Synthèse de nanofibres à base de kératine de génie biomédical

nanofibres de électrofilées ont une grande surface au rapport de poids, une excellente intégrité mécanique, et de soutenir la croissance et la prolifération cellulaire. Ces nanofibres ont un large éventail d'applications biomédicales. Ici, nous fabriquons kératiniques / nanofibres PCL, en utilisant la technique d'électrofilage, et de caractériser les fibres pour des applications possibles dans l'ingénierie tissulaire.

L’objectif global de cette expérience est de synthétiser et de caractériser des nanofibres à base de kératine pour des applications biomédicales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie biomédicale, telles que la cicatrisation des plaies, l’administration de médicaments et les tissus modifiés, tels que le foie, les os et les muscles. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est bon marché, efficace et qu’elle peut être mise à niveau vers une production à grande échelle.

L’implication de cette technique s’étend au traitement des plaies et à l’administration de médicaments pour la régénération tissulaire. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’avantage d’utiliser des nanofibres électrofilées, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la régénération des tissus. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est difficile de fabriquer une substance polymère capable de générer des nanofibres.

Procurez-vous environ 20 grammes de rognures de cheveux humains qui n’ont pas été traités ou modifiés chimiquement. Les cheveux peuvent être de n’importe quelle longueur. Lavez soigneusement les cheveux à la main avec de l’eau tiède et du savon.

Utilisez de l’eau déminéralisée pour le rinçage final. Mettez les cheveux dans deux béchers de 600 millilitres et placez-les dans un four à 80 degrés Celsius pendant une heure. Une fois secs, répartissez uniformément les cheveux secs entre les béchers de 600 millilitres, en plaçant 10 grammes de cheveux dans chaque bécher.

Ne laissez pas les cheveux remplir plus de 500 millilitres. Ensuite, versez 500 millilitres de solution d’acide peracétique, ou PAS, dans chaque bécher, en vous assurant de couvrir tous les cheveux. Couvrez les gobelets avec du Parafilm et conservez-les pendant 12 heures.

Séparez les cheveux du PAS à l’aide d’un tamis de 500 microns, en recueillant les déchets de PAS dans un récipient séparé. Rincez abondamment les cheveux à l’eau déminéralisée pour éliminer les restes de PAS. Après avoir placé les cheveux rincés dans une fiole de 500 millilitres, versez 400 millilitres de solution Tris Base 100 millimolaires, ou TBS, dans la fiole, en vous assurant que les cheveux sont couverts.

Ensuite, placez le flacon dans un bain agitant réglé à 38 degrés Celsius, 65 tr/min, pendant une heure. Au bout d’une heure, retirez la fiole du bain agitant. Versez le liquide, qui est d’environ 400 millilitres de solution d’extraction de kératine, ou KES, dans un bécher de 1000 millilitres.

Versez 400 millilitres d’eau déminéralisée dans le ballon contenant les cheveux, en vous assurant que les cheveux sont couverts avant de remettre le ballon dans le bain d’agitation pendant une heure. Retirez la fiole du bain d’agitation et versez les 400 millilitres restants de KES dans le bécher de 1000 millilitres avec le KES préalablement collecté. Les cheveux ne sont plus nécessaires et peuvent être jetés dans la poubelle la plus proche.

Après avoir neutralisé le KES collecté comme décrit dans le protocole de texte, versez la solution dans le ballon à fond rond de 500 millilitres jusqu’à environ un quart plein. Faites fonctionner le distillateur selon le protocole du fabricant pendant 1,25 heure, en vous assurant que le flacon est bien connecté. Répétez ce processus jusqu’à ce que tout le KES ait été distillé.

Versez la solution distillée de KES également dans 12 tubes coniques séparés de 14 millilitres. Centrifugez les tubes à 1 050 fois G pendant 10 minutes. Versez le KES centrifugé dans un bécher propre, en veillant à le verser à l’abri des débris collectés.

Répétez l’opération jusqu’à ce que tout le KES ait été centrifugé. Ensuite, coupez la membrane de cellulose du tube de dialyse à 24 pouces et coupez une extrémité du tube pour le maintenir fermé. Ouvrez l’extrémité non clipsée de la membrane de cellulose de la tubulure de dialyse et versez lentement 60 millilitres de solution KES centrifugée dans la tubulure.

Utilisez une autre pince pour fermer cette extrémité du tube. Mettez le tube de dialyse dans un cylindre de 2 000 millilitres d’eau déminéralisée et laissez-le reposer pendant 24 heures, en changeant l’eau désionisée dans le cylindre toutes les trois à quatre heures. Ensuite, videz la solution dialysée de KES dans des bocaux bouchés, en veillant à laisser de l’espace en haut.

Placez les bocaux bouchés dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 24 heures. Après la période de congélation de 24 heures, retirez les bouchons des bocaux et placez-les dans des ampoules de lyophilisation. Placez les joints sur les ampoules et tournez le bouton pour créer une pression de vide de 0,133 millibar.

