Name: Membrane Transport processus analysés par un système hautement parallèle Nanopore Chip à protéine unique Résolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Découvrez une plateforme à base de puces nanostructurées pour analyser la fonction des protéines membranaires au niveau moléculaire unique avec haute parallélisation. Cette méthode permet d'étudier la conductivité et le comportement de transport des canaux individuels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Barbara Windschiegl pour son aide dans l’établissement des SOP ; Dennis Remme pour son travail sur le logiciel NanoCalcFX et Alina Kollmannsperger, Markus Braner et Milan Gerovac pour leurs suggestions utiles sur le manuscrit. La coopération germano-israélienne (DIP) fournie par la DFG et le ministère fédéral de l’Éducation et de la Recherche à R.T., ainsi que par le ministère fédéral de l’Économie et de la Technologie (ZIM R&D Project) à R.T. et Nanospot GmbH a soutenu ce travail.

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La technique présentée ici permet une analyse très parallèle de transport des protéines de la membrane. des systèmes protéiques de la membrane reconstituée peuvent être directement appliquées sur la biopuce, ce qui rend l&#39;adaptation de la théorie, chaque transporteur membranaire ou canaux possibles. l&#39;analyse de transport est seulement limité par la mise en place d&#39;un système de lecture fluorescente, soit par changement direct de fluorescence (translocation des fluorophores ou des substrats marqués par fluor...

L&#39;analyse des protéines membranaires est devenue d&#39;un intérêt croissant pour la recherche fondamentale et pharmaceutique au cours des 20 dernières années. Le développement de nouveaux médicaments dépend de l&#39;identification et de la caractérisation détaillée des nouvelles cibles, étant actuellement l&#39;un des facteurs limitants. Le fait que 60% ​​de toutes les cibles médicamenteuses sont des protéines membranaires 1, rend le développement de techniques pour élucider leur fonction la plus importante. Dans le passé, des techniques pour l&#39;étude des canaux électrogènes et les transporteurs ont été développés dans la multitude 2-4. substrats non électrogènes en contraire présentent une tâche plus difficile. Ils sont cependant d&#39; un intérêt particulier en tant que cibles de médicaments de choix, car ils contrôlent le flux de solutés et de nutriments à travers la membrane cellulaire et la fonction des récepteurs 5 clés en cascades de signalisation. Des efforts considérables ont été mis dans le développement de techniques pour étudier la fonction des protéines de transport membranaire 6, 7. Les systèmes utilisant des membranes sur support solide ont émergé comme des outils les plus prometteurs dans ce domaine 8-10, y compris solides bicouches lipidiques supportées, bicouches captifs 11, 12, membranes microblack lipidiques 13, 14 et natifs tableaux vésiculaires 15, 16 pour ne citer que quelques - uns. Certains d&#39;entre eux sont même disponibles en configurations commerciales 17, 18. Quelques exemples ont été publiés en combinant la capacité d&#39;étudier les protéines membranaires simples d&#39;une manière hautement parallèle 14, 19, une condition préalable pour les applications de dépistage. Cependant, ces méthodes combler rarement de la recherche fondamentale à l&#39;environnement industriel. Les difficultés se situent souvent dans la capacité du système à être automatisable, la production coûteuse et / ou d&#39;une préparation laborieuse. Une approche overcoming tous les obstacles mentionnés ci-dessus est le but final. La technique présentée ici a été développé pour étudier les canaux de membrane et des transporteurs in vitro dans un environnement contrôlé , le niveau de protéine unique 20-22. Reconstitution des protéines membranaires purifiées en LUV est beaucoup plus établi que les approches comparables pour GUVs 23 - 26 ou lipides noir membranes 27. Ils peuvent être directement appliqués sur la surface de la puce, où la formation de deux couches se déroule par l&#39;intermédiaire d&#39;un processus d&#39;auto-assemblage. La conception à fond de verre de la puce nanoporeux (Fig. 1) permet pour la microscopie de l&#39; air, ce qui permet l&#39;automatisation simple du système. En combinaison avec une platine motorisée plusieurs puces peuvent être mesurées en même temps, chaque champ de vision contenant des milliers de cavités scellées pour l&#39;analyse. La figure 1. Conception de biopuces nanopore multiplexés. A) de silicium sur isolant (SOI) wafer est structuré par gravure ionique réactive. Environ 1.150 puces individuelles sont fabriquées à partir de chaque plaquette avec des propriétés identiques et de qualité. B) Chaque puce comprend 250.000 microcavités individuels avec des ouvertures nano. Barre d&#39; échelle:. 200 um C) Chaque cavité est adressable par fluorescence multi-spectrale lecture. Un opaques blocs supérieurs de la couche les signaux fluorescents provenant du réservoir tampon, ce qui rend la biopuce compatible avec inversées microscopes à fluorescence. D) microscopie à force atomique (AFM) imagerie révèle disposés de manière uniforme des ouvertures de pores et la rugosité de la surface de la couche de dioxyde de silicium de 3,6 nm (n = 40) optimale pour la fusion des vésicules. Barre d&#39; échelle: 5 um E) micro électronique à balayage.roscopie d&#39;image (SEM) montre une coupe transversale à travers le nanopore permettant l&#39;accès aux cavités femtolitre à l&#39;intérieur de la puce de silicium. Ce chiffre a été réutilisé avec l&#39; autorisation de 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Toute analyse des données est effectuée en utilisant freeware pour garantir un accès sans restriction pour les utilisateurs finaux. Les séries temporelles sont analysées en utilisant un logiciel de traitement d&#39;images gratuit et d&#39;un traitement par lots logiciel d&#39;analyse de la courbe de génération personnalisée permettant et la corrélation directe de grands ensembles de données avec de multiples canaux fluorescents et des milliers de courbes. La protéine de modèle utilisé dans ce protocole est le canal mécanosensible de protéines grande conductance (MscL) de canal dérivé de E. coli. Il fonctionne comme une soupape pour libérer un choc osmotique dans la nature, mais a été modifiée d&#39;une manière telle que conçue rationnellement syntfonctionnalités HETIC peuvent covalente être fixés sur le côté des canaux d&#39;étranglement. Via charge la répulsion de l&#39;activateur lié de façon covalente (MTSET) le canal est déclenché pour ouvrir, créer une nano-valve. Les petites molécules comme les ions, l&#39;eau, de petites protéines, mais aussi les petites fluorophores peuvent passer à travers le canal. Ici, la protéine est utilisée comme modèle pour démontrer la capacité du système pour détecter la translocation de la protéine à médiation.

