#39;excitotoxicité, un processus censé contribuer à des lésions des neurones induite par les deux injurieux, est médiée par l&#39;activation des récepteurs du glutamate, qui favorise l&#39;influx de Ca2 + et Ca2 + mitochondrial surcharge. Un changement important dans l&#39;homéostasie intracellulaire de Ca2 + ou remodelage de Ca2 + intracellulaire homéostasie peut favoriser des dommages neurone dans les vieux neurones. Pour étudier le remodelage de Ca2 + dans le vieillissement, nous avons utilisé l&#39;imagerie de cellules vivantes dans les cultures à long terme de neurones hippocampiques de rat qui ressemblent à certains égards neurones in vivo âgés. Pour cette fin, cellules de l&#39;hippocampe sont, en premier lieu, fraîchement dispersé de nouvelles hippocampes né de rat et plaqués sur des lamelles couché, verre poli-D-lysine. Puis les cultures sont conservés dans les médias contrôlés pendant plusieurs jours ou plusieurs wEeks pour enquêter jeunes et vieux neurones, respectivement. Deuxièmement, des neurones en culture sont chargés avec fura2 et soumis à des mesures de la concentration cytosolique de Ca2 + en utilisant l&#39;imagerie de fluorescence de rapport numérique. Troisièmement, des neurones en culture sont transfectées avec des plasmides exprimant un tandem de faible affinité équorine et la GFP ciblée vers les mitochondries. Après 24 heures, l&#39;aequorine l&#39;intérieur des cellules est reconstitué avec coelentérazine et les neurones sont soumis à l&#39;imagerie par bioluminescence pour la surveillance de la concentration en Ca2 + mitochondrial. Cette procédure en trois étapes permet la surveillance des réponses mitochondriaux et cytosoliques Ca2 + à des stimuli appropriés comme par exemple l&#39;agoniste des récepteurs du glutamate NMDA et de comparer si ces réponses et d&#39;autres sont influencés par le vieillissement. Cette procédure peut donner de nouvelles indications sur la façon dont le vieillissement influence cytosolique et les réponses Ca 2+ mitochondriales à des stimuli sélectionnés ainsi que les essais de médicaments sélectionnés visant à prévenir neuronela mort dans les maladies liées à l&#39;âge.

Nous décrivons ici une méthode simple pour évaluer le remodelage de Ca2 + et les effets de NMDA sur cytosolique et mitochondriale [Ca2 +] dans les neurones ans. La figure 1 montre le schéma de la procédure d&#39;isolement et de culture de neurones de l&#39;hippocampe des rats nouveau-nés. Avant de commencer, nous devons nous préparer, enduits, lamelles stériles poly-D-lysine verre et de les localiser dans un plat 4 puits. Ensuite, les rats nouveau-nés sont tués et enlevés le cervea...

Le remodelage intracellulaire en Ca2+ au cours du vieillissement peut contribuer à l’excitotoxicité et aux lésions neuronales, processus médiés par la surcharge en Ca2+. Notre objectif était d’étudier le remodelage du Ca2+ dans le cerveau vieillissant en utilisant l’imagerie par fluorescence et bioluminescence du Ca2+ cytosolique et mitochondrial dans des cultures à long terme de neurones de l’hippocampe du rat, un modèle de vieillissement neuronal.

Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neurones de l&#39;hippocampe

