Name: Enrichissement de la membrane de Bruch des yeux de donneur humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez une technique de dissection pour enrichir la membrane de Bruch d'yeux humains post-mortem. Cette méthode permet d'analyser son contenu protéique et glucidique sans contamination, facilitant l'étude de la dégénérescence maculaire liée à l'âge.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Isaac Zambrano et le personnel de la Manchester Eye Hospital Banque d&#39;yeux pour la fourniture de tissus de l&#39;œil de donneur humain, et M. Pete Walker, de la Faculté de l&#39;établissement Life Sciences histologie pour les images H &amp; E colorées. Un merci tout spécial à M. Roger Meadows pour son aide avec la microscopie. SJC est récipiendaire d&#39;un Conseil de recherches médicales du développement (MRC) Carrière Fellowship (MR / K024418 / 1) et les auteurs reconnaissent aussi d&#39;autres financement récent de recherche du CRM (G0900538 et K004441), Fight for Sight (1866) et La Société maculaire.

Tissus de l&#39;œil humain consenti à des fins de recherche a été obtenu à partir de la Manchester Royal Eye Hospital Eye Bank après l&#39;enlèvement de la cornée pour la transplantation. L&#39;utilisation de tissus humains pour la recherche était en conformité avec la Loi sur les tissus humains (2004) des lignes directrices, et avec l&#39;approbation Comité d&#39;éthique de la recherche universitaire (référence 11305). 1. Enrichissement de la membrane de Bruch entier <ol><li> Nettoyez l&#39;espace de travail autour et sous le microscope de dissection avec 1% de désinfectant (v / v), puis essuyez avec 70% (v / v) d&#39;éthanol. </li><li> Vérifiez les points suivants sont à portée de main: un nouveau scalpel jetable, deux grattoirs stériles cellulaires (couramment utilisés dans la culture de tissus) et trois paires de pinces (énumérés ici comme A, B, et C, voir la liste des matériaux). </li><li> Placez le globe oculaire dans une boîte de Petri à usage unique, en conservant le couvercle pour une utilisation ultérieure. Grâce à un nouveau scalpel jetable, retirer tout nerf optique résiduelle, ce qui peut interférer avec la création d&#39;une plate mount du tissu. Ensuite, assurez-quatre incisions également espacées pour créer quatre quadrants, si de passer à la partie 3 (enrichissement de la membrane de Bruch maculaire) ne pas couper à travers la région de la macula. <ol><li> Assurez-vous que les entailles traversent toute la profondeur du tissu oculaire - à partir de la rétine neurosensorielle plus à l&#39;intérieur (NSR), à travers la choroïde et la sclérotique (blanc de l&#39;oeil). Continuer l&#39;incision tout le chemin autour de l&#39;œil de la marge de l&#39;œilleton vers le nerf optique. Cela permettra à l&#39;œilleton d&#39;être aplati (voir la figure 1B). </li></ol></li><li> Tenir un quadrant de œilleton aplati en utilisant pince A (pour empêcher le détachement de la choroïde), utiliser la plus grande pince B pour saisir le NSR vitré et sous-jacente et tirez ce tissu loin de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de la périphérie, se déplaçant vers le centre de l&#39;œilleton ouvert et ensuite à la partie adverse. Habituellement, mais pas toujours à la fois vitreux et détacher comme une NSR. Utilisez le scalpel à exciser toute NSR résiduelle ancré à la papille. </li><li> Encore une fois, tout en maintenant un quadrant de tissu en place en utilisant pince A, utiliser le grattoir cellulaire stérile pour déloger doucement la monocouche RPE de la totalité de la surface interne de l&#39;œilleton. Ces cellules se détachent facilement et peuvent être vus touffes brun-pigmentées sombres. Rincer avec du PBS pour laver en douceur les cellules RPE loin délogés de l&#39;œilleton. </li><li> Ensuite, utilisez pince A à retirez délicatement le tissu rouge foncé recouvrant (comprenant à la fois la membrane de Bruch et la choroïde) de tous les 4 quadrants de l&#39;oeil. Placez le tissu excisé dans un plat propre. </li><li> En utilisant le bord aplati d&#39;un gratteur de cellules pour maintenir le tissu excisé en place, utilisez le second grattoir pour gratter délicatement le tissu. Tournez le tissu et répéter, en supprimant autant excès de matériau que possible. Finalement, une membrane translucide restera: ceci est la membrane de Bruch grossièrement enrichi. L&#39;utilisation du microscope de dissection à un minimum de grossissement 20X estessentiel en facilitant l&#39;élimination de la choroïde et de l&#39;enrichissement de la membrane de Bruch. </li><li> Avec une pipette Pasteur, rincer rapidement la