Membrane Transport processus analysés par un système hautement parallèle Nanopore Chip à protéine unique Résolution

L'objectif général de cette plateforme basée sur une puce de nanostructure est d'analyser la fonction des protéines membranaires au niveau moléculaire unique de manière hautement parallèle. Grâce à sa capacité à résoudre des protéines individuelles, de nouvelles perspectives sont obtenues sur le transport membranaire et les flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des protéines membranaires, telles que la conductivité ou le comportement de transport des canaux ou transporteurs individuels, notamment ceux impliquant des cargaisons non électrogéniques.

Le principal avantage de cette technique réside dans son haut degré de parallélisme, issu de la conception de la puce à nanostructures, comportant des centaines de milliers de nanopores et permettant la détection fluorescente des événements de transport. Les implications de cette technique s'étendent à la conception des meilleurs tests pour des bibliothèques efficaces de protéines membranaires. En effet, la plateforme basée sur une puce permet un enregistrement du transport hautement parallèle et automatisé.

En général, les personnes novices dans cette méthode apprennent rapidement à manipuler la technique présentée. L'objectif a toujours été de concevoir un dosage convivial afin que toute personne intéressée puisse l'adopter. Ce dosage du transport membranaire utilise une tranche de silicium sur isolant, conçue à l'aide de gravure par ions réactifs.

Environ 1 000 puces de dosage sont fabriquées à partir de chaque gaufrette. Chaque puce contient 250 000 microcavités. Ces cavités sont scellées par des bicouches lipidiques contenant les protéines de transport d'intérêt.

La membrane constitue l'interface du capteur. Initialement, les matériaux fluorescents sont confinés à un côté de la bicouche lipidique, correspondant à l'intérieur des liposomes dont ils sont constitués. Chaque cavité est adressable par une lecture de fluorescence multispectrale.

Une couche supérieure opaque bloque les signaux fluorescents du réservoir de tampon, rendant la puce biologique compatible avec les microscopes à fluorescence inversés. À l’aide de la microscopie à force atomique, les ouvertures de pores régulièrement disposées ainsi que la rugosité de surface de la couche de dioxyde de silicium ont été mesurées à 3,6 nanomètres, une valeur optimale pour la fusion des vésicules. La microscopie électronique à balayage montre une coupe transversale d’un nanopore, donnant accès aux cavités de l’ordre du femtolitre à l’intérieur de la puce en silicium.

Ce vidéo montre la préparation des protéoliposomes, la préparation des puces pour le test, et l'exécution de base du test. Reliez un ballon rond lavé à l'éthanol à un évaporateur rotatif. Sèchez le film lipidique pendant 40 minutes à 300 millibars, à une température de bain d'eau de 30 degrés Celsius, et à vitesse de rotation maximale afin d'obtenir un film lipidique homogène sur la paroi en verre du ballon.

Ensuite, à l’aide d’une pompe à vide poussé, sécher le film lipidique pendant 30 minutes supplémentaires à température ambiante. Puis, ajouter cinq millilitres de tampon et huit billes de verre lavées à l’éthanol au flacon pour former les vésicules multilamellaires. Relier le flacon à l’évaporateur rotatif et faire tourner sans vide à 50 degrés Celsius à vitesse maximale.

Après 45 minutes, la solution apparaîtra laiteuse, sans film lipidique résiduel sur les parois. Transférez le flacon sous une atmosphère de gaz inerte dans un bain ultrasonique, et soniquez pendant quatre minutes à température ambiante. La sonication rompt les liposomes, les rendant unilamellaires.

À présent, diviser la solution de VUL en aliquots de un millilitre et effectuer cinq cycles de congélation-décongélation à l’aide d’azote liquide et d’un bain d’eau à 40 degrés Celsius. Ceci entraîne la rupture, le réarrangement et la croissance des liposomes. À l’étape finale de congélation, conserver tous les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Avant de reconstituer un aliquot de LUV, extruder les liposomes en faisant passer l'aliquot à travers une membrane filtrante en polycarbonate de 400 nanomètres 17 fois, à l'aide d'un mini-extrudeur. Ensuite, déstabiliser les LUV en ajoutant 4 % de Triton X-100 pour obtenir une concentration finale de 0,25 % dans la solution. Incuber une durée de cinq minutes à 50 degrés Celsius.

Maintenant, mélangez une partie de MscL purifié et modifié avec 20 parties de liposomes saturés en détergent, puis poursuivez l'incubation pendant 30 minutes. Après l'incubation, prélevez un aliquot de 100 microlitres et ajoutez un volume égal de calcine à 30 millimolaire. Incubez ce mélange pendant cinq minutes à 50 degrés Celsius.

