Intensification des Perles dans le développement d'embryons de poulet Limbs pour identifier les voies de transduction du signal influant sur l'expression des gènes

L’objectif général de cette procédure est de montrer comment déterminer les effets des facteurs de croissance et des inhibiteurs dans l’expression génique des membres d’embryons de poulet en développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que l’influence des molécules de signalisation sur la croissance et la différenciation des cellules in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode pour tester ces facteurs directement dans l’embryon.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du développement des membres, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que le tissu neural, les somites ou la gastrulation. Rebeea Mohammed, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, transférez un millilitre de billes de la solution mère d’origine dans un tube frais.

Laissez les billes se déposer, puis retirez le liquide et remplacez-le par un millilitre de PBS. Répétez cette étape cinq fois et stockez les billes lavées à quatre degrés Celsius, sous forme de boue dans du PBS. Sélectionnez les billes à greffer, en les retirant de la solution mère lavée à l’aide d’une pipette de 20 microlitres et placez-les dans un millilitre de PBS.

À l’aide d’un stéréoscope, choisissez des perles d’environ 100 microns de diamètre. Transférez les billes sélectionnées dans deux microlitres de liquide dans une nouvelle boîte de Pétri contenant une goutte de 20 millilitres de PBS Ensuite, retirez le PBS des billes. Tout d’abord, à l’aide d’une pipette de 20 microlitres, puis retirez le liquide résiduel par capillarité à l’aide d’une pince d’horloger fin.

Il est important d’enlever autant de liquide que possible afin que le facteur de croissance ne soit pas dilué lorsqu’il est ajouté aux billes. Pipetez le facteur de croissance directement sur les billes. Pour le FGF18, ajouter 0,5 microlitre de FGF18 recombinant, ajouter 0,5 milligramme par millilitre dans du PBS avec 0,1 pour cent de BSA.

Ensuite, placez plusieurs gouttes d’eau sur les bords du plat pour éviter que le liquide ne s’évapore. Lorsque vous êtes prêt, incubez les perles pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, retirez les gouttes d’eau de la boîte à l’aide d’une pipette Pasteur et placez la boîte sur de la glace.

Dérivatisez les billes, en utilisant d’abord une spatule pour transférer les billes dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez un millilitre d’acide formique normal 0,2 et incubez les billes dans l’acide sur une plate-forme agitante pendant une heure. Ensuite, laissez les billes se déposer, retirez l’acide formique et remplacez-le par un millilitre d’eau.

Lavez les billes pendant une heure sur la plate-forme de secouage et répétez le lavage six fois pour éliminer tout résidu d’acide formique. Après le dernier lavage, retirez le liquide restant et stockez les perles à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une spatule, retirez une petite palette de perles d’environ cinq à dix microlitres de volume et placez les perles dans une boîte de Pétri de 30 millilitres.

Ensuite, ajoutez un millilitre de DMSO. Ensuite, utilisez une pipette P2 réglée sur deux microlitres, pour transférer des billes d’environ 100 microns de diamètre, sur une goutte de 20 microlitres de solvant dans une autre boîte de Pétri de 30 millilitres. Retirez la majeure partie du solvant à l’aide d’une pipette de 20 microlitres et tout solvant résiduel à l’aide d’une pipette de deux microlitres.

Ensuite, recouvrez les billes de 20 micro-litres du médicament à appliquer, dissous dans du DMSO. Incuber les billes dans la solution médicamenteuse pendant une heure. Protégez les billes de la lumière, car de nombreuses molécules médicamenteuses sont sensibles à la lumière.

Pour aider à visualiser les billes, transférez quatre à cinq perles dans deux microlitres de liquide, dans 20 microlitres de rouge de phénol à deux pour cent dissous dans l’eau. Retirez une seule perle à l’aide d’une pince d’horloger fine et rincez la perle au PBS. Ne laissez pas les billes dans la solution de rouge de phénol pendant plus de 15 minutes avant de les rincer, car cela peut entraîner une perte d’activité.

Coupez un fil de tungstène fin en longueurs de trois à quatre centimètres Ensuite, insérez un morceau de fil à l’extrémité d’une pipette Pasteur en verre et faites-le fondre dans un bec Bunsen pour le fixer en place. Préparez jusqu’à 10 aiguilles pour vous assurer qu’il y a des pièces de rechange si elles sont endommagées. Ensuite, placez l’extrémité du fil dans une flamme de chalumeau et maintenez-le là jusqu’à ce que le tungstène brille en blanc et que la pointe soit tranchante.

