Name: Synthèse de nanofibres à base de kératine de génie biomédical (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Découvrez la synthèse de nanofibres à base de kératine par électrofilage pour l'ingénierie tissulaire et la cicatrisation des plaies. Cette méthode efficace et peu coûteuse permet la production à grande échelle.

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Auteurs tiennent à remercier la National Science Foundation travers Engineering Center de recherche pour avoir révolutionné biomatériaux métalliques (ERC-0812348) et de nanotechnologie de premier cycle de l&#39;éducation (CEE 1.242.139) pour le soutien financier.

Tout protocole suit les lignes directrices de l&#39;Université d&#39;Etat Bureau de la conformité et de l&#39;éthique de la recherche North Carolina A &amp; T. 1. Préparation des produits chimiques pour la kératine Extraction 4 <ol><li> Pour préparer 1000 ml de 2% en poids / volume solution d&#39;acide peracétique (PAS), sous une hotte ajouter 20 ml d&#39;acide peracétique à 980 ml d&#39;eau désionisée (DI). </li><li> Pour préparer 1000 ml de solution de base Tris 100 mM (SCT), ajouter 12,2 g de Tris base à 1000 ml d&#39;eau DI et remuer jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Préparer une solution diluée d&#39;acide chlorhydrique (ASD) dans une hotte en versant 4 ml d&#39;acide chlorhydrique concentré dans 30 ml d&#39;eau DI. </li><li> Procurer environ 20 g de coupures de cheveux humains qui ne sont pas traités chimiquement ou modifiées. Les cheveux peuvent être de toute longueur. </li><li> Laver soigneusement les cheveux, à la main, avec de l&#39;eau chaude et du savon. Utilisez (DI) de l&#39;eau déminéralisée pour le rinçage final. </li><li> Mettre les cheveux en deux 600 ml béchers et placer dans un 80 ºC oême pendant 1 heure. </li><li> Égoutter le liquide du fond du récipient et le placer dans le four jusqu&#39;à ce que les cheveux sont complètement secs. </li><li> Diviser séché les cheveux de façon égale entre les béchers de 600 ml, placer 10 g de cheveux dans chaque bécher. Ne pas laisser les cheveux pour remplir plus de 500 ml. </li><li> Verser 500 ml de PAS dans chaque bêcher en veillant à couvrir tous les cheveux. Couvrir les verres avec du parafilm et stocker pendant 12 heures. </li></ol> 2. Préparation de kératine Extrait Solution <ol><li> Séparer les cheveux du PAS à l&#39;aide d&#39;un tamis de 500 um. Recueillir les PAS de déchets dans un récipient séparé. Rincer les cheveux avec de l&#39;eau déminéralisée pour éliminer toute PAS restes. </li><li> Placer les cheveux rincés dans une fiole de 500 ml. Verser 400 ml de TBS dans le ballon, en prenant soin que les cheveux est couverte. Lieu ballon dans un bain secouant réglé à 38 ° C, 65 min pendant 1 heure. </li><li> Après 1 heure, retirer les tremblements de bain et verser le liquide, environ 400 ml de solution d&#39;extraction de la kératine (KES), iNto un 1000 ml bécher. </li><li> Verser 400 ml d&#39;eau désionisée dans le flacon contenant les cheveux veillant à ce que les cheveux sont couverts et le placer en arrière dans le bain sous agitation pendant une heure. Enlever le ballon du bain secouer et verser les 400 ml restants de l&#39;KES dans le bécher de 1000 ml avec le KES déjà recueillis. Les cheveux ne sont plus nécessaires et peuvent être déversés sur le ballon et jeté dans la poubelle la plus proche. </li></ol> 3. Concentration de l&#39;extrait de la solution de kératine <ol><li> Remplir bain rotodistiller à la ligne supérieure avec de l&#39;eau distillée et mis à 90 ºC. Réglez la vitesse de rotation de 200 tours par minute. Allumez le liquide de refroidissement refroidisseur-pompe et réglez à -10 ºC. </li><li> En utilisant un pH-mètre pour surveiller le pH de la KES, utiliser une pipette pour ajouter lentement 1 mM DHAS au KES jusqu&#39;à atteindre un pH de 7,0. Incorporer lentement que la solution est ajoutée. </li><li> Verser le KES neutralisé dans les 500 ml de ballon à fond rond jusqu&#39;à environ trimestre complet. Exécutez le distillateur selon fabricantprotocole de 1,25 h. <ol><li> Répétez l&#39;étape 3.3 jusqu&#39;à ce que le KES a été distillée. Assurez-vous que le ballon est fermement. </li></ol></li></ol> 4. Extrait de dialyse de la solution de kératine <ol><li> Verser la solution KES également en 12 14 ml tubes coniques séparées. Centrifuger les tubes à 1050 g pendant 10 min. </li><li> Verser le KES centrifugé dans un bécher propre, en veillant à vider des débris collectés. Répétez jusqu&#39;à ce que la totalité de la KES a été centrifugé. </li><li> Remplir un 2000 ml graduée avec de l&#39;eau DI. </li><li> Couper la dialyse membrane de cellulose de tube à 24 pouces, et le clip de l&#39;une des extrémités du tube pour la maintenir fermée. </li><li> Tremper la longueur du tube dans le