Name: Organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes destomac et microinjection de Helicobacter pylori (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Découvrez la culture d'organoides gastriques humains et murins dérivés de cellules souches adultes pour modéliser les maladies infectieuses. Cette technique permet d'étudier les interactions entre Helicobacter pylori et l'épithélium gastrique en trois dimensions.

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Ce travail a été soutenu par la bourse Marie Curie de l’UE (EU/300686-InfO) à S.B. et un prix de recherche de la Fondation européenne unie de gastroentérologie à H.C. Nous tenons à remercier Harry Begthel, Jeroen Korving et le Centre d’imagerie Hubrecht pour leur assistance technique, Meritxell Huch pour son aide avec la culture initiale d’organoïdes et Yana Zavros pour la discussion.

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Hans Clevers est l’inventeur de plusieurs brevets pour la culture d’organoïdes. Sinon, les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit l’utilisation d’organoïdes primaires non transformés en constante expansion à partir de cellules souches adultes pour la biologie des infections. Les étapes critiques sont i) l’isolement des glandes viables, ii) l’expansion des organoïdes et iii) la micro-injection. Vous trouverez ci-dessous quelques suggestions de modifications, de dépannage et de considérations techniques. 
Par rapport à d’autres méthodes d’isolement, qui utilisent une agitation vigoureuse ou un pipetage ...

L&#39;étude des agents pathogènes repose sur des systèmes modèles adéquats pour imiter l&#39;infection in vivo. Pour certains agents infectieux, des systèmes de modèles adéquats font défaut tandis que certains des systèmes utilisés sont loin d&#39;être optimale. Un exemple est la bactérie gastrique Helicobacter pylori (H. pylori), qui est un lien de causalité liée au développement d&#39;un cancer gastrique. Cependant, en l&#39;absence d&#39;un système de culture cellulaire approprié plus, de nombreuses études qui ont pour but d&#39;analyser les mécanismes moléculaires sous-jacents des lignées cellulaires de cancer utilisation de développement de cancer, qui représentent le point d&#39;extrémité de la cascade cancéreuse. Les cellules primaires, non-transformé serait un meilleur modèle pour ces études. Cependant, les cellules primaires sont disponibles uniquement à partir d&#39;un petit nombre de donateurs et ne peuvent pas être cultivées sur des périodes de temps plus longues. Au cours des dernières années, la recherche sur les cellules souches a fait d&#39;importants progrès pour fournir de nouvelles sources de cultures de cellules primaires pour l&#39;étude de la biologie de l&#39;infection. Cultures detrois sources de cellules souches ont été utilisées: des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules pluripotentes induites souches (CISP) ou des cellules souches adultes. Ils ont été utilisés pour modéliser les infections par des virus, tels que le 1,2 cytomégalovirus ou le virus de l&#39;hépatite C 3-7, des parasites tels que Plasmodium falciparum 8 ou 9 Toxoplasma gondii, et les bactéries, telles que Bacterioides thetaiotaomicron 10 ou 11 Salmonella enterica. Plus récemment, plusieurs approches ont été publiés pour modéliser infection à H. pylori avec organoïdes dérivées de cellules iPS ESC ou 12, les cellules souches adultes de souris 21,22 ou humaines cellules souches adultes 13 - 15. Le développement des cultures organoïdes de cellules souches adultes est issue d&#39;une étude, dans laquelle les cellules souches isolées à partir de simples épithélium intestinal murin ont été ensemencées dans une matrice en 3 dimensions etincorporé dans le milieu qui a imité environnement des cellules souches intestinales contenant EGF comme mitogene, R-spondine pour améliorer la signalisation Wnt et Noggin pour inhiber la protéine morphogénique osseuse (BMP) 16 signalisation. Notamment ces cultures ne nécessitent pas de co-culture avec des cellules mésenchymateuses. Dans ces conditions, les cellules souches prolifèrent et forment de petites structures avec des domaines hébergeant des cellules des cryptes intestinales, et les domaines qui contiennent les cellules de la villosité intestinale. Les organoïdes ainsi auto-organisent pour simuler la situation in vivo. Aujourd&#39;hui, les cellules souches adultes de nombreux tissus murins et humains peut être cultivé in vitro et l&#39;auto-organiser en organites qui ressemblent à leur homologue in vivo, tels que l&#39;intestin grêle et le côlon 17, 13,18 estomac, le foie 19,20, du pancréas et 21 22 prostate. Ici, nous fournissons un protocole de vidéo sur la souris de culture ou organoïdes gastriques humaines du cel souches adultesls et les micro-injection avec H. pylori. Ce protocole est basé sur les rapports précédents 13,18. Ce procédé peut être adapté pour la culture et infecter d&#39;autres cultures telles que les organites organoïdes intestinaux.

