Neuronal Tracing dans des explants de cerveau à guidage laser

L’objectif global de cette méthode est de marquer les neurones et leurs projections axonales afin de retracer leurs connexions aux noyaux cérébraux cibles ou sources d’intérêt. Cette méthode permet de répondre à des questions clés en neurosciences telles que les modèles de connectivité entre différentes zones ou sous-populations neuronales du cerveau, ainsi que leur signification fonctionnelle pour un circuit neuronal donné. Le principal avantage de cette technique est l’augmentation de la précision de la cible lors des injections de traceurs.

Ceci est réalisé en utilisant un équipement optique de base pour visualiser les noyaux cérébraux marqués par fluorescence. Un autre avantage de cette méthode est qu’elle permet un génotypage non invasif de pops de souris qui expriment des protéines fluorescentes sous le contrôle de promoteurs neuronaux. Lors du génotypage, les chiots vérifient l’expression des marqueurs fluorescents respectifs à l’aide d’un pointeur laser avec la longueur d’onde d’excitation appropriée.

Dans le même temps, portez des lunettes filtrantes qui bloquent la longueur d’onde d’excitation, mais dépassent la longueur d’onde d’émission. Pointez le laser vers l’arrière de la tête ou la moelle épinière du chiot en question. Veillez à ne pas braquer le laser dans les yeux du P’S et à garder l’exposition au laser courte.

Les marqueurs fluorescents excités doivent être visibles à travers la peau. Lorsque la souris est plus âgée, les neurones individuels des tissus récoltés peuvent être identifiés. Après avoir anesthésié la souris et vérifié l’absence de réflexe, retirez la peau du crâne, coupez la peau le long de l’arrière de la tête jusqu’à la section médiane du crâne.

Chez des souris encore plus âgées de plus d’un mois, la fluorescence peut être observée à travers les yeux de l’animal. Ensuite, à l’aide de PBS trans Cardi glacé, perfuser le marqueur positif de l’animal à l’aide d’une aiguille de calibre 30, après cinq à 10 minutes, la majeure partie du sang sera retirée. Ensuite, retirez le cerveau et disséquez la région d’intérêt.

Ici, le corps trapézoïdal, qui est constitué de deux bulbes proéminents dans la région ventrale du cerveau, contient la région d’intérêt. Les noyaux ventraux des corps trapézoïdaux ou VNTB commencent par le transfert de la région cérébrale explantée d’intérêt dans une boîte de solution de dissection oxygénée. Là. Fixez l’explan avec des aiguilles de seringue de calibre 30 de manière à ce que la zone d’injection soit accessible sur le dessus.

Pour l’injection, utilisez des pipettes d’injection tirées en verre de silicate Bo qui sont fabriquées en trois ou quatre cycles de traction. Chargez la pipette avec la solution suivante. La toxine cholérique sous-unité B conjuguée à Alexa FLUORA 4 5 55, qui est principalement destinée au transport rétrograde.

Avec le pointeur laser et les pipettes d’injection, toutes montées et prêtes à l’emploi, dirigez le faisceau vers la région ou les cellules cérébrales marquées à injecter. Observez le champ à travers les lunettes de filtre passe-bande pour voir quels neurones cibler avec la pipette d’injection. Utilisez le micromanipulateur pour positionner la pipette dans la zone d’intérêt.

Ensuite, à l’aide d’un injecteur de pression réglé pour délivrer des impulsions de 50 millisecondes à 15 PS, j’injecte la substance traceur en deux à 10 impulsions. Laisser passer 10 à 15 secondes entre les impulsions pour que le colorant injecté puisse se propager. Lors de l’injection de tétraéthyle rumine, stimulez électriquement la région avec l’électrode de stimulation délivrant des impulsions TTL.

Assurez-vous que l’électrode est mise à la terre dans la solution du bain. Délivrez huit impulsions TTL de huit volts chacune d’une durée de 50 millisecondes avec des intervalles de 50 millisecondes. Stimulez la région avec 10 à 20 répétitions d’impulsions sur plusieurs minutes.

Les noyaux cérébraux varient en taille, en densité neuronale et en types de cellules. Cela signifie que la durée et le nombre d’impulsions de pression et/ou électriques peuvent devoir être ajustés pour obtenir des résultats de marquage optimaux pour une région cérébrale donnée. À l’aide du laser et des lunettes de protection, vérifiez le signal de traçage fluorescent.

Le colorant doit être absorbé par les cellules et répandu autour de la zone injectée. Après l’injection, incubez les troncs cérébraux dans du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné à température ambiante pendant une à quatre heures. Maintenir l’oxygénation pendant l’incubation, puis fixer le tissu dans 4 % d’aldéhyde paraforme.

Dans le PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain, le tissu peut être tranché et monté une injection intergrade dans le noyau ventral du corps trapézoïdal ou VNTB. L’utilisation de la dextrine tétraéthyle rodine montre que les projections du VNTB s’étendent au noyau médial du corps trapézoïdal, ou MNTB. Ensuite, le MNTB a été injecté avec de la cholétoïne, sous-unité B, qui a rétro-étiqueté le VNTB.

Plus en détail, les somates des cellules glyc entériques VNTB semblaient être marquées ensuite. Le MNTB a été injecté avec le marqueur rétrograde dextrine tri. Contrairement au modèle ponctué de l’étiquetage CTB, l’étiquetage de la dextrine était dense et semblable à GOGI.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étiqueter les neurones et leurs processus avec une précision accrue. La technique démontrée vous aide à identifier les zones cérébrales et les sous-populations neuronales participant à un circuit neurologique donné une fois maîtrisée, la procédure d’injection peut être effectuée en environ 30 minutes si elle est effectuée correctement. Cette procédure peut être facilement combinée avec d’autres méthodes telles que l’immunochimie ou le nettoyage du cerveau pour répondre à des questions supplémentaires concernant la morphologie, la directionnalité ou la fonctionnalité des projections neuronales et d’autres structures neuronales.