cylindre de l&#39;eau DI pour le rendre plus souple et plus facile à ouvrir. </li><li> Ouvrir l&#39;extrémité non découpée de la membrane de cellulose de tube de dialyse et verser lentement 60 ml d&#39;une solution KES centrifugé dans le tube. Utilisez un autre clip pour fermer cette extrémité de la tubulure. </li><li> Mettez le ditube de aly en 2000 ml bouteille d&#39;eau DI et laisser reposer pendant 24 h. Changez l&#39;eau DI dans le cylindre tous les 3 à 4 heures. </li><li> Après la période de 24 heures, vider la solution KES dialyse dans des bocaux plafonnés, en étant sûr de laisser un espace au sommet et le placer dans le congélateur à -20 ° C pendant 24 heures. </li></ol> 5. La lyophilisation de la solution de kératine Extrait <ol><li> Réglez le lyophilisateur à -86 ºC. </li><li> Retirer les bocaux contenant KES congelés du congélateur, retirez les capuchons des pots, et les placer dans des ampoules de lyophilisateur. Placez les joints sur les ampoules et tourner le bouton pour créer une pression à vide de 0.133 mbar. Lyophiliser les échantillons pendant environ 48 heures, jusqu&#39;à ce que toute l&#39;humidité a disparu. </li></ol> 6. Préparation des solutions Électrofilage (10% en poids de kératine Solution) <ol><li> Retirez la kératine poudre du lyophilisateur et le peser. </li><li> Ajouter de l&#39;eau DI à la poudre de kératine pour créer un 10% en poids / poidssolution de kératine. </li></ol> 7. Préparation de la solution à 10% de PCL de poids <ol><li> Obtenir PCL (polymère ε-caprolactone, Mn de 70 à 90 kDa), et le trifluoroéthanol (TFE). Préparer un 10% en poids de PCL TFE en agitant O / N et d&#39;obtenir un mélange homogène. </li></ol> 8. Préparation de la solution de kératine / PCL <ol><li> Obtenir la solution de PCL 10% en poids et une solution préparée au préalable de la kératine 10% en poids. Ajouter la kératine dans la goutte de solution PCL sage afin de créer 10 ml PCL / solutions de kératine de 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 et ratios. </li><li> Utilisez un vortex pour obtenir un mélange homogène de la solution PCL / kératine avant électrofilage. </li></ol> 9. Production d&#39;électrofilage PCL / fibre kératinique <ol><li> Placer environ 8 ml de / PCL solution de kératine dans une seringue jetable de 10 ml muni d&#39;un tube en plastique de diamètre 0,5 mm. Placer la seringue dans une pompe à seringue, où le débit est réglé à 2,5 ml / h. </li><li&gt; Appliquer une tension à la pointe de l&#39;aiguille reliée au tube (~ positionnée 23 cm à partir de la collecte de fibres tambour, et ~ 30 degrés par rapport à l&#39;horizontale). Appliquer un 19 - tension kV 22 au tube et faire tourner le tambour de collecteur à environ 200 tours par minute. <ol><li> Enveloppez le tambour collecteur de papier d&#39;aluminium avant de lancer l&#39;échantillon. Faire en sorte que la feuille d&#39;aluminium est stable par l&#39;application de la bande de marquage sur chaque extrémité. Remarque: Les fibres se forment sur ​​la feuille d&#39;aluminium (voir la figure 2), stocker la feuille recouverte de fibres à température ambiante. </li></ol></li></ol> 10. Mechanical Analysis de PCL / kératine nanofibres <ol><li> Couper l&#39;échantillon en 60 mm par 8 mm. Assurez-vous d&#39;enregistrer l&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;un micromètre numérique. Pour chaque composition préparée, utilisez cinq échantillons. </li><li> Attacher l&#39;échantillon 60 x 8 mm dans l&#39;essai de traction. Utilisez un porte-échantillon personnalisé conçu pour se fixer l&#39;échantillon. Sandwich l&#39;échantillon entre porte-échantillons qui est fabriqué à partir d&#39;une carte d&#39;index en utilisant doubleverso bande. Appliquer la cellule de charge 10 N avec un débit de 10 mm / min de déplacement. Remarque: Le support d&#39;échantillon est conçu pour être 62 mm sur 40 mm avec une fenêtre interne de 50 mm par 38 mm. </li><li> extension de registre et les valeurs de charge grâce à des logiciels selon le protocole du logiciel. </li><li> Calculer le stress en divisant la force par zone de l&#39;échantillon testé. Ensuite, calculer souche en divisant la variation de longueur par longueur initiale. </li><li> Générer la courbe de traction en traçant le stress dans l&#39;axe des ordonnées pour correspondre valeur de déformation dans l&#39;axe des x. </li><li> Calculer le module d&#39;Young de la région linéaire, où la pente est égale au module d&#39;élasticité. Déterminer la résistance à la traction de la parcelle de souche de stress en prenant décalage dans la souche 0,2% et traçant une ligne parallèle à la courbe de la région linéaire. </li><li> Effectuer l&#39;analyse statistique des données mécaniques obtenues en triple précédemment en utilisant une analyse de variance à l&#39;aide du logiciel d&#39;analyse 