membrane de Bruch avec de l&#39;eau ultra pure pour enlever la choroïde résiduelle et de sang avant de placer la membrane dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Suspendre la membrane de Bruch enrichi dans environ 1 ml d&#39;eau ultra pure et brièvement de vortex (environ 15 secondes) pour aider à la lyse cellulaire contaminer toute question (voir la figure 2). Centrifuger l&#39;échantillon à 500 g pendant 30 secondes pour sédimenter la membrane et aspirer le surnageant. Remarque: la membrane de Bruch Le reste enrichi est maintenant prêt pour la solubilisation (comme décrit au paragraphe 2 ci-dessous) ou de stockage à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 2. solubilisation de la membrane et Western Blot Analyse de l&#39;entier enrichi Bruch <ol><li> D&#39;extrait de protéines de la membrane de Bruch enrichi en plongeant le tissu dans 500 pi 8 M urEA pendant 6 heures à la température ambiante dans 1,5 ml microtubes (figure 3A). </li><li> Centrifuger les échantillons solubilisés à 10 000 xg pendant 10 min pour sédimenter toute matière restante extracellulaire. Retirer le surnageant et le transférer à 3.500 membrane de dialyse MWCO Da, puis placez l&#39;échantillon dans 1 L de PBS pour dialyse pendant 16 heures à 4 ° C. </li><li> Pour chaque échantillon, ajouter 40 ul de billes d&#39;isolement des protéines, et faire tourner l&#39;échantillon / mélange bourrelet (20 tpm sur un agitateur rotatif) à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 10 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les billes. Retirer le surnageant et solubiliser la protéine liée à des billes dans 30 pi de 2 x tampon de charge d&#39;échantillon (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (p / v) de glycerol, 0,01% de bleu de bromophénol, 3% β-mercaptoethanol). </li><li> Incuber les échantillons à 100 ° C pendant 10 minutes, puis centrifuger à 10 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les billes restantes. </li><li> Chargez le surnageant qui contient les protéines libérées à un pré-casting SDSgel page gradient (voir la liste des matériaux) pour la séparation des protéines. </li><li> Visualiser les bandes de protéine séparée en utilisant un protocole de coloration commune, par exemple, le bleu de Coomassie. <ol><li> En bref, ajouter 20 ml de la tache bleu brillant (0,1% de bleu brillant (p / v), 50% de méthanol, 10% d&#39;acide acétique glacial, 40% d&#39;eau) sur le gel, et incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation douce . </li><li> Jeter la solution de coloration et laver le gel coloré avec de l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à ce que la coloration de fond est suffisamment réduite pour permettre à la protéine teinté bande visualisation. </li><li> En variante, le transfert séparé des bandes de protéines sur de la nitrocellulose pour analyse western, comme décrit ci-dessous. </li></ol></li><li> Transfert séparé bandes de protéines sur une membrane de nitrocellulose à 80 mA pendant 2,5 heures en utilisant un appareil de transfert semi-sec dans un tampon de transfert (25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 10% [v / v] méthanol). </li><li> Bloquer la membrane dans 10 ml de PBS, 10% (p / v) de lait, et 0,02% (p / v) de BSA pendant 16 heures à 4 ° C avant the addition des anticorps primaires souhaitées pour la détection de protéine. Remarque: Par exemple ici, la figure 3C montre un immunotransfert représentatif de la membrane de Bruch solubilisation de trois donneurs distincts sondé pour un régulateur de la cascade du complément, le facteur H-like protein 1 (FHL-1). </li></ol> 3. Enrichissement de la membrane de Bruch maculaire <ol><li> Suivre les étapes 1,1 - 1,3, comme décrit précédemment. </li><li> Alors que le NSR est toujours en place, localiser la fovéa coloration jaune qui représente la région de la macula centrale (voir Figure 4). Utilisation d&#39;un 6 mm biopsie poinçon stérile, placer au-dessus de la région de la fovéa et couper fermement dans la macula. <ol><li> Garder le poinçon de biopsie en place, faire une incision séparée avec un scalpel à partir du bord de l&#39;œilleton vers le bord de la lame biopsie punch, puis en utilisant pince B, décoller la matière environnante oeil à réaliser une biopsie propre. </li></ol></li><li> Utilisation pince C, supprimerle disque de 6 mm de tissu du poinçon et le placer sur le couvercle de la boîte de Pétri propre. Placez le couvercle de boîte de Pétri et de punch maculaire sous le microscope de dissection. </li><li> Retirez le disque NSR mince (vérifier jaune fovéale coloration de