Électrotaxie l'étude des cellules du cancer du poumon à l'aide d'un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

L'objectif général de cette expérience microfluidique est d'évaluer les effets des inhibiteurs de kinases sur la migration des cellules tumorales sous l'effet d'un champ électrique direct. Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les études de migration cellulaire électrotactique, telles que quelles sont les voies déterminantes dans la migration dirigée par champ électrique des cellules cancéreuses. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'il s'agit d'une étude électrotactique hautement reproductible et économique en temps, facilement réalisable.

Les implications de cette technique s'étendent au diagnostic du pouvoir métastatique du cancer. Étant donné que la mobilité des cellules cancéreuses magnétiques peut être augmentée par un champ électrique, cette méthode peut fournir un test intracellulaire, électro-testiculaire des cellules tumorales.

Il peut également être appliqué au processus de régénération cutanée, comme la cicatrisation des plaies. Commencez par utiliser un logiciel de conception et de dessin pour dessiner le motif d'une couche acrylique individuelle. Enregistrez le motif, puis activez le graveur laser.

Connectez le graveur au portable de commande et cliquez sur le fichier du motif conçu pour ouvrir le motif de la couche acrylique. Ensuite, placez une plaque d'acrylique vierge sur la platine X, Y, Z du graveur laser et utilisez le bâtonnet d'alignement automatique approprié du graveur laser. Réglez ainsi le point focal du faisceau laser sur la surface de la plaque.

Envoyer le motif conçu au graveur laser pour l'usinage direct de la feuille d'acrylique. Ensuite, utiliser une pince pour retirer le papier protecteur des feuilles d'acrylique et nettoyer les surfaces à l'aide de gaz azote. Empiler ensuite les feuilles et les assembler sous une pression de deux kilogrammes par centimètre carré dans un appareil de collage thermique pendant 45 minutes à 110 degrés Celsius afin de former l'ensemble du canal de stimulation électrique par écoulement.

Après avoir préparé le ruban adhésif double face de la même manière, fixez le verre de couverture propre à l'assemblage du canal de stimulation électrique à écoulement. Ensuite, utilisez de la colle cyanoacrylate pour fixer 13 adaptateurs en acrylique aux orifices individuels de la couche un du dispositif MDF (multi-canaux à double champ électrique) afin de mettre en place le réseau de pont salin du dispositif MDF. Commencez par relier des tubes en plastique rigides à l'assemblage du dispositif MDF via les adaptateurs d'entrée et de sortie intermédiaires.

Ensuite, reliez le raccord conique du tube en plastique d'entrée et de sortie du milieu à un robinet trois voies. Connectez une seringue de trois millilitres contenant 2,5 millilitres de PBS équilibré au dioxyde de carbone au robinet trois voies du tube en plastique d'entrée, et une seringue de trois millilitres vide au robinet trois voies du tube en plastique de sortie. Utilisez des écrous blancs solides vissés à la main pour sceller les orifices des raccords bleu et vert sur la feuille acrylique de la couche un. Puis, remplissez les canaux du pont salin et les chambres de culture avec le PBS équilibré au dioxyde de carbone, en prenant soin d'éviter les bulles.

Transférez la puce dans une étuve à cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit afin de permettre à l'air dissous dans le ruban double face de former des bulles dans les chambres le lendemain matin. Utilisez les deux seringues pour générer un flux rapide de PBS afin d'éliminer les bulles, en pompant le PBS en va-et-vient si nécessaire. Une fois toutes les bulles retirées, utilisez le robinet à trois voies relié au tube de sortie du milieu pour évacuer le PBS des canaux.

Ensuite, remplacez la seringue reliée à l'entrée par une seringue de trois millilitres contenant 2,5 millilitres de DM EM saturé en dioxyde de carbone et remplissez à nouveau les chambres avec le milieu jusqu'à ce qu'elles soient pleines. Retirez les écrous solides des raccords verts et injectez 3 % d'aros chauffé à au moins 70 degrés Celsius dans le canal du pont salin. Par les ouvertures des raccords, faites chauffer la solution saline en vue de l'injection, en veillant à bloquer la rangée médiane située entre les chambres de culture.

Cessez d'injecter l'agros lorsque le composé remplit les trois quarts de la longueur du canal du pont salin et rebouchez les pores avec les écrous solides. Remplacez ensuite les écrous solides sur les raccords bleus par des écrous tubulaires translucides à serrage manuel et chargez de l'aros dans les écrous tubulaires. Insérez ensuite des électrodes d'argent, chlorure d'argent dans les écrous tubulaires avant que l'aros ne durcisse.

Pour mettre en place une expérience électrotactique, injecter 0,3 millilitre de cellules dans la puce MDF par le tube de sortie, puis replacer la puce dans l'incubateur de culture cellulaire. Après deux à quatre heures, installer le système microfluidique MDF sur un chauffage en verre transparent d'oxyde d'indium-étain et fixer une sonde thermocouple de type K entre la puce MDF et le verre d'oxyde d'indium-étain. Pour mesurer la température de la puce, utiliser un contrôleur proportionnel intégral dérivé afin de régler la température d'incubation du système microfluidique MDF à 37 °C, puis monter l'ensemble de la puce MDF sous contrôle thermique sur la platine motorisée XYZ contrôlée par ordinateur d'un microscope inversé.

Ensuite, à l’aide d’une pompe à seringues à quatre canaux, distribuez le milieu complet dans les chambres de culture par les entrées à un débit de 20 microlitres par heure. Recueillez les déchets de culture provenant des sorties dans des tubes microcentrifuge. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant encore 16 à 18 heures.

Le lendemain, remplacer le milieu dans chaque chambre par du milieu frais supplémenté avec la concentration appropriée d'inhibiteur de kinase, pendant un traitement de 60 minutes. Ensuite, connecter une alimentation électrique continue à la puce MDF à l'aide des électrodes en argent, chlorure d'argent, et en série. Connecter un ampèremètre au circuit électrique afin de surveiller le courant électrique dans la puce MDF.

Enfin, allumez l'alimentation électrique et réglez la tension entre 15 et 19 volts. Réglez le courant de l'ampèremètre à 86,94 microampères. Dans cette expérience représentative menée avec un système microfluidique MDF, des cellules de cancer du poumon ont été traitées avec différentes concentrations d'un inhibiteur de kinase.

Y 2 7 6 3 2 n'a montré aucun changement de la vitesse de migration cellulaire avec ou sans stimulation électrique. Toutefois, le traitement par Y 2 7 6 3 2 en présence d'un champ électrique a réduit de manière significative le caractère aléatoire de la migration des cellules cancéreuses. En effet, à une concentration de 50 micromolaire, l'inhibiteur de la protéine ROCK a éliminé complètement le mouvement aléatoire des cellules sans affecter leur vitesse de migration.

En outre, une corrélation dépendante de la dose a été observée entre les concentrations chimiques appliquées et l'indice de directionnalité, confirmant la fiabilité et l'efficacité du système microfluidique MDF comme méthode d'étude des axones. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept à huit heures si elle est correctement exécutée après son développement. Cette méthode offre aux chercheurs dans le domaine de l'électrophysiologie cutanée de nouvelles possibilités d'exploration.

N'oubliez pas que le travail avec un racloir laser peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.