8. Les valeurs de p &lt;0,05, nousêtes considéré comme statistiquement significatif. </li></ol> 11. Surface Morphologie et structurel Caractérisation <ol><li> En utilisant un microscope électronique à balayage (MEB) avec des paramètres de tension d&#39;accélération de 15 kV et un courant de 5 uA d&#39;observer la morphologie des fibres électrofilées. <ol><li> Avant l&#39;imagerie avec SEM, couper une section de 2 cm 2 de la fibre et l&#39;attacher à un stade SEM en utilisant du ruban de cuivre. Placez la scène à l&#39;intérieur du dispositif de revêtement par pulvérisation et le manteau d&#39;or à 15 mA pendant 1 min et 30 sec pour créer une couche épaisse d&#39;environ 11 nm d&#39;or. Chargez l&#39;échantillon dans la chambre de la SEM. Respecter les échantillons de fibres. </li></ol></li><li> En utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) pour caractériser la liaison chimique entre la PCL et la kératine. Placez la section 2 cm 2 de la membrane électrofilés de nanofibres dans un support magnétique et purger le système avec de l&#39;air sec avant le test. Obtenir des spectres de 200 scans et d&#39;analyser les spectres en utilisant standard logiciel conformément au protocole du logiciel. </li><li> Effectuer une analyse de spectre en utilisant un logiciel standard et utiliser trois exemplaires de chaque rapport de nanofibres selon le protocole du fabricant. </li></ol> 12. étude de l&#39;interaction cellule-fibres <ol><li> Couper fibres en 16 mm 2 échantillons. Utilisez, une colle biocompatible à base de silicone pour fixer chaque échantillon à lamelles avec un diamètre de 12 mm. </li><li> Collez une extrémité de l&#39;échantillon de fibres à l&#39;arrière de la lamelle, envelopper l&#39;échantillon autour de la lamelle, puis collez l&#39;extrémité libre de l&#39;échantillon à l&#39;arrière de la lamelle ainsi, laissant le haut de la glissade couverte avec seulement le échantillon de fibres. </li><li> Placer les échantillons de fibres dans une plaque à 24 puits. Stériliser les échantillons par immersion dans 80% d&#39;éthanol pendant 1 heure. </li><li> Rincer l&#39;éthanol à partir des échantillons à l&#39;aide de l&#39;eau déminéralisée. Puis, une pipette 2 ml de milieu de base sur les échantillons, en veillant à couvrir l&#39;ensemble de l&#39;échantillon. Retirer le milieu après 5 min. </li><li> Utilisez fibroblastes 3cellules T3 à ensemencer les échantillons de fibres. Suspendre les cellules dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec des antibiotiques et 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de sorte qu&#39;il y a environ 62 000 cellules / cm 2 par 1 ml de DMEM. </li><li> Laisser tomber 1 ml de la solution contenant des cellules 3T3-DMEM dans chaque plaque et faire en sorte que chaque échantillon de fibre est recouverte d&#39;environ 62 000 cellules / cm2. Incuber les puits des plaques pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Remarque: Utilisez 5% de CO 2, car ce niveau peut généralement maintenir le pH du milieu cellulaire dans la gamme physiologique pendant des jours. </li></ol> 13. Dégradation de la matrice nanofibres <ol><li> Cut séché PCL / kératine des membranes de nanofibres en place d&#39;environ 30 mm x 30 mm. </li><li> Stériliser les échantillons de 900 mm 2 avec 80% d&#39;alcool pour une période d&#39;incubation de 10 min et laver soigneusement avec de l&#39;eau DI. Incuber les échantillons dans 15 ml de PBS, pH 7,5, à 37 ° C. Remplacer le buffert tous les 3 jours. </li><li> Prenez les membranes de la solution à des intervalles déterminés, 1 semaine et 7 semaines, et rincer avec de l&#39;eau DI. </li><li> Placer les échantillons de membrane dans des ampoules de lyophilisateur. Placez les joints sur les ampoules et tourner le bouton pour créer un vide. Lyophiliser pendant 24 heures, jusqu&#39;à séchage complet. </li><li> Fixer l&#39;échantillon séché à un stade SEM en utilisant du ruban de cuivre. Placez la scène à l&#39;intérieur du dispositif de revêtement par pulvérisation et le manteau d&#39;or à 15 mA pendant 1 min et 30 sec. </li><li> Chargez l&#39;échantillon dans la chambre de la SEM. Respecter les échantillons de fibres à une tension d&#39;accélération de 1,5 kV et 5 courant de pA. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Extraction de la kératine des cheveux humains a été réalisée avec succès. L&#39;acide peracétique a agi comme un agent oxydant sur la chevelure humaine, ce qui permet la kératine à être extraite par la base Tris. La production de poudre de kératine était petite échelle en raison du fait qu&#39;il n&#39;a été fait à des fins de recherche. Cette procédure a déjà été établie dans l&#39;industrie pour la production à grande échelle. Le but de l&#39;extraction de la kératine à petite échelle était de contrôler la contaminati...