À présent, éliminez le détergent des échantillons traités et non traités au calicine. Ajoutez des billes de bio-rétroaction mouillées dans un tampon Tris à chacun, puis incubez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius sur une plaque tournante. Avant l'expérience, testez une préparation à l’aide d’un dosage d’activité.

Pour commencer, mélangez la base d'élastomère avec l'agent de réticulation et desséchez complètement le mélange afin qu'il devienne aghast. L'adhésif doit être utilisé dans les 30 minutes suivant sa préparation. Pendant ce temps, en prenant les précautions nécessaires, nettoyez une lame de couverture en utilisant cinq millilitres de chloroforme appliqués à l’aide d’une seringue en verre, puis laissez sécher la lame.

À présent, à l’aide d’une pipette de 10 microlitres, déposez l’adhésif préparé sur la lamelle. Ensuite, retirez délicatement une puce du support en utilisant une pince fine. Avec le côté revêtu de la puce vers le haut, déposez-la sur l’adhésif, puis frottez doucement pour répartir uniformément l’adhésif sur la lame.

Veillez à ce qu'aucune bulle d'air ne reste piégée en dessous, ni qu'aucun adhésif ne remonte sur la puce. En outre, assemblez de manière à ce que l'ensemble s'insère dans le porte-lame à huit chambres. Désiccation des assemblages pendant deux heures à 65 degrés Celsius dans une étuve.

Ensuite, retirez la couche protectrice sur les puces à l’aide de quelques lavages au solvant à 54 degrés Celsius. Placez d’abord les puces montées dans un porte-lame. Incubez-les ensuite dans trois bains de solvant pendant 10 minutes chacun.

Isopropanol, acétone et isopropanol. Ensuite, laver soigneusement et complètement les puces avec de l'eau ultra-pure. Terminer le processus en séchant les puces sous un flux doux de gaz azote.

Maintenant, préparez une lame à huit puits adhésive et placez-la à l’envers sur la paillasse. Ensuite, soulevez délicatement les lamelles et appuyez-les sur la lame adhésive, les puces étant orientées vers les puits. Laissez l’assemblage reposer quelques minutes avant de poursuivre.

Avant de procéder au test de translocation, lavez soigneusement l'ensemble de la puce, comme décrit dans le protocole écrit, en terminant par un bain de tampon Tris. Ensuite, remplacez la solution du bain par du tampon Tris DOPEd contenant cinq millimolaire de chlorure de calcium et un micromolaire de colorant Oy647. Puis, ajoutez les protéoliposomes dans la chambre de la puce à une concentration finale d'un milligramme par millilitre, et attendez une heure.

Après une heure, rincez les puces quatre fois avec 400 microlitres de tampon Tris sans calcium. Ajoutez ensuite la solution colorante dans chaque puits à une concentration de cinq micromolaire, puis poursuivez avec le test. Ensuite, fixez le support de puce sur le microscope à épifluorescence et focalisez-vous sur le bord de la puce à nanopores afin de localiser les microcavités.

Une fois les microcavités en focalisation, balayer le réseau de nanopores pour repérer la région présentant le rapport de plafond le plus élevé. Des détails sont fournis dans le protocole écrit. Les liposomes ont été préparés et contrôlés pour leur distribution de taille et leur dispersion.

Les liposomes préparés étaient plus gros que le diamètre des pores requis pour le test, ce qui est essentiel. Des liposomes monodispersés sont également souhaitables. Avant l'expérience, la présence de la protéine MscL modifiée lors de la préparation des liposomes a été vérifiée à l'aide d'un dosage par déquenchement de fluorescence.

Le ratio de liposomes contenant des MscL modifiés actifs était suffisant pour procéder à l'expérience de translocation. Sur le biopuce, une translocation du soluté d'une cible fluorescente à travers le canal MscL modifié a été observée. Le modulateur chimique MTSET a été utilisé pour ouvrir les canaux MscL conçus par répulsion électrostatique.

La diminution subséquente de la fluorescence à l'intérieur de l'espace de la cavité a été surveillée. Ce processus s'est révélé hautement reproductible, avec des événements d'efflux très cohérents. Les courbes d'efflux obtenues se regroupaient en deux populations distinctes, correspondant à des événements de translocation par canal unique ou par plusieurs canaux.

Le système était capable de suivre jusqu'à trois colorants fluorescents distincts grâce à une analyse en temps réel. Cela permet une discrimination précise des résultats positifs, des événements d'efflux mono-exponentiels, des cinétiques complexes, des intrusions lipidiques et des ruptures membranaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en plusieurs étapes consécutives, à savoir la préparation de la puce, la préparation de l'échantillon, l'acquisition d'images et l'analyse, rendant ainsi l'ensemble du protocole modulaire.