Lyophilisez les échantillons pendant environ 48 heures jusqu’à ce que toute l’humidité ait disparu. Préparez une solution de kératine PCL en ajoutant une solution de kératine de poids 10 dans une solution de PCL de poids 10 par goutte afin de créer des solutions de 10 millilitres avec des rapports PCL/kératine de 90 à 10, 80 à 20, 70 à 30 et 60 à 40. Placez environ huit millilitres de la solution PCL/kératine vortex dans une seringue jetable de 10 millilitres, équipée d’un tube en plastique de 0,5 millimètre de diamètre.

Placez la seringue dans un pousse-seringue dont le débit est réglé sur 2,5 millilitres par heure. Appliquez une tension à la pointe de l’aiguille connectée au tube. Appliquez une tension de 19 à 22 kilovolts sur le tube et faites tourner le tambour collecteur à environ 200 tr/min.

Coupez les fibres en échantillons de 16 millimètres carrés. Utilisez une colle à base de silicone biocompatible pour fixer chaque échantillon afin de couvrir les lamelles d’un diamètre de 12 millimètres. Collez une extrémité de l’échantillon de fibre à l’arrière de la lamelle et enroulez l’échantillon autour de la lamelle.

Ensuite, collez également l’extrémité libre de l’échantillon à l’arrière de la lamelle, en laissant le haut de la lamelle recouvert uniquement de l’échantillon de fibre. Placez les échantillons de fibres dans une plaque à 24 puits. Stérilisez les échantillons en les immergeant dans de l’éthanol à 80 % pendant une heure.

Rincez l’éthanol des échantillons à l’aide d’eau déminéralisée. Ensuite, pipetez 2 millilitres de milieu basal sur les échantillons, en veillant à couvrir tout l’échantillon pendant cinq minutes. Utilisez des cellules fibroblastiques 3T3 pour ensemencer les échantillons de fibres.

Mettez en suspension les cellules dans du DMEM, complété par des antibiotiques et 10 % de sérum de veau fœtal, de sorte qu’il y ait environ 62 000 cellules par centimètre carré par millilitre de DMEM. Déposez un millilitre de la cellule 3T3 contenant la solution DMEM dans chaque plaque de puits, en veillant à ce que chaque échantillon de fibre soit recouvert d’environ 62 000 cellules par centimètre carré. Incuber les plaques du puits pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après avoir coupé les membranes séchées en nanofibres PCL/kératine, stérilisez les échantillons de 900 millimètres carrés avec 80 % d’alcool pendant une période d’incubation de 10 minutes. Ensuite, lavez soigneusement les membranes avec de l’eau déminéralisée. Ensuite, incubez les échantillons dans 15 millilitres de PBS, pH 7,5, à 37 degrés Celsius, en remplaçant le tampon tous les trois jours.

Sortez les membranes de la solution à des intervalles spécifiés d’une semaine et de sept semaines. Rincer à l’eau déminéralisée. Placez les échantillons de membrane dans des ampoules de lyophilisation.

Placez les scellés sur les ampoules et créez un vide pour lyoholiser les échantillons pendant 24 heures jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs. Ensuite, fixez l’échantillon séché à un microscope électronique à balayage, ou MEB, à l’aide de ruban de cuivre. Placez la platine à l’intérieur de la coucheuse à pulvérisation cathodique et enduisez-la d’or à 15 milliampères pendant une minute et 30 secondes.

Chargez l’échantillon dans la chambre du MEB. Observez les échantillons de fibres à une tension d’accélération de 1,5 kilovolts et cinq microampères de courant. Des images représentatives de nanofibres à base de PCL/kératine électrofilées avec succès à partir de solutions avec des rapports PCL/kératine de 70 à 30, 80 à 20 et 90 à 10 sont présentées ici.

On a constaté que les fibres électrofilées avaient des modules de Young proches de ceux du tissu natif. Les modules de Young diminuaient avec l’augmentation du rapport de kératine. La figure montre une tendance graphique de la variation du module de Young en fonction du rapport PCL/kératine.

Les spectres de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier présentés ici confirment la liaison de la PCL à la kératine. Le pic principal, mesuré à 1 722 centimètres inverses, correspond aux mesures de base standard de la bande d’absorption PCL et est visible dans tous les spectres. L’adhésion cellulaire et la prolifération sur les fibres de kératine PCL confirment que les fibres ne sont pas toxiques et fournissent un soutien à la croissance cellulaire.

La croissance des filopodes le long des nanofibres indique une interaction favorable entre les fibroblastes et les fibres PCL/kératine. Une fois maîtrisée, cette technique de synthèse de nanofibres peut se faire en 24 heures si elle est bien réalisée. Lors de la tentative de procédure d’électrofilage, il est important de se rappeler la viscosité de la solution polymère, le débit de la solution, la tension appliquée, la vitesse du tambour rotatif et les étapes de culture cellulaire des fibroblastes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser des nanofibres à base de PCL/kertain et de son importance dans le domaine de l’ingénierie biomédicale. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la viabilité cellulaire et les tests de dégradation in vivo peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la réponse toxique aux tissus, la croissance des tissus et la dégradation des fibres. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie régénérative pour explorer des domaines tels que la régénération de la peau, la cicatrisation des plaies et l’administration de médicaments.

N’oubliez pas que travailler avec des solvants organiques, tels que le TFE, et des tensions élevées peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de lunettes de sécurité, de blouses de laboratoire et de gants, et l’élimination appropriée des solvants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.