Électrofilage est reconnue comme étant une méthode courante de réaliser des nanofibres de polymère. Les fibres peuvent être produites à l&#39;échelle nanométrique et les propriétés des fibres sont personnalisables 1. Ces évolutions et les caractéristiques des nanofibres électrofilées ont été particulièrement intéressant pour leurs applications en génie biomédical en particulier dans l&#39;ingénierie tissulaire. Les nanofibres électrofilées possèdent des similitudes avec la matrice extracellulaire et de favoriser ainsi l&#39;adhérence cellulaire, la migration et la prolifération 2. En raison de cette ressemblance avec la matrice extracellulaire (ECM), les fibres électrofilées peuvent être utilisés comme matériaux pour aider à pansement, l&#39;administration de médicaments, et pour les tissus d&#39;ingénierie tels que le foie, les os, le cœur et les muscles 3. Une variété de différents polymères d&#39;origine synthétique et naturel ont été utilisés pour créer des fibres électrofilées pour différentes applications en génie biomédical 4. Récemment, il a été de plus en plus dansintérêt dans le développement de nanofibres composites par mélange des polymères synthétiques et naturels 4. Dans ces compositions, le produit final héritent typiquement la résistance mécanique associé au polymère synthétique, tout en adoptant des signaux biologiques et les propriétés du polymère naturel. Dans cette expérience, PCL et de la kératine sont présentés comme des polymères synthétiques et naturels à utiliser pour la synthèse d&#39;un composite de nanofibres. La kératine est un polymère naturel que l&#39;on trouve dans les cheveux, la laine et les ongles. Il contient de nombreux résidus d&#39;acide aminé; d&#39;intérêt notable est la cystéine 4,5. Idéalement, un polymère naturel serait biorenouvelable, biocompatible et biodégradable. Kératine possède ces trois caractéristiques, tout en améliorant la prolifération cellulaire et l&#39;attachement aux biomatériaux, il a été incorporé dans 6. Polycaprolactone (PCL) est un polymère résorbable, synthétique qui est important dansingénierie tissulaire 4. Ce polymère a déjà été salué pour sa stabilité structurelle et mécanique, cependant, il n&#39;a pas d&#39;affinité cellulaire et présente un taux de dégradation de longue haleine. La nature hydrophobe de PCL est probablement responsable de l&#39;absence d&#39;affinité de la cellule 7. Cependant, PCL compense ses limites en étant hautement miscible avec d&#39;autres polymères. A PCL / composite kératine devrait démontrer les propriétés mécaniques du PCL et d&#39;incorporer les propriétés biologiques de la kératine, ce qui en fait un choix idéal pour diverses applications biomédicales.

