Protocole d'isolation efficace pour B et les lymphocytes T à partir des amygdales palatines humaines

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des fractions de lymphocytes BNT à partir d’échantillons d’amygdales humaines. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la virologie, comme quels sont les rôles des fractions de lymphocytes BT dans la pathogenèse des maladies virales dans les trois heures suivant leur ablation chirurgicale. Transportez le tissu amygdalien au laboratoire dans un tube à centrifuger de 50 millilitres rempli de suppléments contenant des HBSS stériles et glacés.

Ensuite, en utilisant les procédures de biosécurité appropriées recommandées pour la manipulation des tissus humains. Humidifiez le tissu avec un supplément frais contenant du HBSS et transférez les amygdales dans une plaque de culture cellulaire en plastique de 60 millimètres sur de la glace. À l’aide d’une pince, retirez tous les caillots sanguins visibles ou les tissus adipeux et conjonctifs, puis transférez les amygdales dans une nouvelle plaque de 60 millimètres contenant cinq millilitres de HBSS avec des suppléments.

Ensuite, coupez. Le tissu amygdale s’agglutine en fragments de trois à 10 millimètres, suivi du transfert des fragments dans une passoire cellulaire en plastique de 100 micromètres dans une nouvelle plaque de culture cellulaire de 60 millimètres contenant 10 millilitres de HBSS frais avec des suppléments à l’aide de l’extrémité du piston d’une seringue en plastique. Pressez les fragments de tissu à travers la crépine cellulaire, en vous assurant que les fragments d’amygdales restent totalement immergés dans le HBSS lorsque tous les tissus ont macéré, jetez la passoire et transférez la suspension cellulaire résultante dans un tube à centrifuger en plastique de 50 millilitres sur de la glace.

Amenez la solution cellulaire à un volume final de 35 millilitres avec des suppléments contenant du HBSS frais, puis ajoutez 10 millilitres de solution à gradient de densité à température ambiante dans quelques tubes coniques de 50 millilitres. Superposez doucement les suspensions de cellules sur les gradients de densité, en prenant soin de ne pas mélanger les solutions, puis séparez les cellules par centrifugation. Les cellules mononucléées se sépareront en une couche blanche duveteuse à l’interface avec les globules rouges, les fibroblastes et les débris cellulaires situés dans les sédiments au fond du tube.

À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, prélevez soigneusement la couche de cellules mononucléées et tirez les cellules mononucléées dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ensuite, lavez les cellules trois fois dans 25 millilitres de PBS glacé à chaque lavage et remettez en suspension la pastille finale dans 15 millilitres de PBS. Après avoir compté le nombre de cellules viables, placez les cellules sur de la glace pour isoler les cellules T du tonsor par séparation magnétique des billes.

Faites tourner la suspension de la cellule mononucléaire et remettez la pastille en suspension dans 80 microlitres de tampon de séparation glacé par une fois 10 aux sept cellules. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de deux millilitres et incubez dans 20 microlitres d’anticorps magnétiques CD trois pendant une heure à quatre degrés Celsius avec un mélange doux continu pour maintenir les cellules et la suspension à la fin de l’incubation, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de tampon de séparation glacé et lavez-les pendant le lavage. Fixez le séparateur magnétique au support et chargez une colonne sur l’aimant.

Lavez la colonne avec 500 microlitres de tampon de séparation glacé, puis placez une crépine de 40 micromètres sur le dessus de la colonne. Maintenant, mettez en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de séparation frais et chargez les cellules à travers la crépine sur la colonne collectant la cellule B contenant l’EIT dans un cône de 15 millilitres. Deux bon-glaces lorsque toutes les cellules sont passées dans le tube de collecte.

Lavez la colonne quatre fois avec 500 microlitres de tampon de séparation par une fois 10 dans les sept cellules en attendant que le réservoir de la colonne soit vide avant d’appliquer le lavage suivant. Après le dernier lavage, transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 15 millilitres. Ensuite, à l’aide du piston de la colonne, appuyez sur deux millilitres de tampon de séparation à travers la colonne dans le tube pour recueillir la fraction positive des lymphocytes T CD.

Pour analyser les fractions cellulaires isolées de B et de T Tonsor, granulez les fractions cellulaires CD trois positives et CD trois négatives et lavez les deux ensembles de cellules dans un millilitre de PBS complété par 0,2 % de BSA ou de PBSA après le deuxième essorage. Répartissez 100 microlitres d’aliquotes des cellules et du PBSA dans le nombre approprié de tubes pour l’étiquetage par télécopieur, et ajoutez la quantité appropriée d’anticorps monoclonaux ou de contrôle conjugués au fluoro quatre dans chaque tube. Ensuite, faites tourner brièvement les tubes et incubez-les pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité à la fin de l’incubation.

Lavez les tubes deux fois avec du PBSA frais, puis fixez la coloration cellulaire avec de l’aldéhyde paraforme à 1 % pour détecter la présence d’ADN adénoviral dans les cellules par PCR. Effectuez l’amplification PCR dans les conditions de cycle appropriées, en séparant les produits d’amplification PCR résultants sur un gel AGROS à 1,5 % et un tampon EDTA inter-domaines. Enfin, visualisez les bandes résultantes avec la coloration d’acide nucléique appropriée.

Selon les protocoles standard, une séparation réussie des cellules mononucléées du tonsor entraîne des sous-populations hautement purifiées de lymphocytes BNT, comme le confirme l’analyse cytométrique en flux utilisant des anticorps anti CD 20 et anti CD deux pour détecter les populations de lymphocytes b et t respectivement. En revanche, une séparation inefficace des cellules mononucléées entraîne des fractions cellulaires qui sont un mélange de cellules des lymphocytes b et t. Des sous-populations, de l’ADN et de l’ARN peuvent être extraits des lymphocytes b et t séparés par des billes magnétiques pour une analyse en aval, comme nous venons de le démontrer.

Par exemple, ici, la détection spécifique de l’ADN de l’adénovirus dans les lymphocytes T TONSOR détectée par PCR est de qualité cytoplasmique. L’ARN peut également être extrait des lymphocytes NT toniques B isolés. Des échantillons d’amygdales peuvent être traités en six heures si la technique est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de traiter les échantillons d’amygdales le plus rapidement possible. Le nombre d’étapes de lavage et le volume du tampon de lavage sont également des paramètres critiques pour un bon résultat. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que QPCR et R-T-Q-P-C-R pourraient être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la présence quantitative d’ADN viral et d’ARNm après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie pour explorer la pathogenèse et la latence de différentes espèces virales dans les tissus lymphoïdes humains. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les fractions de lymphocytes BT à partir d’échantillons d’amygdales humaines. N’oubliez pas que travailler avec des matériaux non filtrés d’origine humaine comme le sang et les tissus peut être extrêmement dangereux.

Par conséquent, des pratiques de sécurité appropriées doivent être suivies.