Name: Intensification des Perles dans le développement dembryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur lexpression des gènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Apprenez à greffer des perles dans les bourgeons de membres d'embryons de poulet pour étudier l'expression des gènes et les voies de signalisation. Cette méthode permet de tester directement les facteurs de croissance in vivo.

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Ce travail a été en partie financé par une bourse de début de carrière de l’Université de Nottingham à DS. RM est financé par le Comité supérieur pour le développement de l’éducation d’Irak.

Déclaration éthique: Toutes ces expériences suivent le soin des animaux et les directives éthiques de l&#39;Université de Nottingham. 1. Préparation des billes d&#39;héparine pour le greffage <ol><li> Lavez perles d&#39;héparine soigneusement dans du PBS avant de l&#39;utiliser. Remarque: Les billes peuvent être conservées à 4 ° C sous forme de suspension dans du PBS. <ol><li> Choisir des perles pour le greffage en les retirant du stock avec une pipette de 20 pi en une baisse de 1 ml de PBS. Ensuite, utilisez une micropipette réglé à 2 pi de transférer des perles dans une goutte de 20 pi de PBS dans une boîte de Pétri de 3 cm. Choisissez perles basées sur la taille et, en utilisant une chaîne stéréo microscope de dissection, transférer perles sélectionnées avec une pointe de pipette P2; ceux autour de 100 um de diamètre sont idéales. </li></ol></li><li> Retirez le PBS à partir des perles. Retirer la plupart du liquide avec une pipette de 20 et le liquide résiduel par capillarité avec des horlogers pince fine. Remarque: Il est important d&#39;éliminer autant que possible de sorte que la croissance factoR ne soit pas dilué quand il est ajouté aux billes. </li><li> Pipeter le facteur de croissance directement sur les billes. Pour FGF18 ajouter 0,5 ul de FGF18 recombinant reconstitué à 0,5 mg / ml dans 0,1% de BSA dans du PBS. Placez plusieurs gouttes d&#39;eau sur les bords de la cuvette pour empêcher le liquide de l&#39;évaporation. </li><li> Incuber les perles pendant 1 heure à température ambiante. Retirez les gouttes d&#39;eau dans le plat avec une pipette Pasteur et le placer sur la glace prête pour la greffe. </li><li> Si nécessaire (pour perles transparentes) transfert 4-5 perles à 2% de phénol rouge avant la greffe pour aider les visualiser. Rincer dans du PBS avant de les transférer à l&#39;embryon. </li></ol> 2. Préparation de Perles AG 1-X2 pour le greffage <ol><li> Avant d&#39;utiliser dériver perles avec 0,2 N de l&#39;acide formique. <ol><li> Pour ce faire, utilisez une spatule pour transférer des perles à un tube de 1,5 ml. Ajouter 1 ml d&#39;acide formique 0,2 N et lavis sur une plate-forme agitation pendant 1 h. </li><li> Ensuite, retirez le acide formique avec une pipette P1000 et le remplacer par 1ml d&#39;eau. Laver pendant 1 heure et répéter six fois pour évacuer le reste de l&#39;acide formique. </li><li> Retirer le liquide restant avec une pipette P1000 et stocker les perles à 4 ° C. Remarque: Il est pas nécessaire de retirer toute l&#39;eau résiduelle à ce stade. </li></ol></li><li> Retirer une petite pastille de perles d&#39;environ 5-10 volume ul du stock à l&#39;aide d&#39;une petite spatule dans une boîte de Pétri de 3 cm et ajouter 1 ml de DMSO (ou tout autre solvant, le médicament est dissous dans). Note: Ceci doit fournir plusieurs centaines de perles partir de laquelle sélectionner ceux de la bonne taille. </li><li> Ensuite, utilisez une pipette de P2 réglé à 2 pi de transférer perles d&#39;environ 100 um de diamètre à une baisse de 20 pi de solvant dans une autre boîte de Pétri de 3 cm. </li><li> Retirer le solvant avec une pipette 20 ul et tout solvant résiduel avec une pipette de 2 ul. Remplacer avec 20 ul de médicament à appliquer. Remarque: Pour la cohérence dissoudre le médicament à une concentration de 100 uM dans du DMSO (ou qui jamais solvant est utilisé),aliquote dans 20 pi et conserver à -80 ° C que certains inhibiteurs de petites molécules sont instables et il est préférable d&#39;éviter de répéter congélation-décongélation. Si nécessaire puis diluer le médicament à la concentration souhaitée avant trempage des billes. Peuvent avoir besoin d&#39;être déterminée empiriquement pour chaque médicament concentrations efficaces. </li><li> Incuber pendant 1 heure. Protéger de la lumière le plus grand nombre de ces molécules sont sensibles à la lumière. </li><li> Avant transfert greffage 4-5 perles avec une pipette de p2 fixé à 2 ul dans 20 ul de 2% de rouge de phénol dissous dans l&#39;eau. Effectuez cette étape en utilisant un microscope à dissection stéréo pour visualiser les perles. Retirer une seule bille avec des horlogers pince fine ou une boucle de fil et rincer dans du PBS avant de les transférer à l&#39;embryon. Ne laissez pas des perles dans 2% de phénol rouge pour plus de 15 minutes avant de l&#39;utiliser, car cela peut entraîner une perte