<table><tbody><tr><td>Cheveux humains&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Obtenu auprès d’un salon de coiffure local à Greensboro</td></tr><tr><td>Acide peracétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCL (polymère e-caprolactone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>502-44-3</td><td>Mn 70-90 kDa</td></tr><tr><td>Trifluoroéthanol (TFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris (poudre de base TrizmaTM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>>99,9 % cristallin</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212 Lot 093601</td><td>Waltham, MA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Sarasota, FL</td></tr><tr><td>Membrane cellulosique</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>12 - 14 kDa microscope optique à coupure moléculaire</td></tr><tr><td></td><td>Olympus BX51M</td><td>BX51M</td> Japon <td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Hitachi SU8000</td><td>SU8000</td><td>Japon</td></tr><tr><td>Machine de table Shimadzu</td> Amérique <td>du Nord Instruments d’analyse et de mesure Série AGS-X</td><td>Série AGS-X&nbsp ;</td><td>Columbia, Maryland</td></tr><tr><td>Spectroscopie infrarouge à transformée</td> de <td>Fourier Instrument Bruker Tensor 2&nbsp ;</td><td></td><td>Billerica, MA</td></tr><tr><td>Microcal Origin software</td><td></td><td></td><td>Northampton, MA</td></tr><tr><td>Diffraction des rayons X (XRD)</td><td>Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer</td><td></td><td>Madison, WI</td></tr><tr><td>Fibroblast 3T3&nbsp ; cell</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td></td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini Lecteur de microplaques</td><td>XPS Molecular Devices</td><td></td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Etudiant - Newman-Keuls test post-hoc</td><td>Logiciel</td><td></td><td></td> SigmaPlot 12</tr></tbody></table>