déduire exactitude de biopsie). Utilisez un grattoir à cellules stérile pour enlever délicatement les cellules de l&#39;EPR. </li><li> Fixez le disque maculaire via la sclérotique en utilisant les conseils de pince A, et pelez lentement la choroïde et le complexe de la membrane de Bruch utilisant pince C. Encore une fois, utiliser le grattoir de cellules pour enlever la choroïde indésirables et de la matière de sang de la membrane de Bruch. </li><li> Placez la membrane de Bruch maculaire dans un tube de 1,5 ml et de suspendre dans 1 ml d&#39;eau ultra-pure. Vortex brièvement (environ 15 secondes) pour aider à la lyse cellulaire contaminer toute question. Centrifuger l&#39;échantillon à 500 g pendant 30 secondes pour sédimenter la membrane et aspirer le surnageant. Note: La membrane de Bruch enrichi isolé de la macula peut maintenant être utilisé pour un protéomiquealy en utilisant des protocoles de digestion préférées de l&#39;utilisateur. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons ici l&#39;enrichissement de la membrane de Bruch pour une analyse approfondie permettant des analyses ultérieures, y compris western blot 11, spectrométrie de masse et les propriétés de diffusion de la membrane de Bruch utilisant modifiée chambres 11,14 Ussing. Les étapes critiques comprennent a) le raclage approfondie et lavage de la surface interne de l&#39;œil pour éliminer toutes les cellules RPE b) le raclage répété et attentive de la choroïde sous-jacente sans provoquer de Bruch se désintégrer et c) le lavage de la Bruch excisé de l&#39;eau ultrapure pour assurer la lyse des cellules résiduelles. En outre, si la membrane de Bruch la enrichie doit être utilisé pour l&#39;analyse protéomique, l&#39;extraction de la protéine par traitement à l&#39;urée est la plus efficace dans la dégradation du tissu élastique présente par rapport aux autres méthodes telles que l&#39;homogénéisation mécanique. L&#39;histologie de la membrane de Bruch enrichi indique l&#39;ECM de la choriocapillaire est pas supprimé. Ce doit être exinatten- que la couche externe de la membrane de Bruch la pentilaminar est formé par choriocapillaire endotheliales membranes basales des cellules. En effet, il peut être avantageux que l&#39;ECM de la choriocapillaire reste que des changements se produisent dans la présente dans la DMLA, y compris le dépôt de complexe complexe / d&#39;attaque membranaire du complément terminal (MAC) 15. Il convient de noter que pour l&#39;analyse histologique détaillé de la membrane de Bruch, la structure serait mieux préservé si coupe en présence de la sclérotique, la choroïde et la membrane de Bruch. En effet, l&#39;histologie présenté dans la figure 2 est uniquement destiné à démontrer le degré d&#39;enrichissement résultant de la technique décrite dans ce manuscrit. Enrichissement de maculaire Bruch nécessite dissection minutieuse de l&#39;œilleton, assurant que le NSR et en particulier la fovéa ne sont pas endommagés; autrement identification et ainsi l&#39;isolement de la macula ne sont pas possibles. L&#39;intégrité du tissue est également important de ce processus et il est donc recommandé que les échantillons de moins de 48 heures de temps post-mortem être utilisés. Le degré d&#39;enrichissement requis varie entre les donateurs et peut être affectée par l&#39;âge du donneur, le temps post-mortem, et la présence de toute pathologie oculaire. L&#39;utilisation du terme enrichi est délibérée dans la reconnaissance d&#39;une limitation de la technique, ce qui est que «la purification» ou «isolement» de la membrane de Bruch en utilisant cette méthode est tout simplement pas possible. En effet, étant donné que l&#39;ECM de la choriocapillaire fusionne dans la membrane de Bruch séparation complète il est impossible. Comprendre les changements biochimiques des tissus oculaires respectifs est essentiel dans la compréhension de la progression de la maladie de l&#39;œil. Cet enrichissement unique de la membrane de Bruch facilite cette compréhension; études en cours étudient le protéome du maculaire enrichi membrane de Bruch en utilisant la spectrométrie de masse à différents stades de la DMLAet dans des échantillons provenant de sujets avec différents génotypes d&#39;améliorer la compréhension de la pathologie moléculaire de la DMLA. Déjà la technique décrite ici a été utilisé pour identifier avec succès FHL-1 en tant que régulateur du complément prédominant dans la membrane 11 et d&#39;autres études de Bruch sur la membrane de enrichi Bruch sont susceptibles d&#39;aboutir à de nouvelles idées plus dans la pathologie moléculaire de la DMLA.