d&#39;activité. </li></ol> 3. Préparer tungstène Aiguilles <ol><li> Couper le fil de tungstène fine dans 3-4 cm de longueur. Insérer une pièce de fil dans l&#39;extrémité deune pipette Pasteur en verre et faire fondre dans un brûleur Bunsen pour fixer en position. Préparer jusqu&#39;à 10 aiguilles pour assurer qu&#39;il ya des pièces de rechange si elles sont endommagées lors de l&#39;utilisation. </li><li> Placez l&#39;extrémité du fil dans une flamme chalumeau et l&#39;y maintenir jusqu&#39;à ce que le tungstène est blanc et la pointe est forte (environ 2-3 min). Remarque: Lors de l&#39;utilisation de l&#39;aiguille peut être nettoyé et ré-aiguisé dans le chalumeau au besoin. NOTE: Ces aiguilles peuvent également être utilisés pour faire des boucles pour le transfert de perles. Toucher doucement l&#39;aiguille sur le banc et il se plie pour former une boucle. </li></ol> 4. Préparer les embryons perles greffes <ol><li> Incuber les oeufs avec l&#39;extrémité émoussée jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade désiré (3-5 jours pour la plupart des manipulations branche bourgeon). En utilisant une pince émoussée tap sur l&#39;extrémité émoussée à casser la coquille, puis utiliser les forceps pour retirer la coque et d&#39;exposer l&#39;embryon. Assurer la membrane coquille est également supprimé. REMARQUE: 1-2 ml de PBS peut être ajouté avec une pipette Pasteur pour aider àsi cette colle à la membrane du jaune. Pipette doucement le PBS sur la surface du jaune, saisir la membrane avec la pince, en prenant soin de ne pas endommager le jaune, et tirez délicatement de l&#39;œuf. </li><li> Retirer jusqu&#39;à 5 ml d&#39;albumine de l&#39;œuf avec une seringue de 10 ml et d&#39;une aiguille G 19. Prenez seulement autant que nécessaire pour assurer l&#39;embryon ne fait pas de contact avec la bande utilisée pour sceller l&#39;œuf que la suppression de volumes plus importants peuvent réduire les taux de survie des embryons. </li><li> Pour visualiser l&#39;embryon ajoutez 5-6 gouttes d&#39;artistes encre de chine à 15 ml de PBS contenant 100 U de pénicilline et de la streptomycine 0,1 mg / ml. Injecter 0,5 à 1 ml, directement sous l&#39;embryon avec une seringue de 1 ml et une aiguille 25 G. </li><li> Ajouter 2-3 ml de PBS avec 1% de sérum de veau foetal et 100 UI de pénicilline et de streptomycine 0,1 mg / ml dans l&#39;œuf afin d&#39;assurer l&#39;embryon ne pas se déshydrater. Utilisation aiguisés horlogers pince retirer la membrane vitelline et ouvrez l&#39;amnios sur les bourgeons de membres en développement. Assurez l&#39;embryon ne se dessèche pas et, Si nécessaire, ajouter plus de PBS / FCS. REMARQUE: Les bourgeons des membres peuvent être clairement considérés comme des excroissances appariés sur le flanc de l&#39;embryon. À ces stades de l&#39;embryon se révélera comme le côté droit est normalement supérieure. En conséquence, il est normalement plus facile de greffer des perles dans les membres droits et d&#39;utiliser ceux de gauche que les contrôles controlatéral. </li><li> Utilisez un fil de tungstène aiguisé de faire une incision dans le bourgeon de membre où le cordon sera implanté. Évitez de couper tout le chemin à travers le bourgeon de membre, si possible, bien qu&#39;à jeunes stades, cela est difficile. NOTE: Dans les embryons âgés (stade HH 22 et ci-dessus), il est possible de sélectionner des régions spécifiques du bourgeon de membre pour le greffage mais jeunes stades cela est plus difficile que le bourgeon de membre lui-même est petite. Il est également important de se rappeler que le bourgeon de membre va croître delà du cordon greffé sorte, surtout au jeunes stades, la perle restera dans la branche proximale. </li><li> Procurez-vous un cordon soit du facteur de croissance ou de la drogue en utilisant soit wa extra-finetchmakers forceps ou une boucle faite à partir d&#39;une aiguille de tungstène. Si le cordon a été trempé dans du DMSO soit ou rouge de phénol, rincer dans du PBS avant de l&#39;appliquer à l&#39;embryon. Transférer le bourrelet à l&#39;embryon à la pince / boucle de fil. Ensuite, utilisez le fil de tungstène affûtée pour insérer le cordon dans l&#39;incision. </li><li> Ajouter 1-2 ml de PBS / FCS à l&#39;œuf veiller à ce que l&#39;embryon est maintenu hydraté, mais éviter d&#39;appliquer directement sur l&#39;embryon lui-même car cela peut endommager les embryons et provoquer le bourrelet à être délogé. Sceller l&#39;œuf avec du ruban adhésif et revenir à l&#39;incubateur. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;utilisation de greffons de perles appliquées directement au développement des tissus in ovo est un outil puissant pour disséquer le rôle de la signalisation du facteur de croissance au cours du développement donnant un contrôle inégalé sur le stade de développement à laquelle ils sont appliqués et la durée d&#39;exposition. Le choix du bourrelet pour chaque type de molécule est importante. Les petites molécules hydrophobes, tels que les inhibiteurs décrits ici et l&#39;acide rétinoïque...

