Membrane Transport processus analysés par un système hautement parallèle Nanopore Chip à protéine unique Résolution

L’objectif global de cette plateforme basée sur une puce de nanostructure est d’analyser la fonction des protéines membranaires au niveau moléculaire unique de manière très parallèle. Grâce à sa capacité à résoudre des protéines uniques, de nouvelles connaissances sur le transport et le flux membranaires sont obtenues. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des protéines membranaires, telles que la conductivité ou le comportement de transport de canaux uniques ou de transporteurs, en particulier avec des cargaisons non électrogènes.

Le principal avantage de cette technique est son parallélisme élevé dérivé de la conception de puces nanostructurées, avec des centaines de milliers de nanopores et la lecture fluorescente des événements de transport. Les implications de cette technique s’étendent à ce qui crée les meilleurs dosages de banques efficaces pour les protéines membranaires. En effet, la plate-forme basée sur une puce permet un enregistrement de transport hautement parallèle et automatique.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode apprendront rapidement à manier la technique présentée. L’objectif a toujours été de créer un test convivial afin que toutes les personnes intéressées puissent l’adopter. Ce test de transport membranaire utilise un silicium sur une plaquette isolée, conçu à l’aide de la gravure ionique réactionnelle.

Environ 1 000 puces de test sont fabriquées à partir de chaque plaquette. Chaque puce contient 250 000 microcavités. Ces cavités sont scellées par des bicouches lipidiques contenant les protéines de transport d’intérêt.

La membrane constitue l’interface du capteur. Initialement, les matériaux fluorescents sont contenus sur un côté de la bicouche lipidique, correspondant à l’intérieur des liposomes à partir desquels ils sont composés. Chaque cavité est adressable via une lecture de fluorescence multispectrale.

Une couche supérieure opaque bloque les signaux fluorescents du réservoir tampon, ce qui rend la biopuce compatible avec les microscopes à fluorescence inversée. À l’aide de la microscopie à force atomique, les ouvertures de pores uniformément disposées et la rugosité de surface de la couche de dioxyde de silicium ont été mesurées à 3,6 nanomètres, ce qui est optimal pour la fusion des vésicules. La microscopie électronique à balayage montre une section efficace à travers un nanopore, qui accède aux cavités femtolitres à l’intérieur de la puce de silicium.

Cette vidéo montre la préparation des protéoliposomes, la préparation des puces pour le test et l’exécution du test de base. Connectez un flacon à fond rond lavé à l’éthanol à un évaporateur rotatif. Séchez le film lipidique pendant 40 minutes à 300 millibars, à une température de bain-marie de 30 degrés Celsius et à une vitesse de rotation maximale pour former un film lipidique homogène sur la paroi de verre du flacon.

Ensuite, à l’aide d’une pompe à vide poussé, séchez le film lipidique pendant 30 minutes supplémentaires à température ambiante. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de tampon et huit billes de verre lavées à l’éthanol dans le ballon pour fabriquer les vésicules multilamellaires. Connectez le ballon à l’évaporateur rotatif et tournez-le sans vide à 50 degrés Celsius à la vitesse maximale.

Après 45 minutes, la solution apparaîtra laiteuse, sans film lipidique résiduel sur les parois. Transférez le ballon sous un gaz inerte dans un bain à ultrasons et faites-le soniser pendant quatre minutes à température ambiante. La sonication perturbe les liposomes, les rendant unilamellaires.

Maintenant, divisez la solution LUV en aliquotes d’un millilitre et effectuez cinq cycles de congélation-décongélation en utilisant de l’azote liquide et un bain-marie à 40 degrés Celsius. Cela conduit à la rupture, au réarrangement et à la croissance des liposomes. À la dernière étape de congélation, conservez tous les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Avant de reconstituer une aliquote LUV, extrudez les liposomes en faisant passer l’aliquote à travers une membrane filtrante en polycarbonate de 400 nanomètres 17 fois, à l’aide d’une mini-extrudeuse. Ensuite, déstabilisez les LUV en ajoutant 4 %Triton X-100 pour 0,25 % en solution. Incuber le mélange pendant cinq minutes à 50 degrés Celsius.

Maintenant, mélangez une partie de MscL purifié et modifié dans 20 parties de liposomes saturés de détergent et poursuivez l’incubation pendant 30 minutes. Après l’incubation, prélevez une aliquote de 100 microlitres et ajoutez un volume de calcine de 30 millimolaires. Incuber ce mélange pendant cinq minutes à 50 degrés Celsius.