L&#39;utilisation de tissus de l&#39;œil humain post-mortem dans la recherche ophtalmique est une ressource inestimable pour la compréhension de la pathogenèse de la maladie de l&#39;œil. Analyse des yeux des bailleurs de fonds humaines a fait d&#39;importantes contributions à discerner les mécanismes qui sous-tendent liée à l&#39;âge dégénérescence maculaire (AMD), qui est la principale cause de cécité dans le monde occidental 1. Globalement, AMD représente environ 8,7% des cas de cécité et d&#39;une population vieillissante de plus en plus, il est prévu d&#39;affecter 196 millions de personnes par les résultats 2020 2. AMD dans la perte de la vision centrale et a un impact profond sur l&#39;indépendance et la qualité de vie des patients 3. DMLA précoce est caractérisée par la formation de druses et il peut évoluer vers une atrophie géographique (parfois dénommé «sec» AMD), ou néovascularisation choroïdienne (également dénommé néovasculaire ou «humide» AMD). Alors anti-VEGF injections peuvent stabiliser ou améliorer la vision de la DMLA néovasculaire il iest pas curative, et à l&#39;heure actuelle, aucun traitement existe pour l&#39;atrophie géographique. Alors il a été démontré certaines variantes génétiques de modifier AMD risque de 4 - 8, on en sait moins sur la façon dont ces variantes affectent la macula à un niveau biochimique. Un site important dans la pathogenèse AMD est la membrane de Bruch. Forme DRUSEN sein de cette structure et diverses études ont fourni des preuves de l&#39;activation du complément dans et autour de la membrane de Bruch dans AMD 9. La membrane de Bruch est une feuille de la matrice extracellulaire qui sépare les cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (RPE) de la choroïde, et est d&#39;environ 4 pm d&#39;épaisseur. La membrane de Bruch fusionne dans la choriocapillaire, une couche de la choroïde qui contient capillaires fenêtrés et externe à ce sont des couches contenant de plus grands vaisseaux sanguins 10 (figure 1A). La membrane de Bruch est une feuille supplémentaire de pentilaminarmatrice cellulaire (ECM), et cette méthodologie détails comment isoler la membrane de Bruch, avec l&#39;ECM de la choriocapillaire sous-jacents (ci-après appelé enrichi la membrane de Bruch), qui est en grande partie décellularisé et exempt de globules rouges. La membrane de Bruch enrichi a ensuite été utilisé pour des expériences de buvards et d&#39;histologie de l&#39;Ouest. En outre, la méthodologie pour enrichir la membrane de Bruch uniquement à partir de la région de la macula de l&#39;œil est décrite, qui sera d&#39;un intérêt particulier pour ceux qui enquêtent sur les aspects biochimiques de la DMLA.