Embryons aviaires ont fourni un outil puissant pour l&#39;étude du développement depuis de nombreuses années 1. Un de leurs caractéristiques les plus utiles est qu&#39;ils sont relativement faciles à manipuler. Développement externe permet d&#39;ouvrir l&#39;œuf pour accéder à l&#39;embryon et effectuer diverses micromanipulations y compris des exemples tels que le système de chimère caille-poulet classique pour étudier le destin des cellules 2,3, l&#39;injection de rétrovirus pour surexpression dans des tissus spécifiques au cours du développement 4,5 et explant pour identifier les sources de signalisation de développement 6. Plus récemment chimères généré entre les hôtes non étiquetés avec greffes provenant d&#39;une lignée de poulet transgénique exprimant la GFP a montré que la combinaison de greffage classique et modification génétique peut fournir des informations importantes sur le développement 7,8. La facilité avec laquelle l&#39;embryon aviaire peut être manipulé en a fait un excellent modèle pour l&#39;étude de branche9 développement. Application des facteurs de croissance spécifiques aux membres en développement in vivo a joué un rôle dans l&#39;identification des facteurs qui modifient branche structuration 10,11 et continue de fournir des indications sur ce processus 12. Cette approche a également été utilisée pour étudier les facteurs qui régulent le développement musculaire et a découvert de nombreux rôles pour les signaux tels que Wnts 13, HGF PGB 14 et 15. Récemment, cette technique a été utilisée pour étudier les signaux contrôlant l&#39;expression du gène myogénique dans le bourgeon de membre et a montré que les interactions entre FGF18 et l&#39;acide rétinoïque peuvent contrôler le moment de l&#39;expression de MyoD 16. En utilisant une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules qui peuvent être chargés sur des billes puis greffées directement dans les tissus spécifiques à des stades de développement définis donne la possibilité d&#39;intervenir à presque tout moment et la région au cours du développement. Cela a été utilisé pour investigate de nombreux processus, y compris la structuration 17,18 somites, la spécification de neurones 19, la migration de la crête neurale 20 et l&#39;extension de l&#39;axe 21. Nous décrivons ici un procédé de greffage des perles trempées dans soit des facteurs de croissance ou des inhibiteurs dans le développement des membres de poulet. Cela a été utilisé pour déterminer les effets de ces signaux sur la myogenèse par l&#39;analyse de l&#39;expression génique spécifique du muscle avec une hybridation in situ. Nous décrivons des greffons en utilisant soit des perles trempées héparine, qui sont utilisés pour des facteurs de croissance, ou des perles AG 1-X2 pour les petites molécules hydrophobes tels que l&#39;acide rétinoïque ou de petites molécules inhibitrices de voies de signalisation spécifiques. Cependant, d&#39;autres perles sont également disponibles qui ont été utilisées pour fournir à la fois FGF 22 et 23 Shh.