<table><tbody><tr><td><réactif fort></fort></td><td></td><td></td><td></td></tr>[<tr><td>2-(triméthylammonium)éthyl] méthanethiosulfonate</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET ; hydrolisé par l’eau. Conserver au sec à -80 °C. Utiliser immédiatement (30 minutes) après la solubilisation dans le tampon.</td></tr><tr><td>Seringue étanche au gaz de 1 ml</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Fiole ronde de 10 ml</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,7 mm billes de verre</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm Luer-Lock Extension Tube</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 L’adsorbant</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>doit être activé avant la première utilisation</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>stocker sombre à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Réactif de chloroforme de qualité</td><td>VWR Chemicals</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>stocker sombre à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Seringue à usage unique</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F Seringue à usage unique</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à keck</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha ;-Phosphatidylcholine, 20 % (soja)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>5416016</td><td>stocker sous gaz inerte à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>NaCl 99,5 % par an</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 wafer/chips</td><td>Micromotive (Mayence/Allemagne)</td><td></td><td>disponible sur demande</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 &micro ; m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>stocker sombre à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml ; nster/Allemagne)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>se conserve sombre à -20 &deg ; C</td></tr> Filtration à la <tr><td>seringue rotiabo, non stérile, taille des pores 0,22 & micro ; m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>Matériau de colonne pour chromatographie d’exclusion stérique</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Agent de durcissement pour la fixation des copeaux sur le support en verre</td></tr><tr><td>de couverture collant-Slide 8 puits</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>Chambre multipuits pour le montage sur des lames de verre (porte-copeaux)</td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à trois voies bleu</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9 % Ultra Qualité</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &micro ; m filtre à membrane en nitrate de cellulose</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml ; chi 461</td><td>bain-marie B&uuml ; chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml ; chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml ; Specttrophtomètre de fluorescence de l’éclipse de Chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary&nbsp ;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extruder</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe à membrane&nbsp ;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight Microscope de suivi des nanoparticules</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope NyONE</td><td>Synentec</td><td></td><td>disponible sur demande</td></tr><tr><td>Contrôle de la pompe</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Bain sonicateur Sonorex RK100H</td><td>Brandelin</td><td>31200001107477</td><td></td>électronique</tr><tr><td>Pompe à vide RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td> Logiciel <td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>scientifique de traitement d’images</td>) <td>open source</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>Logiciel gratuit d’analyse</td><td>/évaluation de données http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ pour les ensembles de données cinétiques de transport massif</td><td></td></tr> <tr><td>Logiciel analytique NTA 2.3 Logiciel d’acquisition</td> et d’analyse de données <td>Nanosight</td><td></td><td>pour le suivi des nanoparticules microscope</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Temperature Comms Logiciel de contrôle de</td> température <td>Nanosight</td><td></td><td>pour microscope de suivi des nanoparticules</td></tr></tbody></table>