Cela prend environ deux à trois minutes. Ajoutez cinq à six gouttes d’encre de Chine d’artiste à 15 millilitres de PBS contenant 100 unités de pénicilline et 0,1 milligramme de streptomycine par millilitre. Pour préparer les embryons de poule, incubez les œufs avec l’extrémité émoussée jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade souhaité pour la plupart des manipulations des bourgeons des membres, qui est généralement de trois à cinq jours.

Lorsque le point temporel souhaité est atteint, utilisez une pince émoussée pour taper sur l’extrémité émoussée de l’œuf et casser la coquille. Ensuite, utilisez la pince pour retirer la coquille et exposer l’embryon. Assurez-vous que la membrane de l’ovule est également retirée.

Pour visualiser l’embryon, injectez du PBS complété par quelques gouttes d’encre de Chine d’artiste, sous l’embryon avec une seringue d’un millilitre et une aiguille de calibre 21. La membrane vitelline qui recouvre l’embryon peut ensuite être retirée à l’aide de fines pinces. Ensuite, ajoutez deux à trois millilitres d’un PBS supplémenté avec un pour cent de sérum de veau fœtal, 100 unités par millilitre de pénicilline et 0,1 milligramme par millilitre de streptomycine dans l’œuf pour vous assurer que l’embryon ne se déshydrate pas.

À l’aide d’une pince d’horloger aiguisée, ouvrez l’amnion sur les bourgeons en développement. À ces stades, l’embryon tourne généralement, de sorte que le côté droit soit le plus haut. Assurez-vous que l’embryon ne se dessèche pas en ajoutant plus de solution PBS supplémentée si nécessaire.

L’amnios entourant l’embryon peut être ouvert à l’aide d’une fine aiguille de tungstène pour révéler le membre en développement. Ensuite, utilisez le fil de tungstène aiguisé pour faire une incision dans le bourgeon du membre où la perle sera implantée. Évitez de couper tout le long du bourgeon de la branche, dans la mesure du possible.

Bien qu’à des stades plus jeunes, cela soit difficile. Prélever une perle, enduite soit du facteur de croissance, soit d’un médicament à l’aide d’une pince d’horloger extrafine. Si la perle a été trempée dans du DMSO ou du rouge de phénol, assurez-vous qu’elle est rincée avec du PBS avant de l’appliquer sur l’embryon.

Transférez la perle sur l’embryon à l’aide de la pince, puis utilisez le fil de tungstène aiguisé pour insérer la perle à l’endroit de l’incision. Ajoutez un à deux millilitres supplémentaires de la solution PBS supplémentée à l’œuf pour vous assurer que l’embryon reste hydraté. Évitez d’appliquer la solution directement sur l’embryon lui-même, car cela pourrait endommager l’embryon et provoquer le délogement de la perle.

Ensuite, utilisez une seringue de dix millilitres, équipée d’une aiguille de calibre 19, pour ne retirer que la quantité d’albumine nécessaire pour vous assurer que l’embryon n’entre pas en contact avec le ruban utilisé pour sceller l’ovule. Assurez-vous que l’aiguille n’endommage pas le jaune, en la faisant glisser à l’intérieur de la coquille. Enfin, scellez l’œuf avec du ruban adhésif et remettez-le dans l’incubateur.

Afin de confirmer que FGF18 est capable d’agir par l’intermédiaire de MEK pour phosphoryler ERK, les embryons ont été récoltés une heure après la greffe de billes et immunomarqués pour la présence de ERK phosphorylée, que l’on peut voir entourer la bille greffée dans l’image de droite. Au stade HH 21, MyoD n’est pas exprimé dans les myoblastes des membres en développement. Bien que des taches puissent être observées dans le myotome des somites en développement.

Six heures après une greffe de bille FGF18, MyoD peut être observé induit dans le myoblaste près de la bille. Alors qu’il n’y a pas d’expression dans le membre controlatéral. Cette expression peut être inhibée par co-greffe d’une bille, enrobée d’un inhibiteur de MEK tel que U0126.

De même, la greffe d’une bille U0126 au stade HH 21 réduit l’expression endogène de MyoD après 24 heures, par rapport au membre controlatéral non traité. Dans les bourgeons des membres, au stade HH 19, FGF18 n’induit pas de MyoD. Cependant, la co-greffe de billes imbibées de FGF18 et d’un antagoniste de l’acide rétinoïque peut surmonter cela, et un MyoD ectopique est détecté.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre minutes, si elle est exécutée correctement. Le développement de cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement d’explorer la signalisation des facteurs de croissance dans le développement de l’embryon. Lorsque vous essayez cette technique, il est important de ne pas laisser l’embryon se dessécher.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de greffer des billes dans des embryons en développement pour déterminer comment la signalisation des facteurs de croissance affecte le développement.