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier le remodelage du calcium dans le cerveau vieillissant à l'aide d'imagerie par fluorescence et bioluminescence du calcium cytosolique et mitochondrial dans des cultures à long terme de neurones hippocampiques de rat, considérées comme un modèle de vieillissement neuronal. Cette méthode peut aider à comprendre des questions clés dans le domaine du vieillissement, telles que la manière dont le remodelage du calcium intracellulaire contribue à l'excitotoxicité et aux lésions neuronales, toutes deux liées à un surcharge en calcium. Le principal avantage de cette technique est qu'il est possible de suivre de près le remodelage du calcium dans des neurones individuels en utilisant des cultures à différents jours in vitro (DIV) provenant du même spécimen. La duplication de cette technique pourrait conduire à des applications thérapeutiques après un accident vasculaire cérébral ou dans les maladies neurodégénératives, car elle met en évidence une cible novatrice liée au surcharge en calcium dans ces pathologies liées au vieillissement.Après avoir visionné cette vidéo, Jésus aura une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'imagerie de fluorescence et de réminiscence du calcium cytosolique et mitochondrial dans des cultures à court et à long terme de neurones hippocampiques de rat. Pour commencer cette procédure, répartir les lamelles sur une bande de paraforme dans une boîte de Pétri. Ensuite, appliquer 200 microlitres de poly-D-lysine à une concentration de un milligramme par millilitre sur chaque lamelle et laisser en traitement toute la nuit.Le lendemain, lavez les lamelles avec de l’eau stérile doublement distillée toutes les 15 minutes pendant 90 minutes, en conditions stériles. Placez les lamelles dans la plaque multi-puits et maintenez-les dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 jusqu’à utilisation. Pour isoler les neurones hippocampiques, ouvrez le crâne des ratons nouveau-nés avec des ciseaux stériles, extrayez le cerveau à l’aide d’une spatule et rincez-le rapidement dans le milieu Ham’s F12.Effectuez ensuite une incision diagonale avec le scalpel dans chaque hémisphère et transférez-le dans la boîte de Pétri contenant le milieu Hams F 12 sous le microscope. Éliminez les méninges. Identifiez soigneusement l'hippocampe à son emplacement caractéristique concave au-dessus du cortex.Ensuite, séparez l'hippocampe du cortex en l'extrayant délicatement à l'aide de ciseaux oculaires. Puis, transférez les fragments d'hippocampe dans un flacon contenant 1,8 millilitre de solution de pepane préfiltrée. Incubez-les à 37 degrés Celsius avec un agitation douce occasionnelle pendant 15 minutes.Ensuite, ajoutez 90 microlitres de la solution tampon d'ADN. Ajoutez 50 microgrammes par millilitre et incubez pendant encore 15 minutes. Après cela, transférez le tissu dans un tube à centrifuger de 10 millilitres et lavez les fragments avec un milieu de culture neurobasal frais.Obtenir une suspension cellulaire en faisant passer les fragments de tissu à travers une pipette en plastique de cinq millilitres. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire à 160 G pendant cinq minutes. Par la suite, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur stérile en plastique et resuspendre délicatement le culot dans un millilitre de milieu de culture neurobasal à l’aide d’une pipette automatique d’un millilitre.Ensuite, mesurez la densité cellulaire à l'aide d'une chambre de comptage de Neubauer. Ajoutez 10 microlitres de suspension cellulaire et comptez le nombre de cellules au microscope. Effectuez ensuite les calculs correspondants pour obtenir entre 40 et 80 microlitres de suspension cellulaire, contenant environ 30 000 cellules.Dans la plaque à quatre puits contenant 500 microlitres de milieu neurobasal, déposer environ 30 000 cellules dans chaque puits contenant des lamelles en verre. Maintenir les cellules dans l’incubateur pendant deux à cinq jours in vitro pour les neurones jeunes, ou plus de 15 jours in vitro pour les neurones âgés. Dans cette procédure, incuber les cellules avec moins de 2:00 AM pendant 60 minutes à température ambiante et à l’abri de la lumière.Ensuite, transférez les lamelles dans la chambre de perfusion. Puis, placez la chambre de perfusion contenant la lamelle dans le support du microscope inversé. Sélectionnez le champ microscopique et perfusez continuellement les cellules avec du HBS préchauffé.Ensuite, éclairez les cellules respectivement à 340 et 380 nanomètres. En alternance, enregistrez ensuite la lumière émise à 520 nanomètres toutes les cinq à dix secondes à l’aide d’une caméra fluorescente, filtrée par un miroir dichroïque Fira Two. Pour analyser les images fluorescentes enregistrées, ouvrez d’abord le fichier d’expérience à l’aide du logiciel Aqua Cosmos, cliquez sur « ratio » et sélectionnez la plage de ratio souhaitée.Calculez le rapport pixel par pixel dans les images résultantes afin d'obtenir une séquence d'images de rapport. Ensuite, soustrayez le fond en ajustant le bouton d'élimination du fond. Après cela, appuyez sur démarrer le calcul.Ensuite, appuyez sur le bouton de toute la séquence temporelle et effacez les anciennes zones d'intérêt (ROIs) pour l'analyse quantitative des cellules individuelles. Définissez de nouvelles zones d'intérêt ou les zones d'intérêt correspondant aux neurones