<table><tbody><tr><td>Objectif auxiliaire 0,5X</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>3638</td><td>Utile (mais pas essentiel) pour l’imagerie à faible grossissement de l’œil entier</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie</td> à monture plate 6 mm <td>Oncall Medical Supplies</td><td>SCH-33-36</td><td>Poinçons de biopsie 6 mm Poinçons de sérum</td></tr><tr><td>bovin albumine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Cellule grattoirs</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td>Pour l’enrichissement membranaire</td></tr><tr><td>CyroPure Cyrovials</td><td>Sarstedt</td><td>72.38</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>12387999</td><td>Scalpels Swann-Morton stériles et emballés individuellement.</td></tr><tr><td>Deux spots LED à col de cygne sur bras de 30 cm</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>0153</td><td>Source lumineuse flexible indispensable pour la dissection et l’imagerie</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8537</td><td>Utilisé pour prévenir le dessèchement de la macula et lors de l’enrichissement de la membrane.</td></tr><tr><td>(A)</td><td>Forceps Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>INS4280</td><td>(A) Fine (100 mm) et droite</td></tr><tr><td>(B) Forceps</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>INS4272</td><td>(B) Large et émoussée (150 mm). Utile pour soulever de grandes portions d’échantillon</td></tr><tr><td>(C) Forceps</td> Scientific <td>Laboratory Supplies</td><td>INS4323</td><td>(C) Pointes fines droites</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>GXCAM 5 caméra couleur numérique & Logiciel</td><td>GT-Vision GT-Vision Ltd</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12 % Bis-Tris Protein Gels</td><td>Life</td> Technologies <td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Sterilin</td><td>101VR20</td><td>90 mm, utilisée comme boîte pour échantillons</td></tr><tr><td>Billes d’isolement des protéines (résine Strataclean)</td><td>Agilent</td><td>400714-61</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréozoom GXMXTL3T (plage de grossissement 7X - 45X)</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>5595</td><td>Microscope stéréozoom fixé sur le support de perche pour une utilisation facile lors de la dissection</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

enrichissement de la membrane de bruch des yeux de donneur humain

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

La dégénérescence maculaire (AMD) liée à l&#39;âge est la principale cause de déficience visuelle dans le monde développé. La maladie se manifeste par la destruction du centre de la rétine, appelée la macula, ce qui entraîne la perte de la vision centrale. DMLA précoce est caractérisé par la présence de petites lésions jaunâtres appelés drusen mous qui peut évoluer sur la fin AMD tels que l&#39;atrophie géographique (DMLA sèche) ou la néovascularisation (DMLA humide). Bien que les changements cliniques sont bien décrits, et la compréhension des influences génétiques sur conférant le risque de DMLA sont de plus en plus détaillée, une zone dépourvue progrès majeur est de comprendre les conséquences biochimiques de risque génétique. Ceci est partiellement dû à des difficultés dans la compréhension de la biochimie de la membrane de Bruch, une matrice extracellulaire très mince qui agit comme un filtre biologique de la matière à partir de l&#39;approvisionnement en sang et un échafaudage sur lequel l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (RPE) monocouche cellulaire réside. Drusen form à l&#39;intérieur de la membrane de Bruch et leur présence perturbe l&#39;écoulement des éléments nutritifs pour les cellules RPE. Seulement en enquêtant sur la composition en protéines de la membrane de Bruch, et même la façon dont d&#39;autres protéines interagissent avec elle, les chercheurs peuvent espérer démêler les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la formation de druses, développement de la DMLA et après la perte de vision. Cet article détaille les méthodes pour enrichir soit membrane de Bruch ensemble, ou tout simplement de la région de la macula, de sorte qu&#39;il peut être utilisé pour l&#39;analyse biochimique aval, et de fournir des exemples de la façon dont cela est déjà en train de changer la compréhension de la membrane de Bruch la biochimie.