<table><tbody><tr><td><fort>Moyen</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, DFG, sans phénol</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td>Concentration de matière 200 mM, concentration finale 2 mM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Concentration de matière 50 x, concentration finale 1x</td></tr><tr><td>N-Acétylcystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>Concentration de matière 500 mM, concentration finale 1 mM</td></tr><tr><td>de recombinaison MURINE</td><td>EGF Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>Concentration de base 500 &micro ; g/ml, concentration finale 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant humain FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Concentration de base 100 &micro ; g/ml, concentration finale 200 ng/ml</td></tr><tr><td>TGF&bêta ; i A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Concentration de stock 500 &micro ; M, concentration finale 2 & micro ; M&nbsp ;</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>Concentration de stock 1 M, concentration finale 10 mM&nbsp ;</td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>Concentration de stock 100 &micro ; M, concentration finale 1 nM</td></tr><tr><td>RHOKi Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Concentration de matière 10 mM, concentration finale 10 &micro ; M</td></tr><tr><td>Wnt3A milieu</td><td></td><td></td> conditionné <td>Lignée cellulaire stable générée dans le laboratoire Clevers. Concentration finale 50 %. Les cellules peuvent être obtenues auprès de Hans Clevers.</td></tr><tr>Milieu <td></td><td></td><td>conditionné à la R-spondine1</td><td>Lignée cellulaire stable générée dans le laboratoire Kuo. Concentration finale 10 %. La lignée cellulaire peut être obtenue auprès de Calvin Kuo, Stanford.</td></tr><tr>Milieu <td></td><td></td><td>conditionné Noggin</td><td>Lignée cellulaire stable générée dans le laboratoire Clevers. Concentration finale 10 %. Les cellules peuvent être obtenues auprès de Hans Clevers.</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R& D</td><td>3500-RS/CF</td><td>Autre source de R-spondine. Cela a été testé sur des organoïdes intestinaux humains (1 & micro ; g/ml), mais pas encore sur organoïdes gastriques.</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10</td><td>Source alternative pour la caboche. Cela a été testé sur des organoïdes intestinaux humains (100 ng/ml), mais pas encore sur des organoïdes gastriques.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>solution de dissociation enzymatique</td></tr><tr><td>CoolCell&reg ; Récipients de congélation cellulaire sans alcool</td><td>biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Récupération Culture cellulaire Moyen de congélation</td><td>Invitrogen</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Une composition d’antibiotiques contre les bactéries et les champignons. Il est utile après l’initiation d’une culture. Pour une culture à long terme, vous pouvez passer à d’autres antibiotiques ou aucun.</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Concentration mère 10 000/10 000 U/ml, concentration finale 100/100 U/ml. Peut être utilisé en alternative à Primocin en culture à long terme.</td></tr>Pince à épiler <tr><td><forte>Autre</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Neolabs</td><td>2-1033</td><td>Les pinces à épiler à pointes fines sont utiles pour l’élimination de la couche musculaire du tissu.</td></tr><tr><td>Multiplats à 4 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td>Vous pouvez utiliser d’autres paraboles. Ceux-ci étaient particulièrement utiles pour les micro-injections car ils ont un bord extérieur bas et permettent une plus grande mobilité pour le manipulateur.</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>Narishige</td><td>IM-5B</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Établi</td><td>Clean Air</td><td></td><td>Fabriqué sur mesure pour s’adapter au stéréomicroscope en condition ML2</td></tr><tr><td>Capillaires</td><td>Harvard Appareil</td><td>GC100T-10</td> 1 <td>mm de diamètre extérieur, 0,78 mm de diamètre intérieur.</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td>Flaming Brown Extracteur</td><td></td>de micropipette</tr><tr><td>anti anticorps Cag A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25766</td><td></td></tr></tbody></table>

organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes d&#39;estomac et microinjection de helicobacter pylori