<table><tbody><tr><td>Perles acryliques héparine</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>Les perles acrylique-héparine utilisées ont été abandonnées. Cependant, un produit de remplacement est disponible, des billes d’héparine d’agarose, cat no H6508. Ceux-ci sont transparents, donc plus difficiles à travailler, mais peuvent être colorés au rouge de phénol de la même manière que les billes AG 1-X2,</td></tr> <tr><td>les billes AG 1-X2</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Les perles bleues Affi Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301 ; 153-7302</td><td>Ces billes ont été utilisées avec une gamme de facteurs de croissance, y compris Shh et FGF et peuvent être utilisées pour remplacer les billes d’héparine</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>Remettre en suspension dans du PBS avec 0/1 % de BSA, préparer des aliquotes à usage unique de 0,5 à 1 ul et les conserver à -80 °C. Les lots et les fournisseurs peuvent varier, de sorte que différentes concentrations doivent être testées pour déterminer une dose efficace.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9903</td><td>Fabriquer à 20 mM stocker dans du DMSO et stocker dans des aliquotes à usage unique à -80&deg ;C. Protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>Remettre en suspension dans le DMSO et stocker dans des aliquotes à usage unique à -80&deg ;C. Protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>Encre noire de</td><td>Chine Windsor et Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>Bien qu’il existe des alternatives à ce produit, il faut faire attention car certaines encres sont toxiques pour les embryons</td></tr><tr><td>Fil de tungstène, 0,1 mm de diamètre 99,95 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline / streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Diluer 100X dans PBS/encre et PBS/FCS</td></tr></tbody></table>

intensification des perles dans le développement d&#39;embryons de poulet limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur l&#39;expression des gènes

