Mesurer l'attachement et l'internalisation du virus grippal A dans les cellules A549 par cytométrie en flux

L’objectif général de cette procédure est de mesurer l’attachement et l’internalisation de la grippe. Une particule virale dans un 5 49 cellules épithéliales pulmonaires. Ceci est accompli par la première liaison à froid d’un virus de la grippe à 5 49 cellules, ce qui permet la fixation mais empêche l’absorption de particules virales.

Ensuite, le virus est autorisé à s’internaliser en déplaçant la température à 37 degrés Celsius. Puis une étape de blocage dans laquelle le strp Aden non marqué est lié à la surface de la cellule. L’analyse des virus attachés est effectuée afin de faire la distinction entre les particules virales attachées et internalisées.

Enfin, le virus biotinylé associé aux cellules est incubé avec de la streptavidine marquée CY three et la cytométrie en flux est utilisée pour détecter les virus colorés. En fin de compte, la quantité relative de virus attachés et internalisés est calculée. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la quantité relative de la grippe, un virus qui se fixe et s’internalise dans 5, 0, 9 cellules.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes utilisant différentes lignées cellulaires ou d’autres virus Après avoir généré le virus biotinylé et déterminé les quantités requises du streptocoque din du virus marqué et du streptocoque din marqué SI trois selon le protocole de texte, préparez quatre tubes à puits profonds contenant chacun 200 000, A 5 49 cellules étiquetées les tubes comme zéro minute. Zéro minute, plus STV, 30 minutes et 30 minutes plus STV. Ensuite, faites tourner les tubes.

Retirez le surnageant et utilisez 200 microlitres de PBS pour remettre les granulés en suspension. Ensuite, après avoir fait tourner à nouveau les tubes, utilisez 200 microlitres d’un milieu de croissance standard 5 49 pour remettre les cellules en suspension, incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes après l’incubation, centrifugez les échantillons et remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de PBS Après avoir répété le lavage une fois de plus, refroidissez les tubes sur de la glace pendant 10 minutes. Lorsque les tubes ont refroidi, essorez à nouveau et utilisez 100 microlitres de virus biotinylé dilué dans du PBS d’infection pour remettre les granulés en suspension après une incubation sur de la glace pendant une heure, répétez l’essorage et lavez deux fois avec du PBS, en traitant les échantillons suivants en parallèle autant que possible pour les échantillons de zéro minute.

Après l’essorage, utilisez 100 microlitres d’aldéhyde paraforme à 3,7 % ou de PFA pour remettre en suspension la pastille cellulaire. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes avant d’essorer et d’utiliser du PBS pour laver les cellules deux fois après la fixation. Conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités.

Pour traiter les échantillons de VTU de zéro minute et plus, faites tourner les tubes, retirez le surnageant et utilisez 15 microlitres de VTU 2 % BSA et 0,1 % d’azi de sodium dans du PBS pour remettre en suspension la pastille cellulaire incubée sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez et utilisez le PBS pour laver les cellules deux fois après la fixation avec le PFA, comme nous venons de le démontrer, pour les échantillons à quatre degrés Celsius pour les échantillons de 30 minutes. Après avoir essoré et retiré le supernat, utilisez du PBS 2 % BSA pour dissoudre les échantillons.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de laver avec du PBS et de fixer avec du PFA. Ensuite, conservez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant les 30 minutes plus les échantillons STV. Après la granulation, nous suspendons les échantillons dans 200 microlitres de PBS 2 %BSA, après une incubation à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Faites tourner et remettre en suspension les cellules dans 50 microlitres de STV 2 % BSA 0.1 % Sodium azi in PBS incubez sur ICE pendant 30 minutes avant de laver et de fixer. Ensuite, après avoir perméable et coloré tous les échantillons avec STV SI trois, en suivant les détails dans le protocole texte, les échantillons ont été stockés à quatre degrés Celsius. Enfin, analysez les échantillons par cytométrie en flux.

Déterminez le pourcentage de cellules CY trois positives dans chaque échantillon. Calculez le pourcentage de virus attaché et la quantité relative de virus internalisés. Selon le protocole textuel montré ici dans l’échantillon de zéro minute, le virus est lié à froid aux cellules cibles, comme le visualisent St.V.SI trois colorations.

Lorsque le STV est appliqué en tant qu’étape bloquante, le virus à la surface de la cellule ne peut plus être détecté par la coloration S St.V.SI trois, ce qui réduit fortement le signal. Lorsque la température est élevée à 37 degrés Celsius, le virus attaché est absorbé dans les cellules. Le virus internalisé n’est pas sensible au blocage avec un STV non marqué, ce qui entraîne une baisse moins spectaculaire de l’intensité du signal dans les échantillons de STV de plus de 30 minutes présentés.

Voici les pourcentages de cellules SI trois positives pour toutes les conditions expérimentales décrites dans cette vidéo. Les cellules infectées fictives donnent de l’intensité au signal de fond pour l’expérience et agissent comme un contrôle négatif pour l’attachement au virus. Un autre contrôle, la neuraminidase, abroge fortement l’attachement à l’IAV de 90 % par rapport aux cellules non traitées.

L’azi de sodium, qui appauvrit un TP, inhibant ainsi l’endocytose, inhibe l’internalisation des particules virales pendant et après l’infection, comme le montre ici après le traitement de l’azi de sodium, les cellules incubées pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius ont montré une baisse spectaculaire de l’internalisation par rapport aux cellules non traitées incubées dans les mêmes conditions. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’attachement et l’internalisation de la grippe, un virus dans 5 0 9 cellules. Ce protocole permet une lecture pratique par cytométrie en flux et peut être facilement adapté à d’autres contextes expérimentaux.