membrane transport processus analysés par un système hautement parallèle nanopore chip à protéine unique résolution

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane transport des protéines au niveau de protéine unique échappe encore une analyse détaillée, si le substrat translocation est non-électrogénique. Des efforts considérables ont été faits dans ce domaine, mais les techniques permettant l&#39;analyse automatisée de transport à haut débit en combinaison avec des techniques de bicouches lipidiques sans solvant requis pour l&#39;analyse des transporteurs membranaires sont rares. Cette classe de transporteurs est toutefois crucial dans l&#39;homéostasie cellulaire et donc une cible clé dans le développement de médicaments et de méthodologies pour acquérir de nouvelles connaissances désespérément besoin. Le manuscrit présenté ici décrit la création et la manipulation d&#39;un roman biopuce pour l&#39;analyse des processus de transport de protéines membranaires médiation à la résolution du transporteur unique. La biopuce est composé de microcavités fermées par nanopores qui est hautement parallèle dans sa conception et peuvent être produits de qualité industrielle et de la quantité. liposomes Protein-hébergeant peuvent être directement appliquées àla surface de la puce formant des bicouches lipidiques pores transmembranaires auto-assemblées à l&#39;aide de SSM-techniques (solide supporté membranes lipidiques). Pores transmembranaires parties de la membrane sont autonomes, fournissant l&#39;interface substrat pour la translocation dans ou hors de l&#39;espace de la cavité, qui peut être suivie par la lecture de fluorescence multispectral en temps réel. La mise en place de procédures normalisées d&#39;exploitation (SOP) permet à la mise en place directe des bicouches lipidiques de protéines hébergeant sur la surface de la puce de pratiquement toutes les protéines de la membrane qui peut être reconstituée fonctionnellement. La seule condition préalable est la mise en place d&#39;un système de lecture fluorescent pour les substrats de transport non électrogènes. Les applications à haute teneur dépistage sont accomplishable par l&#39;utilisation de microscopes automatisés fluorescents inversés d&#39;enregistrement multiples puces en parallèle. Les grands ensembles de données peuvent être analysées en utilisant le logiciel d&#39;analyse conçu sur mesure librement disponibles. Trois couleurs multiples spectrale fluorescentelecture permet en outre de discrimination de données impartiale dans différentes classes d&#39;événements, ce qui élimine des résultats faussement positifs. La technologie de la puce est actuellement basée sur SiO 2 surfaces, mais fonctionnalisation supplémentaire en utilisant des surfaces de puces revêtues d&#39; or est également possible.

Les membranes de pores transmembranaires peuvent être facilement créées sur la surface de la puce de nanostructures d&#39;une manière auto-assemblée. Toutefois, le processus sous-jacent est toujours délicate et influencée par de nombreux paramètres tels que la taille des liposomes, monodispersité de la population de liposomes, lamellarité, lipides et sel concentration et de surface chimique propriétés. La plupart de ces paramètres ont été soigneusement caractérisés et normalisés dans le ...

Le protocole présenté décrit l’analyse du transport médié par les protéines membranaires au niveau du transporteur unique à l’aide de bicouches lipidiques sans solvant couvrant les pores. Ceci est réalisé par la création de puces de réseaux de nanopores produites en vrac, combinée à l’acquisition et à l’analyse de données hautement parallèles, permettant la mise en place future de criblages effecteurs de protéines membranaires.