Maintenant, retirez le détergent de l’échantillon traité à la calcine et non traité. Ajoutez des biobilles humides dans un tampon Tris à chacune et incubez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur une plaque rotative. Avant l’expérience, testez une préparation à l’aide d’un dosage d’activité.

Pour commencer, mélangez la base d’élastomère dans l’agent de durcissement et desséchez complètement le mélange pour qu’il soit épouvanté. L’adhésif doit être utilisé dans les 30 minutes lorsqu’il est prêt. Pendant ce temps, en prenant des précautions, nettoyez une lame de verre de couverture à l’aide de cinq millilitres de chloroforme, appliqués à l’aide d’une seringue en verre, et laissez sécher la lame.

Maintenant, à l’aide d’une pipette de 10 microlitres, déposez l’adhésif préparé sur le verre de couverture. Ensuite, retirez délicatement un éclat de la planche à gaufrettes à l’aide d’une pince à épiler fine. Avec le côté enduit de la puce vers le haut, déposez-le sur l’adhésif et frottez-le doucement dans la lame pour répartir uniformément l’adhésif.

Ne laissez pas les bulles d’air se coincer en dessous, ni aucun adhésif ne pénétrer au-dessus de la puce. De plus, faites l’assemblage de manière à ce qu’il s’insère dans le support de glissière à huit chambres. Maintenant, desséchez les assemblages pendant deux heures à 65 degrés Celsius dans un séchoir à armoire.

Plus tard, retirez la couche protectrice sur les copeaux avec quelques lavages au solvant à 54 degrés Celsius. Placez d’abord les puces montées dans un support de glissière. Ensuite, incubez-les dans trois bains de solvant pendant 10 minutes chacun.

Isopropanol, acétone et isopropanol. Ensuite, lavez soigneusement et soigneusement les chips avec de l’eau ultra pure. Terminez le processus en séchant les copeaux sous un léger jet d’azote gazeux.

Maintenant, préparez une diapositive collante à huit puits et placez-la à l’envers sur le banc. Ensuite, soulevez et appuyez délicatement sur les glissières du couvercle sur la glissière collante avec les copeaux face aux puits. Laissez reposer l’ensemble quelques minutes avant de continuer.

Avant de procéder au test de translocation, lavez soigneusement l’ensemble de puces, comme décrit dans le protocole texte, en terminant par un bain de tampon Tris. Ensuite, remplacez la solution du bain par un tampon DOPEd Tris, contenant cinq millimolaires de chlorure de calcium et un colorant micromolaire Oy647. Ensuite, ajoutez des protéoliposomes dans la chambre de la puce pour une concentration finale d’un milligramme par millilitre, et attendez une heure.

Au bout d’une heure, rincez les chips quatre fois avec 400 microlitres de tampon Tris sans calcium. Maintenant, ajoutez le colorant contrôlé dans chaque puits à cinq micromolaires et procédez au test. Ensuite, montez le support de puce sur le microscope à épifluorescence et concentrez-vous sur le bord de la puce nanopore pour trouver les microcavités.

Une fois que les microcavités sont nettes, balayez le réseau de nanopores à la recherche d’une région qui affiche le rapport de plafond le plus élevé. Les détails sont fournis dans le protocole texte. Des liposomes ont été préparés et vérifiés pour leur distribution de taille et leur dispersion.

Les liposomes préparés étaient plus grands que le diamètre des pores pour le dosage, ce qui est essentiel. Les liposomes monodispersés sont également souhaitables. Avant l’expérience, la protéine MscL modifiée dans la préparation du liposome a été vérifiée à l’aide d’un test de détrempe par fluorescence.

Le rapport de liposomes hébergeant des MscL modifiés actifs était adéquat pour procéder à l’expérience de translocation. Sur la biopuce, la translocation du soluté d’une cible fluorescente via le canal MscL modifié a été observée. Le modulateur chimique, MTSET, a été utilisé pour ouvrir les canaux MscL modifiés par répulsion électrostatique.

La diminution ultérieure de la fluorescence à l’intérieur de l’espace de la cavité a été surveillée. Ce processus s’est avéré très reproductible, avec des événements d’efflux très réguliers. Les courbes d’efflux résultantes se sont regroupées en deux populations distinctes, correspondant à des événements de translocation à un seul canal ou à plusieurs canaux.

Le système a été capable de suivre jusqu’à trois colorants fluorescents uniques avec une analyse en temps réel. Cela facilite la discrimination précise des résultats positifs, des événements d’efflux mono-exponentiels, des cinétiques complexes, des intrusions lipidiques et des ruptures membranaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en étapes consécutives, à savoir la préparation des puces, la préparation des échantillons, l’imagerie et l’analyse, rendant l’ensemble du protocole modulaire.