Le protocole décrit ci-dessus pour produire les résultats de la enrichie membrane de Bruch dans l&#39;isolement de la membrane de Bruch, la MEC de la choriocapillaire et supprime la plupart des cellules / débris cellulaires, y compris la totalité de la RPE (figure 2). Le lavage de la membrane de Bruch enrichi dans de l&#39;eau est une étape clé dans la lyse des cellules de la choroïde restants. La pression exercée au cours de la mise au rebut de la choroïde apparaît pour compacter une partie de ces noyaux de cellules restantes dans la région définie par la membrane de Bruch (figure 2B). La solubilisation de la membrane de Bruch enrichi permet l&#39;analyse en aval de sa teneur en protéines. La séparation des bandes de protéines à partir de solubilisés enrichi la membrane de Bruch en utilisant un 4 - gel à gradient de SDS-PAGE à 12%, tandis que pas utile en soi pour identifier la teneur en protéine, le fait de démontrer la capacité de cette technique pour minimiser les protéines contaminantes dans le sang ce que Are lié de manière non spécifique (figure 3B). À cet égard, un grand absent de la course de gel de protéine est un groupe non négligeable de l&#39;albumine sérique humaine (~ 66 kDa) qui peuvent rendre autrement ultérieures Western blot plus difficile à interpréter: l&#39;analyse histologique de la membrane de enrichi Bruch figure 2 montre également des supports ce. En effet, dans le cadre de travail décrit précédemment 11, solubilisation de la membrane de Bruch à partir d&#39;une série de donateurs individuels ont été sondés pour un certain nombre de protéines en utilisant des anticorps spécifiques par Western blot (figure 3C). Dans le cas représenté ici, un anticorps (appelé OX23) 12 dirigé contre un 155 kDa régulateur de l&#39;immunité innée, appelé facteur H du complément (FH), a été utilisé et a démontré la présence d&#39;une bande de plus bas poids moléculaire dans les échantillons de membrane de Bruch de trois séparé les bailleurs de fonds (figure 3C). Cette suite avéré être le facteur H-like protein 1 (FHL-1), Une protéine de 49 kDa liée à FH et résultant d&#39;une variation d&#39;épissage du même gène 13. FHL-1 semble être le principal régulateur du complément présent dans la membrane de Bruch 11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Figure 1. Dissection de l&#39;oeil humain et l&#39;enrichissement des membrane de Bruch. (A) la membrane de Bruch est une barrière de la matrice extracellulaire. La choroïde contient une couche de capillaires fenêtrés qui se fondent en continu dans la membrane de Bruch (appelée la choriocapillaire) et celles-ci sépare le reste de la choroïde (contenant les gros vaisseaux sanguins) à partir de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de la monocouche cellulaire, qui prend en charge physiologiquement les cellules photoréceptrices de la rétine neurosensorielle (NSR). (B) Quatre incisions dans l&#39;œilleton humains sont faits lui permettant d&#39;être ouvert pour créer un support plat. Lavitreux peut être enlevé à l&#39;aide d&#39;une pince à épiler. Le NSR peut se détacher avec le corps vitré, mais peut aussi être retiré avec des pincettes. Un racleur de cellules est utilisé pour enlever la couche de cellules RPE de la membrane de Bruch alors qu&#39;il est encore ancré à la choroïde et la sclère. Le complexe membrane / choroïde au Bruch peut être décollée de la sclérotique et à utiliser un nouveau racleur de cellules, la choroïde extérieur peut être enlevé. Un lavage final dans de l&#39;eau ultra pure lyse cellulaire toute question restante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;histologie de la membrane de Bruch et les sections choroïde. H &amp; E tachée avant (A) et après (B) raclant les structures de la choroïde extérieures de la membrane de Bruch et de lavage dans wa ultrapurster pour générer enrichi la membrane de Bruch. Les barres d&#39;échelle représentent 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Figure 3. La solubilisation de la membrane de Bruch enrichi pour l&#39;analyse de la protéine de contenu. (A) La protéine peut être extraite de la membrane de Bruch enrichi par incubation dans de l&#39;urée 8 M pendant 6 heures à la température ambiante, avant d&#39;être dialysé contre du PBS. Pour l&#39;analyse de l&#39;Ouest, les protéines de la membrane entière dialysat de Bruch peuvent être isolés en utilisant des perles d&#39;isolement de protéines et élues par l&#39;ébullition avec Laemmli tampon réducteur de chargement d&#39;échantillon. (B) Un représentant du bleu de Coomassie gel coloré SDS-PAGE, montrant à la fois soignée et dilué solubiliser la membrane de Bruch (BM) en utilisant le procédé d. escribed dans (A) (C) un Western blot représentatif de la membrane de Bruch solubilisé à partir de 3 donateurs individuels (voies 1 - 3). sondé pour le facteur H-like protein 1 (FHL-1) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figure 4. Isolement de la membrane de Bruch Enrichi de la macula. La région macula de la rétine est une zone de 5 mm qui peut être facilement identifié par la coloration jaune de la fovéa sus-jacente, et sa proximité de la papille adjacente. Utilisation de la fovéa comme guide, placez une biopsie poinçon 6 mm sur l&#39;œil humain monté à plat pour exciser un bloc de tissu macula 6 mm. Retirez le NSR de recouvrement et gratter cellules RPE de la macula excisée. Le complexe membrane / choroïde de Bruch restant peut len être décollée de la sclérotique et soigneusement gratterez choroïde, Lyse restant matériau cellulaire par immersion dans l&#39;eau ultra-pure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

L’identification des protéines spécifiquement associées à la membrane de Bruch dans les yeux humains est une étape importante dans la compréhension des mécanismes biochimiques à l’origine des maladies oculaires telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Ce protocole décrit comment enrichir cette feuille de matrice extracellulaire pour l’analyse biochimique en aval.