Membrane Transport processus analysés par un système hautement parallèle Nanopore Chip à protéine unique Résolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

L'objectif général de cette plateforme basée sur une puce de nanostructure est d'analyser la fonction des protéines membranaires au niveau moléculaire unique de manière hautement parallèle. Grâce à sa capacité à résoudre des protéines individuelles, de nouvelles perspectives sont obtenues sur le transport membranaire et les flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des protéines membranaires, telles que la conductivité ou le comportement de transport des canaux ou transporteurs individuels, notamment ceux impliquant des cargaisons non électrogéniques.Le principal avantage de cette technique réside dans son haut degré de parallélisme, issu de la conception de la puce à nanostructures, comportant des centaines de milliers de nanopores et permettant la détection fluorescente des événements de transport. Les implications de cette technique s'étendent à la conception des meilleurs tests pour des bibliothèques efficaces de protéines membranaires. En effet, la plateforme basée sur une puce permet un enregistrement du transport hautement parallèle et automatisé.En général, les personnes novices dans cette méthode apprennent rapidement à manipuler la technique présentée. L'objectif a toujours été de concevoir un dosage convivial afin que toute personne intéressée puisse l'adopter. Ce dosage du transport membranaire utilise une tranche de silicium sur isolant, conçue à l'aide de gravure par ions réactifs.Environ 1 000 puces de dosage sont fabriquées à partir de chaque gaufrette. Chaque puce contient 250 000 microcavités. Ces cavités sont scellées par des bicouches lipidiques contenant les protéines de transport d'intérêt.La membrane constitue l'interface du capteur. Initialement, les matériaux fluorescents sont confinés à un côté de la bicouche lipidique, correspondant à l'intérieur des liposomes dont ils sont constitués. Chaque cavité est adressable par une lecture de fluorescence multispectrale.Une couche supérieure opaque bloque les signaux fluorescents du réservoir de tampon, rendant la puce biologique compatible avec les microscopes à fluorescence inversés. À l’aide de la microscopie à force atomique, les ouvertures de pores régulièrement disposées ainsi que la rugosité de surface de la couche de dioxyde de silicium ont été mesurées à 3,6 nanomètres, une valeur optimale pour la fusion des vésicules. La microscopie électronique à balayage montre une coupe transversale d’un nanopore, donnant accès aux cavités de l’ordre du femtolitre à l’intérieur de la puce en silicium.Ce vidéo montre la préparation des protéoliposomes, la préparation des puces pour le test, et l'exécution de base du test. Reliez un ballon rond lavé à l'éthanol à un évaporateur rotatif. Sèchez le film lipidique pendant 40 minutes à 300 millibars, à une température de bain d'eau de 30 degrés Celsius, et à vitesse de rotation maximale afin d'obtenir un film lipidique homogène sur la paroi en verre du ballon.Ensuite, à l’aide d’une pompe à vide poussé, sécher le film lipidique pendant 30 minutes supplémentaires à température ambiante. Puis, ajouter cinq millilitres de tampon et huit billes de verre lavées à l’éthanol au flacon pour former les vésicules multilamellaires. Relier le flacon à l’évaporateur rotatif et faire tourner sans vide à 50 degrés Celsius à vitesse maximale.Après 45 minutes, la solution apparaîtra laiteuse, sans film lipidique résiduel sur les parois. Transférez le flacon sous une atmosphère de gaz inerte dans un bain ultrasonique, et soniquez pendant quatre minutes à température ambiante. La sonication rompt les liposomes, les rendant unilamellaires.À présent, diviser la solution de VUL en aliquots de un millilitre et effectuer cinq cycles de congélation-décongélation à l’aide d’azote liquide et d’un bain d’eau à 40 degrés Celsius. Ceci entraîne la rupture, le réarrangement et la croissance des liposomes. À l’étape finale de congélation, conserver tous les échantillons à moins 80 degrés Celsius.Avant de reconstituer un aliquot de LUV, extruder les liposomes en faisant passer l'aliquot à travers une membrane filtrante en polycarbonate de 400 nanomètres 17 fois, à l'aide d'un mini-extrudeur. Ensuite, déstabiliser les LUV en ajoutant 4 % de Triton X-100 pour obtenir une concentration finale de 0,25 % dans la solution. Incuber une durée de cinq minutes à 50 degrés Celsius.Maintenant, mélangez une partie de MscL purifié et modifié avec 20 parties de liposomes saturés en détergent, puis poursuivez l'incubation pendant 30 minutes. Après l'incubation, prélevez un aliquot de 100 microlitres et ajoutez un volume égal de calcine à 30 millimolaire. Incubez ce mélange pendant cinq minutes à 50 degrés Celsius.