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Récemment, des biologistes infectieux ont utilisé des cultures dérivées de cellules souches pour répondre au besoin de nouveaux modèles plus performants pour étudier les interactions hôte-pathogène. Trois sources cellulaires ont été utilisées : les cellules souches embryonnaires (CSE), les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ou les cellules souches adultes. Ici, la culture d’organoïdes gastriques de souris et d’humains dérivés de cellules souches adultes est décrite et utilisée pour l’infection par l’agent pathogène gastrique Helicobacter pylori. Les glandes gastriques humaines sont isolées à partir de matériel de résection, enracinées dans une matrice basale et intégrées dans un milieu contenant des facteurs de croissance du facteur de croissance épidermique (EGF), de la R-spondine, de la Noggin, de Wnt, du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 10, de la gastrine et du bêta-inhibiteur du facteur de croissance transformant (TGF). Dans ces conditions, les glandes gastriques se transforment en organoïdes tridimensionnels contenant 4 lignées de l’estomac. Les organoïdes se dilatent indéfiniment et peuvent être congelés et décongelés de la même manière que les lignées cellulaires. Pour les études d’infection, les bactéries sont micro-injectées dans la lumière des organoïdes. Les organoïdes infectés sont traités pour l’imagerie. Les méthodes décrites peuvent être adaptées à d’autres organoïdes et à des infections par d’autres bactéries, virus ou parasites. Cela permet d’étudier les changements induits par l’infection dans les cellules primaires.

Ce protocole permet l&#39;isolement des glandes gastriques (figure 2). Presse-étoupe sont ensemencées dans la matrice de sous-sol, qui se solidifie en tant que goutte à l&#39;intérieur d&#39;un puits, fournissant un cadre trois dimensions riche en collagène et la laminine pour permettre les glandes deviennent des organites (Figure 3). Organoïdes commencent généralement que de petits kystes et dans 12-16 jours, ils se dilatent dans des sphères d&#39;un diamètre de 50-300 um (figu...

Les cultures dérivées de cellules souches recèlent un énorme potentiel pour modéliser les maladies infectieuses. Ici, la culture d’organoïdes gastriques de souris et d’humains dérivés de cellules souches adultes est décrite. Les organoïdes sont micro-injectés avec l’agent pathogène gastrique Helicobacter pylori.

Organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes d&#39;estomac et microinjection de Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des organoïdes et de les utiliser comme modèle tridimensionnel pour la biologie des infections. Il y a plusieurs années, mon laboratoire a découvert LDR5 comme marqueur des cellules souches dans plusieurs organes adultes différents chez la souris. Depuis lors, nous avons appris à isoler des cellules souches uniques à partir de ces organes et à les cultiver sous forme d'organoïdes, de petites versions de ces organes. Grâce à la technologie des organoïdes, nous avons désormais démontré qu'il est possible d'étudier le cancer en détail poussé, mais aussi les problèmes liés aux maladies infectieuses.L'avantage principal de cette technique par rapport à la modélisation de la biologie de l'infection à l'aide de lignées cellulaires cancéreuses est que les cellules utilisées ici sont des cellules épithéliales primaires non transformées, et qu'une structure tridimensionnelle est préservée. À partir d'environ un centimètre carré de tissu gastrique frais, dans une boîte de Pétri sèche de 10 centimètres, utilisez une pince pour retirer soigneusement la couche de mucus et la couche musculaire. Lavez le tissu avec du tampon chélatant froid en e

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre une méthode pour établir un modèle d’infection organoïde gastrique en micro-injectant l’agent pathogène gastrique Helicobacter pylori dans la lumière des organoïdes. Ce modèle aide à étudier les changements induits par l’infection dans les cellules gastriques.

Etablissement d’un modèle d’infection par micro-injection d’organoïdes gastriques avec des bactéries pathogènes

Des cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel représentent une amélioration marquée par rapport à la culture des cellules dans des environnements 2-D (par exemple, des flacons ou des boîtes). Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine en culture en microgravité fournies par rotation paroi vasculaire (RWV) bioréacteurs.

Développement d&#39;un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

Souris représentent un modèle inestimable en vivo pour étudier les maladies infectieuses et maladies causées par des micro-organismes gastro-intestinaux. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour étudier les changements histopathologiques dans des modèles murins de Helicobacter pyloriet colonisation bactérienne-maladie liée.