Enrichissement de la membrane de Bruch des yeux de donneur humain

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

L'objectif général de cette technique de dissection tissulaire est d'enrichir la membrane de Brooks à partir d'un œil humain post-mortem et de fournir aux scientifiques le matériel spécifique nécessaire à l'analyse de sa teneur en protéines et en glucides. Cette méthode peut nous aider à comprendre des mécanismes tels que l'immunorégulation de la membrane de Brooks, qui sous-tendent un large éventail de maladies oculaires, notamment la forme la plus fréquente de cécité dans le monde occidental, la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'analyse de la membrane de Brooks acellulaire sans contamination par des composants sanguins ou par les cellules épithéliales du pigment rétinien, qui pourraient autrement conduire à des résultats erronés.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la manipulation de tissus humains est délicate et l'isolement d'une membrane de Brooks intacte est difficile à imaginer uniquement à partir d'une méthodologie écrite. La procédure sera démontrée par le Dr Selena Mcca, postdoctorante dans notre laboratoire. Pour commencer, nettoyez l'espace de travail autour et sous le microscope avec un désinfectant, puis essuyez la zone avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, rassemblez les outils nécessaires à la procédure ; une fois prêt, placez le globe oculaire dans une boîte de Pétri jetable, en conservant le couvercle pour une utilisation ultérieure.Utilisez un scalpel jetable neuf pour retirer tout nerf optique résiduel qui pourrait gêner la réalisation d'une préparation en montage plat du tissu. Ensuite, effectuez quatre incisions espacées de manière égale afin de créer quatre quadrants. Évitez de couper à travers la région maculaire uniquement lorsque vous enrichissez la membrane de Brooks maculaire tout en pénétrant à toute la profondeur de l'œil.Poursuivre l'incision tout autour, depuis la marge de la cupule oculaire jusqu'au nerf optique. Cela permettra d'aplatir la cupule oculaire. Ensuite, tenir un quadrant de la cupule oculaire aplatie avec une pince tout en utilisant une pince plus grande pour saisir le vitré et les tissus sous-jacents.Tirer ce tissu loin du pigment rétinien, de l'épithélium pigmentaire de la rétine ou EPR, en partant de la périphérie et en se dirigeant vers le centre jusqu'au côté opposé. Si le vitré et la rétine neurosensorielle ne se détachent pas ensemble, utiliser un scalpel pour exciser tout tissu résiduel ancré au niveau du disque optique tout en maintenant un quadrant de tissu en place. Utiliser un grattoir à cellules stérile pour détacher délicatement la monocouche d'EPR de toute la surface interne de la cupule oculaire.Ces cellules se détachent facilement et apparaissent sous forme d'agrégats pigmentés brun foncé. Rincer avec du PBS pour éliminer délicatement les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) détachées. Ensuite, détacher délicatement le tissu rouge foncé superficiel dans les quatre quadrants oculaires.Placer le tissu excisé dans une boîte propre. Ajouter quelques gouttes de PBS et aplatir le tissu à l’aide d’une cellule et de pinces si nécessaire. En utilisant le bord aplati d’un grattoir à cellules pour maintenir le tissu en place, utiliser un second grattoir pour gratter doucement le tissu, le retourner et répéter l’opération, en éliminant autant que possible les matériaux excédentaires.Placer le tissu dans une boîte de Pétri propre. Une fois le matériau retiré, la membrane translucide qui reste est la membrane de Brooks grossièrement enrichie. Travailler sous un microscope stéréoscopique pour enlever le chorion et enrichir davantage la membrane.Rincez brièvement la membrane de Brooks à l’eau ultrapure pour éliminer les résidus de choroïde et de sang avant de placer la membrane dans un tube microcentrifuge. Après avoir suspendu la membrane dans environ un millilitre d’eau ultrapure, vortexez brièvement pour aider à détacher toute matière cellulaire contaminante. Centrifugez l’échantillon pour former un culot et aspirez le surnageant.La membrane de brook enrichie qui reste est désormais prête à être solubilisée ou peut être conservée au congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour une utilisation ultérieure afin d'extraire les protéines de la membrane de brook enrichie, plonger le tissu dans 500 microlitres d'urée huit molaire pendant six heures.