À présent, éliminez le détergent des échantillons traités et non traités au calicine. Ajoutez des billes de bio-rétroaction mouillées dans un tampon Tris à chacun, puis incubez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius sur une plaque tournante. Avant l'expérience, testez une préparation à l’aide d’un dosage d’activité.Pour commencer, mélangez la base d'élastomère avec l'agent de réticulation et desséchez complètement le mélange afin qu'il devienne aghast. L'adhésif doit être utilisé dans les 30 minutes suivant sa préparation. Pendant ce temps, en prenant les précautions nécessaires, nettoyez une lame de couverture en utilisant cinq millilitres de chloroforme appliqués à l’aide d’une seringue en verre, puis laissez sécher la lame.À présent, à l’aide d’une pipette de 10 microlitres, déposez l’adhésif préparé sur la lamelle. Ensuite, retirez délicatement une puce du support en utilisant une pince fine. Avec le côté revêtu de la puce vers le haut, déposez-la sur l’adhésif, puis frottez doucement pour répartir uniformément l’adhésif sur la lame.Veillez à ce qu'aucune bulle d'air ne reste piégée en dessous, ni qu'aucun adhésif ne remonte sur la puce. En outre, assemblez de manière à ce que l'ensemble s'insère dans le porte-lame à huit chambres. Désiccation des assemblages pendant deux heures à 65 degrés Celsius dans une étuve. Ensuite, retirez la couche protectrice sur les puces à l’aide de quelques lavages au solvant à 54 degrés Celsius. Placez d’abord les puces montées dans un porte-lame. Incubez-les ensuite dans trois bains de solvant pendant 10 minutes chacun.Isopropanol, acétone et isopropanol. Ensuite, laver soigneusement et complètement les puces avec de l'eau ultra-pure. Terminer le processus en séchant les puces sous un flux doux de gaz azote.Maintenant, préparez une lame à huit puits adhésive et placez-la à l’envers sur la paillasse. Ensuite, soulevez délicatement les lamelles et appuyez-les sur la lame adhésive, les puces étant orientées vers les puits. Laissez l’assemblage reposer quelques minutes avant de poursuivre.Avant de procéder au test de translocation, lavez soigneusement l'ensemble de la puce, comme décrit dans le protocole écrit, en terminant par un bain de tampon Tris. Ensuite, remplacez la solution du bain par du tampon Tris DOPEd contenant cinq millimolaire de chlorure de calcium et un micromolaire de colorant Oy647. Puis, ajoutez les protéoliposomes dans la chambre de la puce à une concentration finale d'un milligramme par millilitre, et attendez une heure.Après une heure, rincez les puces quatre fois avec 400 microlitres de tampon Tris sans calcium. Ajoutez ensuite la solution colorante dans chaque puits à une concentration de cinq micromolaire, puis poursuivez avec le test. Ensuite, fixez le support de puce sur le microscope à épifluorescence et focalisez-vous sur le bord de la puce à nanopores afin de localiser les microcavités.Une fois les microcavités en focalisation, balayer le réseau de nanopores pour repérer la région présentant le rapport de plafond le plus élevé. Des détails sont fournis dans le protocole écrit. Les liposomes ont été préparés et contrôlés pour leur distribution de taille et leur dispersion.Les liposomes préparés étaient plus gros que le diamètre des pores requis pour le test, ce qui est essentiel. Des liposomes monodispersés sont également souhaitables. Avant l'expérience, la présence de la protéine MscL modifiée lors de la préparation des liposomes a été vérifiée à l'aide d'un dosage par déquenchement de fluorescence.Le ratio de liposomes contenant des MscL modifiés actifs était suffisant pour procéder à l'expérience de translocation. Sur le biopuce, une translocation du soluté d'une cible fluorescente à travers le canal MscL modifié a été observée. Le modulateur chimique MTSET a été utilisé pour ouvrir les canaux MscL conçus par répulsion électrostatique.La diminution subséquente de la fluorescence à l'intérieur de l'espace de la cavité a été surveillée. Ce processus s'est révélé hautement reproductible, avec des événements d'efflux très cohérents. Les courbes d'efflux obtenues se regroupaient en deux populations distinctes, correspondant à des événements de translocation par canal unique ou par plusieurs canaux.Le système était capable de suivre jusqu'à trois colorants fluorescents distincts grâce à une analyse en temps réel. Cela permet une discrimination précise des résultats positifs, des événements d'efflux mono-exponentiels, des cinétiques complexes, des intrusions lipidiques et des ruptures membranaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en plusieurs étapes consécutives, à savoir la préparation de la puce, la préparation de l'échantillon, l'acquisition d'images et l'analyse, rendant ainsi l'ensemble du protocole modulaire.