individuels. Pour représenter graphiquement les enregistrements individuels, exportez les valeurs de fluorescence rapportées correspondant à chaque zone d'intérêt vers le logiciel Origin en cliquant sur graphique.Ensuite, cliquez sur calculer et enregistrez le fichier TXT. Après cela, effectuez le calcul correspondant pour estimer l'ampleur de l'augmentation du rapport de fluorescence en réponse à chaque stimulation afin de transfecter les neurones en culture avec le plasmide portant la mutation MIT. Préparez d'abord 50 microlitres de la solution A contenant le réactif de transfection dans un flacon.Ensuite, préparez 50 microlitres de solution B contenant le plasmide MIT ute dans un flacon. Ajoutez la solution B à la solution A et incubez pendant 20 minutes. Transférez ensuite les lamelles contenant les neurones hippocampiques vers de nouvelles plaques multi-puits contenant 200 microlitres de milieu neuro basal TF frais. Ajoutez alors 100 microlitres de la solution A et B goutte à goutte sur chaque lamelle et incubez pendant 30 minutes.Après 30 minutes, retirez le milieu. Lavez les cellules avec du milieu neurobasal neuf. Remettez ensuite les lamelles dans le milieu de culture neurobasal d'origine et cultivez les cellules pendant 24 heures après la transfection afin de permettre une expression et un ciblage efficaces de la sonde.Ensuite, ajoutez quatre microlitres de scellant TEREZIN N à 200 microlitres de HBS pour obtenir une concentration finale de quatre micromolaire. Mélangez doucement et incubez pendant deux heures à température ambiante à l'abri de la lumière. Après deux heures, transférez les lamelles dans la chambre de perfusion et perfusez-les en continu avec la solution HBS préchauffée.Pour enregistrer les images de bioluminescence de la concentration en calcium mitochondrial, sélectionnez le champ microscopique contenant les cellules exprimant APO corin, tel qu'indiqué par l'émission de fluorescence. Ensuite, éteignez la lumière du microscope. Retirez la boîte contenant le miroir dichroïque située dans le trajet lumineux.Ensuite, éteignez la lumière d'excitation et fermez la boîte noire pour obtenir une obscurité complète. Perfusez les cellules avec le milieu HBS, avec ou sans solutions test préalablement réchauffées à 37 degrés Celsius. Puis capturez les images d'émission photonique toutes les 10 secondes à l'aide d'une caméra de comptage de photons pilotée par un processeur d'images.Ensuite, ajoutez dig toin pour libérer tous les photons restants afin d'analyser les images bioluminescentes reflétant le calcium mitochondrial. Ouvrez l'image de fluorescence GFP. Sélectionnez des régions d'intérêt (ROI) individuelles en dessinant autour des cellules transfectées.Ensuite, copiez et collez les mêmes régions d'intérêt (ROI) sur chaque image de la séquence. Captures d'écran. Par la suite, exportez les valeurs d'émission photonique pour chaque ROI vers le logiciel spécifique permettant de calculer le graphique en cliquant dessus.Afin de calculer les valeurs pour chaque région d'intérêt (ROI), sélectionnez ensuite la valeur totale et appliquez le ROI actuel à toutes les images. Ensuite, cliquez sur Calculer, enregistrez le fichier texte et exportez les données. Procédez ensuite aux calculs correspondants pour estimer l'ampleur des augmentations de calcium mitochondrial en réponse à chaque stimulus présenté.Voici des images représentatives en champ clair et en couleurs pseudo-colorées de cultures à court et à long terme de neurones hippocampiques, avant et après stimulation par 100 micromolaire et MDA. Les teintes plus chaudes reflètent une concentration cytosolique en calcium élevée. Ces tracés montrent les enregistrements individuels représentatifs de la concentration cytosolique en calcium en réponse à 100 micromolaire et MDA, dans des cultures à court et à long terme de neurones hippocampiques. Remarquez que les augmentations de la concentration cytosolique en calcium sont beaucoup plus importantes dans les neurones cultivés à long terme que dans ceux cultivés à court terme.Dans cette expérience, des neurones hippocampiques en culture ont été transfectés avec la korine ciblant les mitochondries à faible affinité fusionnée à la GFP, puis incubés avec quatre micromoles de scellant térézine, et soumis à une imagerie bioluminescente de la concentration calcique mitochondriale. Voici les enregistrements montrant la libération d'émissions lumineuses reflétant le calcium mitochondrial dans des neurones hippocampiques en culture à court et à long terme. Une concentration de 100 micromoles de MDA augmente la concentration calcique mitochondriale dans les neurones âgés, mais pas dans les neurones hippocampiques jeunes en culture, suite à cette procédure.D'autres méthodes, telles que l'évaluation de la fair left, peuvent être combinées à l'imagerie par fluorescence et bioluminescence dans les mêmes cellules afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la susceptibilité aux cellules neuronales, les anomalies liées à la neurodégénérescence associée au vieillissement et à l'ischémie.

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In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d&#39;imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine

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Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca

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