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Utilisation des embryons de poulet, il est possible de tester directement les effets soit de facteurs de croissance ou des inhibiteurs spécifiques de voies sur l&#39;expression des gènes et l&#39;activation des voies de transduction de signaux de signalisation. Cette technique permet la livraison de molécules à des stades de développement définis avec précision pour des moments précis de signalisation. Après cela, les embryons peuvent être récoltées et l&#39;expression des gènes examinés, par exemple par hybridation in situ, ou l&#39;activation des voies de transduction de signaux observées par immunocoloration. Dans cette vidéo, perles d&#39;héparine trempés dans FGF18 ou AG perles 1-X2 trempés dans U0126, un inhibiteur de MEK, sont greffés dans le bourgeon de membre in ovo. Cela montre que FGF18 induit l&#39;expression de MyoD et la phosphorylation de ERK et d&#39;expression à la fois endogène et FGF18 induite MyoD est inhibée par U0126. Perles trempés dans un antagoniste de l&#39;acide rétinoïque peuvent potentialiser prématurée MyoD induction par le FGF18. Cette approche peut être noused avec un large éventail de facteurs différents et les inhibiteurs de croissance et est facilement adaptée à d&#39;autres tissus de l&#39;embryon en développement.

A l&#39;étape 21 HH MyoD est pas exprimée dans le développement des membres myoblastes bien que la coloration peut être vu dans le myotome des somites en développement (Figure 1A). La figure 1B montre l&#39;hybridation in situ pour MyoD six heures suivant une greffe de talon FGF18. MyoD est induite dans les myoblastes à proximité de la bille tandis que il n&#39;y a aucune expression dans le membre contralateral. Co-greffage d&#39;un bourrelet trempé dans U0126, un inhibiteur sp...

En greffant des billes imbibées de facteurs de croissance ou d’inhibiteurs spécifiques des voies de signalisation dans les embryons en développement, il est possible de tester directement leurs effets in vivo. Dans ce protocole, des billes sont greffées dans le bourgeon du membre pour déterminer les effets de ces molécules sur l’expression des gènes et la transduction du signal.

Intensification des Perles dans le développement d&#39;embryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur l&#39;expression des gènes