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microscopie à molécule unique Approche fourni de nouvelles connaissances sur le transport nucléaire.

Molécules simples à l&#39;imagerie du transport nucléaire

Une méthode d'utilisation de l'état solide nanopores pour surveiller l'adsorption non-spécifique de protéines sur une surface inorganique est décrite. La méthode utilise le principe résistif impulsion, permettant à l'adsorption à sonder en temps réel et à la molécule seul niveau. Parce que le processus d'adsorption est seule protéine loin de l'équilibre, nous proposons l'emploi de réseaux parallèles de nanopores de synthèse, permettant pour la détermination quantitative du taux de réaction de...

Surveillance des protéines par adsorption à semi-conducteurs Nanopores

Une méthodologie pour la préparation des nanopores à l'état solide en solution pour des expériences de translocation biomoléculaires est présenté. Par l'application d'impulsions courtes de champs électriques élevés, le diamètre de nanopore peut être agrandi de manière contrôlée avec une précision inférieure au nanomètre, et ses caractéristiques de bruit électrique nettement améliorée. Cette procédure est effectuée in situ en utilisant un équipement de laboratoire standard dans des conditions...

Réglage fin de la taille et minimisant le bruit de l&#39;état solide nanopores

Ici, nous présentons un protocole pour détecter les grappes d'oxygène métalliques discrets, les polyoxométalates (POM), à la limite de molécule unique utilisant une plate-forme électronique nanopore biologique. La méthode fournit une approche complémentaire aux outils traditionnels de chimie analytique utilisés dans l'étude de ces molécules.

Caractérisation physique à haute résolution des nanoparticules métalliques uniques

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier le mécanisme moléculaire de la translocation des protons à travers les membranes lipidiques des liposomes unique, à l’aide du cytochrome bo3  à titre d’exemple. Combinant l’électrochimie et la microscopie de fluorescence, les variations de pH dans la lumière des vésicules unique, contenant un seul ou plusieurs enzymes, peuvent être détectés et analysés individuellement.

Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Le séquençage nanopore est une nouvelle technologie qui permet un séquençage rentable dans les emplacements distants et les paramètres pauvres en ressources. Ici, nous présentons un protocole pour le séquençage des mRNA de sang entier qui est compatible avec de telles conditions.

Séquençage de l’ARNm de sang total à l’aide du séquençage NANOPORE

Présenté ici est un protocole pour la détermination de l’état oligomérique des protéines membranaires qui utilise un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en conjonction avec la microscopie électronique.

Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

Ce protocole présente une méthode de mesure de la liaison des nucléotides adénine aux récepteurs en temps réel dans un environnement cellulaire. La liaison est mesurée par le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) entre les dérivés nucléotidiques du trinitrophényle et la protéine marquée avec un acide aminé fluorescent non canonique.

Mesure de la liaison des nucléotides aux protéines membranaires fonctionnelles intactes en temps réel

Ce protocole décrit une approche de traitement d’image et de suivi d’une seule particule basée sur iSCAT qui permet d’étudier simultanément la masse moléculaire et le comportement diffusif des macromolécules interagissant avec les membranes lipidiques. Des instructions étape par étape pour la préparation des échantillons, la conversion masse-contraste, l’acquisition de films et le post-traitement sont fournies ainsi que des instructions pour éviter les pièges potentiels.

Suivi des particules sensibles à la masse pour caractériser la dynamique des macromolécules associées à la membrane

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie TIRF pour suivre les canaux ioniques individuels et déterminer leur activité dans les membranes lipidiques soutenues, définissant ainsi l’interaction entre le mouvement de la membrane latérale et la fonction des canaux. Il décrit comment préparer les membranes, enregistrer les données et analyser les résultats.

Imagerie à molécule unique de la mobilité latérale et de l’activité des canaux ioniques dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Découvrez une plateforme à base de puces nanostructurées pour analyser la fonction des protéines membranaires au niveau moléculaire unique avec haute parallélisation. Cette méthode permet d'étudier la conductivité et le comportement de transport des canaux individuels.

Membrane Transport processus analysés par un système hautement parallèle Nanopore Chip à protéine unique Résolution

Explorer plus de vidéos