synthèse de nanofibres à base de kératine de génie biomédical

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Électrofilage, du fait de sa polyvalence et le potentiel pour des applications dans divers domaines, est souvent utilisé pour fabriquer des nanofibres. La production de ces nanofibres poreux est d&#39;un grand intérêt en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques. Ici, nous élaborons sur la fabrication de la kératine contenant poly (ε-caprolactone) (PCL) nanofibres (c.-à-PCL / fibre composite kératine). Eau kératine soluble a été extrait à partir de cheveux humains et mélangé avec PCL dans différents rapports. La solution mélangée de PCL / kératine a été transformé en membranes nanofibrous l&#39;aide d&#39;un laboratoire conçu électrofilage mis en place. la morphologie des fibres et les propriétés mécaniques de la nanofibre obtenue ont été observés et évalués en utilisant la microscopie électronique à balayage et d&#39;essai à la traction. En outre, dégradabilité et chimiques propriétés du nanofibres ont été étudiées par FTIR. images MEB ont montré la morphologie de surface uniforme pour les fibres PCL / kératine de compositions différentes. Ceux-PCL / Keratin fibres ont également montré d&#39;excellentes propriétés mécaniques telles que le module et l&#39;échec du point de Young. cellules fibroblastes étaient capables de se fixer et proliférer prouvant ainsi une bonne viabilité cellulaire. Sur la base des caractéristiques décrites ci-dessus, on peut affirmer que les fortement nanofibres mélanges de polymères naturels et synthétiques peuvent représenter un excellent développement des matériaux composites qui peuvent être utilisés pour diverses applications biomédicales.

fibre Morphologie images MEB des fibres ont été obtenues pour toutes les compositions de fibres. Voir la figure 3. Fibre image confirme que les fibres sont orientées de manière aléatoire. essais mécaniques Mécaniquement fibres résistantes sont généralement nécessaires pour diverses applications d&#39;ingénierie tissulaire. Ces fibres doivent conserver la...

nanofibres de électrofilées ont une grande surface au rapport de poids, une excellente intégrité mécanique, et de soutenir la croissance et la prolifération cellulaire. Ces nanofibres ont un large éventail d&#39;applications biomédicales. Ici, nous fabriquons kératiniques / nanofibres PCL, en utilisant la technique d&#39;électrofilage, et de caractériser les fibres pour des applications possibles dans l&#39;ingénierie tissulaire.