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment déterminer les effets des facteurs de croissance et des inhibiteurs sur l'expression génique des membres en développement chez l'embryon de poulet. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la manière dont les molécules de signalisation influencent la croissance et la différenciation des cellules in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit une méthode permettant de tester directement ces facteurs dans l'embryon.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le développement des membres, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que le tissu nerveux, les somites ou la gastrulation. La procédure sera démontrée par Rebeea Mohammed, étudiante diplômée de mon laboratoire. Pour commencer, transférez un millilitre des billes à partir de la solution mère initiale dans un tube neuf.Laisser les billes se déposer, puis éliminer le liquide et le remplacer par un millilitre de PBS. Répéter cette étape cinq fois et conserver les billes lavées à quatre degrés Celsius, sous forme de suspension dans du PBS. Sélectionner les billes à greffer en les prélevant à partir de la solution mère lavée à l’aide d’une pipette de 20 microlitres et les placer dans un millilitre de PBS.À l’aide d’un stéréomicroscope, sélectionnez des billes d’environ 100 microns de diamètre. Transférez les billes sélectionnées dans deux microlitres de liquide dans une nouvelle boîte de Pétri contenant une goutte de 20 millilitres de PBS. Ensuite, retirez le PBS des billes. Tout d’abord, à l’aide d’une pipette de 20 microlitres, puis éliminez le liquide résiduel par action capillaire en utilisant une pince fine de montreur.Il est important d’éliminer autant de liquide que possible afin que le facteur de croissance ne soit pas dilué lorsqu’il est ajouté aux billes. Déposer le facteur de croissance directement sur les billes à l’aide d’une pipette. Pour le FGF18, ajouter 0,5 microlitre de FGF18 recombinant, reconstitué à 0,5 milligramme par millilitre dans du PBS contenant 0,1 pour cent d’albumine sérique bovine (BSA).Ensuite, déposez plusieurs gouttes d'eau autour des bords de la boîte pour éviter l'évaporation du liquide. Une fois prêt, incubez les billes pendant une heure à température ambiante. Après l'incubation, retirez les gouttes d'eau de la boîte à l'aide d'une pipette Pasteur et placez la boîte sur de la glace.Dérivatiser les billes en commençant par transférer les billes à l'aide d'une spatule dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, ajouter un millilitre d'acide formique 0,2 N et incuber les billes dans l'acide sur une plateforme agitée pendant une heure. Puis, laisser les billes se déposer, éliminer l'acide formique et le remplacer par un millilitre d'eau.Lavez les billes pendant une heure sur une plaque agitatrice et répétez le lavage six fois afin d'éliminer tout acide formique résiduel. Après le dernier lavage, retirez le liquide restant et conservez les billes à quatre degrés Celsius. Utilisez une spatule pour prélever une petite quantité de billes d’environ cinq à dix microlitres de volume à partir du stock, puis placez les billes dans une boîte de Pétri de 30 millilitres.Ensuite, ajoutez un millilitre de DMSO. Puis, utilisez une pipette P2 réglée sur deux microlitres pour transférer des billes d'environ 100 microns de diamètre dans une goutte de solvant de 20 microlitres dans une autre boîte de Pétri de 30 millilitres. Éliminez la majeure partie du solvant à l’aide d’une pipette de 20 microlitres et tout solvant résiduel à l’aide d’une pipette de deux microlitres.Ensuite, recouvrez les billes avec 20 microlitres du médicament à appliquer, dissous dans du DMSO. Incubez les billes dans la solution de médicament pendant une heure. Protégez les billes de la lumière, car de nombreuses molécules médicamenteuses sont sensibles à la lumière.Pour faciliter la visualisation des billes, transférez quatre à cinq billes dans deux microlitres de liquide, dans 20 microlitres de rouge de phénol à deux pour cent dissous dans l'eau. Retirez une bille à l'aide de pinces de précision fines et rincez-la dans du PBS. Ne laissez pas les billes plus de 15 minutes dans la solution de rouge de phénol avant de les rincer, car cela pourrait entraîner une perte d'activité.Coupez un fil fin de tungstène en morceaux de trois à quatre centimètres de longueur. Ensuite, insérez un morceau de fil à l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre et faites-le fondre à l'aide d'un bec Bunsen pour le fixer en place. Préparez jusqu'à 10 aiguilles afin d'avoir des pièces de rechange en cas de dommage. Puis, placez l'extrémité du fil dans la flamme d'un chalumeau et maintenez-la jusqu'à ce que le tungstène rougisse intensément et que la pointe devienne affûtée.Cela prend environ deux à trois minutes. Ajouter cinq à six gouttes d'encre de Chine pour artistes à 15 millilitres de PBS contenant 100 unités de pénicilline et 0,1 milligramme de streptomycine par millilitre. Pour préparer les embryons de poulet, incuber les œufs avec