À température ambiante, centrifuger les échantillons solubilisés afin de faire précipiter toute matière extracellulaire résiduelle. Retirer le surnageant et le transférer dans une membrane de dialyse. Placer l'échantillon dans un litre de PBS pour une dialyse de 16 heures à quatre degrés Celsius.Pour chaque échantillon, ajouter 40 microlitres de billes d'isolement des protéines et faire tourner le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Récupérer les billes par centrifugation et éliminer le surnageant. Solubiliser la protéine liée aux billes dans 30 microlitres de tampon de charge d'échantillon deux fois concentré.Après une incubation de 10 minutes, centrifuger pour former un culot des billes et récupérer le surnageant. Charger les protéines libérées sur un gel SDS-PAGE préfabriqué à gradient pour la séparation des protéines.Suivez les procédures standard pour visualiser les bandes protéiques séparées, si désiré. Effectuez un immunotransfert selon les procédures habituelles en laboratoire afin de concentrer la membrane de Brooks maculaire. Suivez les mêmes procédures que celles démontrées précédemment, sauf que, lorsque la rétine neurosensorielle est encore en place, repérez la coloration jaune de la fovéa qui représente la région maculaire centrale.Placez une pince à biopsie stérile de six millimètres au-dessus de la région fovéale et tranchez fermement dans la macula, en maintenant la pince à biopsie en place. Effectuez une incision séparée à l’aide d’un scalpel depuis le bord du culot oculaire jusqu’au bord de la lame de la pince à biopsie. Détachez délicatement les tissus oculaires environnants afin d’obtenir une biopsie propre.Retirez le disque de tissu de six millimètres du punch et placez-le sur le couvercle de boîte de Pétri propre mis de côté précédemment. Placez le couvercle de la boîte de Pétri et le punch maculaire sous le microscope stéréoscopique. Vérifiez la présence d'une coloration jaune de la fovéa pour évaluer la précision de la biopsie.Ensuite, utilisez un grattoir à cellules stérile pour détacher délicatement les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE). Fixez le disque maculaire par la sclérotique à l'aide des extrémités de la pince et détachez lentement le complexe choroïde-membrane de Bruch. Si nécessaire, utilisez une lame de scalpel pour séparer la membrane de Bruch de la sclérotique.Utilisez à nouveau la lame à cellules pour éliminer les tissus choroidiens et sanguins indésirables de la membrane de Brooks. Placez la membrane de Brooks maculaire dans un tube et suspendez-la dans un millilitre d'eau ultrapure. Vortexez brièvement pour aider à détacher toute matière cellulaire contaminante. Centrifugez l'échantillon afin de faire tomber la membrane en culot et aspirez le surnageant.La membrane de Brooks enrichie, isolée à partir de la macula, peut désormais être utilisée pour une analyse protéomique selon les protocoles de digestion souhaités. Ces sections tissulaires colorées par les méthodes h et d provenant de tissu maculaire humain, avant et après le retrait des structures chorioïdiennes externes, illustrent l'enrichissement de la membrane de Brooks et des capillaires chorioïdiens acellulaires par rapport au stroma chorioïdien. Ce gel SDS-PAGE montre l'absence de contamination par l'albumine sanguine dans les échantillons de membrane de Brooks, tant purs que dilués.Cette immunotransfert représentatif a été réalisé pour détecter le facteur régulateur immunitaire, la protéine semblable au facteur H, provenant d'un des trois donneurs individuels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment enrichir la membrane de Brooks à partir d’un œil humain de manière à fournir une ressource précieuse pour les analyses biochimiques et biophysiques ultérieures de cette structure acellulaire unique. N’oubliez pas que le travail avec des tissus humains et des instruments tranchants peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’utilisation d’équipements de protection individuelle complets et la vaccination contre l’hépatite B sont indispensables.Des précautions doivent toujours être prises avant de manipuler le tissu humain.

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