Synthèse de nanofibres à base de kératine de génie biomédical

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

L'objectif général de cette expérience est de synthétiser et de caractériser des nanofibres à base de kératine pour des applications biomédicales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie biomédical, telles que la cicatrisation des plaies, la délivrance de médicaments et les tissus ingénierisés, comme ceux du foie, des os et des muscles. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est peu coûteuse, efficace et peut être adaptée à une production à grande échelle.Les implications de cette technique s'étendent au traitement des plaies et à l'administration de médicaments pour la régénération tissulaire. Bien que cette méthode permette de comprendre les avantages liés à l'utilisation de nanofibres électrofilées, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que la régénération tissulaire. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il est difficile de préparer une substance polymère capable de générer des nanofibres.Se procurer environ 20 grammes de cheveux humains non traités chimiquement ni modifiés. Les cheveux peuvent être de n'importe quelle longueur. Laver soigneusement les cheveux à la main avec de l'eau tiède et du savon.Utiliser de l'eau déionisée pour le rinçage final. Placer les cheveux dans deux béchers de 600 millilitres et les mettre dans une étuve à 80 degrés Celsius pendant une heure. Une fois secs, répartir uniformément les cheveux secs entre les deux béchers de 600 millilitres, en plaçant 10 grammes de cheveux dans chaque bécher.Ne laissez pas les cheveux occuper plus de 500 millilitres. Ensuite, versez 500 millilitres de solution d'acide peracétique, ou PAS, dans chaque bécher, en veillant à recouvrir entièrement les cheveux. Recouvrez les béchers avec du Parafilm et laissez reposer pendant 12 heures.Séparez les cheveux du PAS à l’aide d’un tamis de 500 microns, en recueillant le PAS usé dans un récipient séparé. Rincez soigneusement les cheveux avec de l’eau déionisée afin d’éliminer tout résidu de PAS. Après avoir placé les cheveux rincés dans un flacon de 500 millilitres, versez 400 millilitres de solution de Tris Base 100 millimolaire, ou TBS, dans le flacon, en veillant à ce que les cheveux soient entièrement recouverts.Ensuite, placer le flacon dans un bain agitateur réglé à 38 degrés Celsius, 65 tr/min, pendant une heure. Après une heure, retirer le flacon du bain agitateur. Verser le liquide, soit environ 400 millilitres de solution d'extraction de kératine, ou KES, dans un bécher de 1000 millilitres.Verser 400 millilitres d'eau désionisée dans le flacon contenant les cheveux, en s'assurant que les cheveux sont recouverts avant de replacer le flacon dans le bain agitateur pendant une heure. Retirer le flacon du bain agitateur et verser les 400 millilitres restants du KES dans le bécher de 1000 millilitres contenant le KES précédemment recueilli. Les cheveux ne sont plus nécessaires et peuvent être jetés dans la poubelle la plus proche.Après avoir neutralisé le KES recueilli comme décrit dans le protocole écrit, verser la solution dans un ballon rond de 500 millilitres jusqu'à environ un quart plein. Faire fonctionner le distillateur conformément au protocole du fabricant pendant 1,25 heure, en veillant à ce que le ballon soit bien fixé. Répéter ce processus jusqu'à ce que tout le KES ait été distillé.Verser équitablement la solution KES distillée dans 12 tubes coniques distincts de 14 millilitres. Centrifuger les tubes à 1 050 ×g pendant 10 minutes. Verser la solution KES centrifugée dans un bécher propre, en veillant à verser en s'éloignant des débris accumulés.Répéter jusqu'à ce que tout le KES ait été centrifugé. Ensuite, couper la membrane en cellulose de tubulure de dialyse à 24 pouces et pincer une extrémité du tube pour la maintenir fermée. Ouvrir l'extrémité non pincée de la membrane en cellulose de tubulure de dialyse et verser lentement 60 millilitres de solution de KES centrifugée dans le tube.Utilisez un autre clip pour fermer cette extrémité du tube. Placez le tube de dialyse dans un cylindre de 2 000 millilitres d’eau déionisée et laissez-le reposer pendant 24 heures, en changeant l’eau déionisée du cylindre toutes les trois à quatre heures. Ensuite, versez la solution KES dialysée dans des bocaux fermés, en veillant à laisser un espace libre au sommet.Placer les bocaux fermés dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 24 heures. Après la période de congélation de 24 heures, retirer les couvercles des bocaux et les placer dans des ampoules pour lyophilisateur. Mettre les scellés sur les ampoules et tourner le bouton pour créer une pression sous vide de 0,133 millibar.LyoPhylisez les échantillons pendant environ 48 heures jusqu'à ce que toute l'humidité ait disparu. Préparez une solution de kératine dans le PCL en ajoutant goutte à goutte une solution de kératine à 10 % en poids dans une solution de PCL à 10 % en poids afin d'obtenir des solutions de 10 millilitres avec des rapports PCL sur kératine de 90 à 10, 80 à 20, 70 à 30 et 60 à 40. Introduisez environ huit millilitres de la solution PCL/kératine homogénéisée par vortex dans une seringue jetable de 10 millilitres équipée d'un tube en plastique de 0,5 millimètre de diamètre.Placer la seringue dans une pompe à seringue dont le débit est réglé à 2,5 millilitres par heure. Appliquer une tension à l'extrémité de l'aiguille reliée au tube. Appliquer une tension de 19 à 22 kilovolts au tube et faire tourner le tambour collecteur à environ 200 tr/min.Coupez les fibres en échantillons de 16 millimètres carrés. Utilisez une colle biocompatible à base de silicone pour fixer chaque échantillon sur des lamelles de 12 millimètres de diamètre. Collez une extrémité de l'échantillon de fibre à l'arrière de la lamelle et enroulez l'échantillon autour de celle-ci.Ensuite, collez l'extrémité libre de l'échantillon à l'arrière de la lame de couverture également, en laissant le haut de la lame recouvert uniquement par l'échantillon de fibre. Placez les échantillons de fibre dans une plaque de 24 puits. Stérilisez les échantillons en les immergeant dans de l'éthanol à 80 % pendant une heure.Rincez l'éthanol des échantillons à l'aide d'eau déionisée. Ensuite, pipetez 2 millilitres de milieu basal sur les échantillons, en veillant à recouvrir entièrement l'échantillon pendant cinq minutes. Utilisez des cellules de fibroblaste 3T3 pour ensemencer les échantillons de fibres.Suspendre les cellules dans du DMEM, complété avec des antibiotiques et 10 % de sérum bovin fœtal, de sorte qu'il y ait environ 62 000 cellules par centimètre carré pour un millilitre de DMEM. Ajouter un millilitre de la solution de DMEM contenant les cellules 3T3 dans chaque puits de la plaque, en veillant à ce que chaque échantillon de fibre soit recouvert d'environ 62 000 cellules par centimètre carré. Incuber les plaques pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Après avoir découpé les membranes de nanofibres de PCL/kératine séchées, stérilisez les échantillons de 900 millimètres carrés avec de l'alcool à 80 % pendant une période d'incubation de 10 minutes. Ensuite, lavez soigneusement les membranes avec de l'eau déionisée. Puis, incubez les échantillons dans 15 millilitres de PBS, pH 7,5, à 37 degrés Celsius, en renouvelant le tampon tous les trois jours.Retirer les membranes de la solution à des intervalles précisés d'une semaine et de sept semaines. Rincer à l'eau déionisée. Placer les échantillons de membrane dans des ampoules pour lyophilisateur.Placer les scellés sur les ampoules et créer un vide afin de lyophiliser les échantillons pendant 24 heures jusqu'à complète dessiccation. Ensuite, fixer l'échantillon séché sur un porte-échantillon de microscope électronique à balayage, ou MEB, à l'aide d'un ruban en cuivre. Placer le porte-échantillon à l'intérieur du pulvérisateur cathodique et recouvrir d'or à 15 milliampères pendant une minute et trente secondes.Chargez l'échantillon dans la chambre du MEB. Observez les échantillons de fibres à une tension d'accélération de 1,5 kilovolt et un courant de cinq microampères. Des images représentatives de nanofibres à base de PCL/kératine correctement électrofilées à partir de solutions aux rapports PCL/kératine de 70 à 30, 80 à 20 et 90 à 10 sont présentées ici.On a constaté que les fibres électrofilées présentaient des modules de Young proches de ceux du tissu natif. Les modules de Young diminuent avec un rapport de kératine accru. Le graphique illustre l'évolution du module de Young en fonction du rapport PCL/kératine.Les spectres de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier présentés ici confirment la liaison du PCL à la kératine. Le pic principal, mesuré à 1 722 centimètres inverses, correspond aux mesures de référence classiques de la bande d'absorption du PCL et est visible sur tous les spectres. L'adhérence et la prolifération cellulaires sur les fibres de PCL et de kératine confirment que ces fibres ne sont pas toxiques et offrent un support favorable à la croissance cellulaire.La croissance des filopodes le long des nanofibres indique une interaction favorable entre les fibroblastes et les fibres de PCL/kératine. Une fois maîtrisée, cette technique de synthèse de nanofibres peut être réalisée en 24 heures si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de procédure d'électrofilage, il est important de tenir compte de la viscosité de la solution polymère, du débit de la solution, de la tension appliquée, de la vitesse du tambour rotatif et des étapes de culture cellulaire des fibroblastes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment synthétiser des nanofibres à base de PCL/kératine et l'importance de cette méthode dans le domaine du génie biomédical. En suivant cette procédure, d'autres méthodes telles que l'évaluation de la viabilité cellulaire et les tests de dégradation in vivo peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la réponse toxicologique sur les tissus, la croissance tissulaire et la dégradation des fibres. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du génie régénératif pour explorer des domaines tels que la régénération cutanée, la cicatrisation des plaies et la délivrance de médicaments.N'oubliez pas que le travail avec des solvants organiques, tels que le TFE, et des tensions élevées peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de lunettes de sécurité, de blouses de laboratoire et de gants, ainsi qu'une élimination appropriée des solvants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Une approche efficace pour la préparation de nanofibres décorées avec des groupes fonctionnels capables d'interagir spécifiquement avec les protéines est décrit. La première approche nécessite la préparation d'un polymère fonctionnalisé avec le groupe fonctionnel approprié. Le polymère fonctionnel est fabriqué en nanofibres par électrofilage. L'efficacité de la fixation des nanofibres avec une protéine est étudiée par microscopie confocale.