l'extrémité émoussée vers le haut jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade souhaité pour la plupart des manipulations des bourgeons des membres, généralement trois à cinq jours.Lorsque le point temporel souhaité est atteint, utilisez une pince effilée pour taper sur l'extrémité émoussée de l'œuf et briser la coquille. Ensuite, utilisez la pince pour retirer la coquille et exposer l'embryon. Veillez à ce que la membrane cellulaire de l'œuf soit également retirée.Pour visualiser l'embryon, injecter du PBS supplémenté avec quelques gouttes d'encre de Chine pour artiste sous l'embryon à l'aide d'une seringue d'un millilitre et d'une aiguille de calibre 21. La membrane vitelline recouvrant l'embryon peut alors être retirée à l'aide de pinces fines. Ensuite, ajouter deux à trois millilitres de PBS supplémenté contenant un pour cent de sérum de veau fœtal, 100 unités par millilitre de pénicilline et 0,1 milligramme par millilitre de streptomycine dans l'œuf afin de s'assurer que l'embryon ne se déshydrate pas.À l’aide de pinces de montreur aiguisées, ouvrez l’amnios au-dessus des bourgeons limbiques en développement. À ces stades, l’embryon tourne généralement de manière à ce que le côté droit soit le plus en haut. Veillez à ce que l’embryon ne s’assèche pas en ajoutant davantage de solution PBS supplémentée lorsque cela est nécessaire.L'amnios entourant l'embryon peut être ouvert à l'aide d'une fine aiguille en tungstène afin de révéler le membre en développement. Ensuite, utiliser le fil de tungstène aiguisé pour pratiquer une incision dans l'bourgeon du membre à l'endroit où la microbille sera implantée. Éviter, dans la mesure du possible, de couper entièrement à travers l'bourgeon du membre.Bien qu’à des stades plus jeunes, ceci soit difficile. Prendre une perle, revêtue soit du facteur de croissance soit du médicament, à l’aide de pinces très fines de montreur. Si la perle a été imprégnée de DMSO ou de rouge de phénol, veiller à ce qu’elle soit rincée au PBS avant de l’appliquer à l’embryon.Transférez la billette à l’embryon à l’aide de la pince, puis utilisez le fil de tungstène aiguisé pour insérer la billette à l’endroit de l’incision. Ajoutez un à deux millilitres supplémentaires de la solution PBS supplémentée dans l’œuf afin de maintenir l’hydratation de l’embryon. Évitez d’appliquer la solution directement sur l’embryon lui-même, car cela pourrait endommager l’embryon et provoquer le délogement de la billette.Ensuite, utilisez une seringue de dix millilitres équipée d'une aiguille de calibre 19 pour retirer uniquement l'albumine nécessaire afin de garantir que l'embryon n'entre pas en contact avec le ruban utilisé pour sceller l'œuf. Veillez à ce que l'aiguille n'endommage pas le jaune en la faisant glisser le long de l'intérieur de la coquille. Enfin, scellez l'œuf avec du ruban adhésif et remettez-le dans l'incubateur.Afin de confirmer que le FGF18 est capable d'agir via MEK pour phosphoryler ERK, les embryons ont été prélevés une heure après la greffe de la perle et immunomarqués en vue de détecter la présence d'ERK phosphorylé, que l'on peut observer entourant la perle greffée sur l'image de droite. Au stade HH 21, MyoD n'est pas exprimé dans les myoblastes en développement des membres. Bien que la coloration soit visible dans le myotome des somites en formation.Six heures après la greffe d'une microbille chargée de FGF18, on observe une induction de MyoD dans les myoblastes situés à proximité de la microbille, tandis qu'aucune expression n'est détectée dans le membre controlatéral. Cette expression peut être inhibée par la co-greffe d'une microbille enrobée d'un inhibiteur de MEK, tel que l'U0126.De même, la greffe d'une perle imprégnée de U0126 au stade HH 21 réduit l'expression endogène de MyoD après 24 heures, par rapport au membre controlatéral non traité. Dans les bourgeons des membres, au stade HH 19, le FGF18 n'induit pas MyoD. Toutefois, la co-greffe de perles imprégnées de FGF18 et d'un antagoniste de l'acide rétinoïque permet de surmonter cet effet, et une expression ectopique de MyoD est détectée.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre minutes, si elle est effectuée correctement. Le développement de cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement d'explorer la signalisation des facteurs de croissance lors du développement de l'embryon. Lors de la réalisation de cette technique, il est important de ne pas laisser l'embryon sécher.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment greffer des billes dans des embryons en développement afin de déterminer l'effet des signaux des facteurs de croissance sur le développement.

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Intensification des Perles dans le développement dembryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur lexpression des gènes (Vidéo) | JoVE Journal

Intensification des Perles dans le développement d'embryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur l'expression des gènes

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