Modèles de souris de l’Infection à Helicobacter et Pathologies gastriques

Nous décrivons ici un protocole pour l’établissement et la mise en culture-anthropique et souris 3 Dimensions (3D) organoïdes gastrique et la méthode de transfert d’organoïdes 3D à une monocouche 2 dimensions. L’utilisation de la couche épithéliale gastrique comme un nouveau dosage zéro-plaie pour études de régénération est également décrite.

Souris - et anthropique de Culture monocouche épithéliales gastriques primaire pour l’étude de la régénération

Les organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) offrent des possibilités passionnantes de modéliser les maladies entériques in vitro. Nous démontrons la différenciation des hiPSCs en organoïdes intestinaux (iHOs), la stimulation de ces iHOs avec des cytokines, et la microinjection de Salmonella Typhimurium dans la lumière de l’OHI, permettant l’étude d’une invasion épithéliale par cette agent.

Utilisation d’organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour étudier et modifier la protection des cellules épithéliales contre la salmonelle et d’autres agents pathogènes

Nous décrivons des protocoles pour préparer des oocysts et purifier des sporozoites pour étudier l'infection des organoïdes intestinaux et de voie aérienne humains par Cryptosporidium parvum. Nous démontrons les procédures pour la microinjection des parasites dans le lumen intestinal organoïde et l'immunostaining des organoïdes. Enfin, nous décrivons l'isolement des oborcystes générés des organoïdes.

Étudier l'infection à Cryptosporidium dans les systèmes de culture organoïde humaine dérivés de tissus 3D par microinjection

Nous présentons ici deux protocoles qui permettent la modélisation des interactions apicales-spécifiques intestinales. Les monocouches intestinales organoïdes-dérivées et les cultures d’interface air-liquide (ALI) facilitent la génération d’épithélium bien différencié accessible des côtés luminal et basolatéral, tandis que les organoïdes intestinaux inversés à polarité exposent leur côté apical et se présentent à des analyses à haut débit.

Méthodes de culture pour étudier les interactions spécifiques aux apicales à l’aide de modèles organoïdes intestinaux

Ce protocole décrit comment infecter les organoïdes intestinaux humains de leur côté apical ou basolatéral pour caractériser les interactions hôte/pathogène au niveau de la cellule unique à l’aide de la technologie de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq).

Adaptation des organoïdes gastro-intestinaux à l’infection pathogène et au séquençage unicellulaire dans des conditions de biosécurité de niveau 3 (BSL-3)

Les organoïdes dérivés de patients gastriques sont de plus en plus utilisés dans la recherche, mais il n’existe pas de protocoles formels pour générer des organoïdes gastriques humains à partir de digestats unicellulaires avec une densité d’ensemencement standardisée. Ce protocole présente une méthode détaillée pour créer de manière fiable des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie obtenus lors de l’endoscopie haute.

Etablissement et caractérisation d’organoïdes gastriques dérivés de patients à partir de biopsies d’épithélium gastrique bénin et d’épithélium antral

Ce protocole décrit la génération d’un modèle murin à base d’organoïdes prostatiques cultivé en 2D. Elle comprend la dissociation organoïde, l’ensemencement cellulaire, la différenciation, l’évaluation de l’intégrité épithéliale et l’infection in vitro par Escherichia coli uropathogène. Le modèle offre une accessibilité apicale et convient à l’étude des interactions hôte-pathogène, surmontant ainsi les limites des systèmes organoïdes 3D traditionnels.

Génération d’un modèle à base d’organoïdes prostatiques de souris pour étudier les interactions hôte-pathogène

L’étude présente une méthode d’investigation in vitro des infections bactériennes à l’aide d’organoïdes intestinaux dérivés des cellules souches tissulaires. Le protocole décrit comment cultiver et différencier les organoïdes en deux dimensions, les infecter avec des Escherichia coli invasives par adhérents, et évaluer les données clés, notamment la rupture de la barrière épithéliale, l’imagerie d’infection et la réponse de l’ARN épithélial.

Une culture organoïde bidimensionnelle sur un extrait d’invasine ou de membrane basale pour étudier les interactions hôte-bactérie

Découvrez la culture d'organoides gastriques humains et murins dérivés de cellules souches adultes pour modéliser les maladies infectieuses. Cette technique permet d'étudier les interactions entre Helicobacter pylori et l'épithélium gastrique en trois dimensions.

Organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes destomac et microinjection de Helicobacter pylori (Vidéo) | JoVE Journal

Organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes d'estomac et microinjection de Helicobacter pylori

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