Procédure de Fabrication nanofibres biofonctionnelles

Échafaudages électrofilées peuvent être traitées de post-production pour les applications d'ingénierie tissulaire. Nous décrivons ici les méthodes de filature échafaudages complexes (par filage consécutives), pour faire plus épais échafaudages (par le multi-couches en utilisant la chaleur ou de vapeur recuit), pour atteindre la stérilité (production aseptique ou la stérilisation post-production) et pour la réalisation appropriées des propriétés biomécaniques.

Traitement post-production des fibres électrofilées de génie tissulaire

Procédé pour obtenir des nanofibres et des nanostructures complexes de protéines de matrice extracellulaire uniques ou multiples est décrite. Cette méthode utilise les interactions protéine-surface pour créer des matériaux à base de protéines sans date avec la composition accordable et de l'architecture pour une utilisation dans une variété d'applications d'ingénierie tissulaire et de la biotechnologie.

Nanofibres ECM de protéines et Utilisation de l&#39;assemblage de la surface à l&#39;initiative Nanostructures Engineered

Synthèse et la fabrication de fibres longues électrofilé couvrant une zone de plus grand dépôt par un collecteur nouvellement conçu à partir d'un polymère biodégradable roman nommé poly (glycérol-dodécanoate) (PGD) a été signalé. Les fibres sont capables de soutenir la croissance de cellules dérivées de cellules souches pluripotentes de souris.

Électrofilé Fort échafaudages de poly (glycérol-dodécanedioate) pour l&#39;ingénierie des tissus neuronaux De Souris cellules souches embryonnaires

Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des échafaudages électrofilé de nanofibres avec l'organisation graduée de fibres et d'explorer leurs applications dans la régulation de la morphologie des cellules / orientation. Dégradés en ce qui concerne les propriétés physiques et chimiques des échafaudages de nanofibres offrent une grande variété d'applications dans le domaine biomédical.

Électrofilées nanofibres échafaudages avec des gradations dans l&#39;organisation fibre

Les matériaux polymères superhydrophobes bidimensionnels et tridimensionnels sont préparés par électrofilage ou électropulvérisation de polymères biodégradables mélangés à un polymère à énergie de surface inférieure de composition similaire.

Superhydrophobes fabrication de matériaux polymères pour des applications biomédicales

Cet article décrit la procédure pour fabriquer et caractériser les fibres électrofilées Griffithsin-modified poly (acide lactique-co-glycolique) qui démontrent une activité adhésive et antivirale puissante contre l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 in vitro. Méthodes utilisées pour synthétiser, surface-modifier et de caractériser la morphologie qui en résulte, conjugaison, et désorption de Griffithsin de surface-modifiée en fibres sont décrites.

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L’objectif de ce protocole est de montrer l’assemblage d’une nanomatrix biomimétique (NM) avec des nanotubes de base Janus (JBNTs) et de la fibronectine (FN). Lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs), les MR présentent une excellente bioactivité en encourageant l’adhérence hMSCs.

Fabrication d’une nanomatrice biomimétique avec nanotubes de base Janus et fibronectine pour l’adhérence aux cellules souches

Les inserts de culture tissulaire avec membranes en plastique sont la référence dans les laboratoires de culture cellulaire en tant que supports perméables pour établir des couches cellulaires et des modèles de tissus barrières. Ici, nous présentons une méthode simple pour remplacer la membrane plastique par une membrane plus pertinente sur le plan biologique, fabriquée à partir d’une protéine de soie d’araignée fonctionnalisée recombinante.

Membrane basale nanofibrillaire en soie d’araignée fonctionnalisée recombinante dans des inserts de culture tissulaire sur mesure

Le protocole suivant présente une méthode d’extrusion basée sur le cisaillement pour la fabrication d’hydrogels de collagène avec des fibrilles à motifs nanométriques, qui peut être appliquée à un large éventail d’applications d’ingénierie tissulaire.

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Synthèse de nanofibres à base de kératine de génie biomédical

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