Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain

L’objectif global de ce protocole est de générer de manière fiable des cellules endothéliales de croissance sanguine à partir du sang périphérique humain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie vasculaire, telles que la façon dont le dysfonctionnement des cellules endothéliales contribue aux maladies cardiovasculaires, notamment l’hypertension artérielle pulmonaire ou la maladie de von Willebrand. Le principal avantage de cette technique est qu’elle génère constamment une population stable de cellules endothéliales de croissance sanguine à partir d’un petit volume de sang périphérique adulte.

Pour commencer cette procédure. Pour chaque donneur, ajoutez trois millilitres de citrate de sodium dans chacun des deux tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 30 millilitres du sang recueilli dans chaque tube.

Retournez doucement les tubes deux à trois fois pour mélanger. Ensuite, diluez 60 millilitres de sang avec du DPBS dans un rapport de un à un, inclinez le tube contenant le gradient de densité. Milieu de centrifugation à un angle de 20 degrés avec la surface de travail à l’aide d’une pipette et d’une pipette sérologique de 25 millilitres.

Superposez lentement 21 millilitres de sang dilué sur le milieu. Ensuite, centrifugez les échantillons à 400 fois G pendant 35 minutes à température ambiante avec l’accélérateur et la pause Pendant la centrifugation, réparez une solution de collagène à 50 microgrammes par millilitre en diluant le stock. Tapez un collagène dans 10 millilitres d’acide acétique 0,02 molaire stérile.

Filtrez la suspension de collagène avant utilisation. Ensuite, ajoutez 7,5 millilitres de solution de collagène dans une fiole de culture cellulaire T 75. Laisser enrober le ballon pendant une heure à température ambiante.

Après une heure d’enrobage, aspirez la solution de collagène et pipetez 10 millilitres de DPBS dans le ballon pour éliminer le résidu d’acide acétique. Aspirez le DPBS et répétez le lavage une fois de plus. Ajoutez ensuite cinq millilitres de milieu de génération BOEC dans le flacon pour empêcher l’enrobage de collagène de se dessécher jusqu’à ce que la suspension cellulaire soit prête pour le placage.

Après la centrifugation à gradient de densité, prélevez soigneusement la couche de couche leucocytaire à l’aide d’une pipette de transfert en plastique stérile et évitez de transférer le milieu à gradient de densité. La collecte de la couche leucocytaire devrait produire environ 20 millilitres de suspension de celluloïd et de plasma de chaque tube. Ensuite, diluez la suspension de cellules mononucléaires dans le DPBS dans un rapport de un à un et retournez pour mélanger, puis centrifugez à température ambiante pendant 20 minutes à 300 fois G avec le frein et l’accélérateur réglés au maximum après la centrifugation, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension en ajoutant un millilitre de milieu de génération BOEC à chaque pastille et en pipetant de haut en bas à plusieurs reprises, tirez toutes les suspensions de cellules ensemble et remplissez le volume total à 10 millilitres avec le milieu restant.

Pour obtenir une estimation du nombre total de cellules, diluez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 490 microlitres de solution turque pour allonger les globules rouges. Comptez ensuite un échantillon de 10 microlitres de la suspension cellulaire diluée à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, plaquez la suspension cellulaire dans une seule fiole T 75 enrobée de collagène.

Garnir le volume moyen jusqu’à 15 millilitres par fiole et par culture. Les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Maintenant, changez le milieu tous les deux jours en ajoutant 15 millilitres de génération BOEC fraîche, milieu à la culture pour les week-ends, les changements de milieu peuvent être retardés à tous les trois jours.

Surveiller la fiole de culture BOEC du septième au 14e jour pour détecter l’apparition de colonies d’excroissance. Identifiez les colonies comme des groupes circulaires de cellules présentant la morphologie classique des pavés endothéliaux. Une fois qu’une ou plusieurs colonies sont identifiées dans le flacon, continuez avec les changements de milieu et laissez les colonies croître jusqu’à environ 1000 à 2000 cellules par colonie.

Avant l’emballage, déterminez le nombre de cellules par colonie à l’aide d’une estimation visuelle approximative. Passez ensuite les cellules en rinçant deux fois les flacons avec 10 millilitres de DPBS. Ajoutez cinq millilitres d’un x tripsin EDTA et incubez dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Au bout de cinq minutes, neutralisez la trypsine avec 10 millilitres de milieu contenant du FBS et mettez les cellules en suspension avec des pipetages répétés. Ensuite, centrifugez la suspension à 300 fois G pendant cinq minutes. Remettez les cellules en suspension dans 15 millilitres de génération BOEC fraîche, milieu, et plaquez toute la suspension cellulaire dans une nouvelle fiole T 75 sans revêtement de collagène. Continuer.

Le milieu change jusqu’à ce que les cellules soient confluentes et de passage. Les cellules décrites précédemment pour la plaque d’emballage continué. Pas moins de 750 000 cellules par flacon T 75, car les faibles densités cellulaires peuvent entraîner l’arrêt de la prolifération des BO eecs.

Dans cette procédure, la trypsine oculaire les cellules et les centrifuge à 300 fois G pendant cinq minutes. Après cela, aspirez le snat et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu. Prélever un échantillon de 10 microlitres de la suspension cellulaire et effectuer un comptage manuel des cellules.

Ensuite, centrifugez à nouveau l’échantillon et mettez-le en suspension dans un milieu de cryoconservation glacé à deux fois 10 à six cellules par millilitre. Ajoutez 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque flacon et placez les flacons dans un récipient de cryoconservation à l’isopropanol glacé. Placez ensuite le récipient dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant de le transférer à l’azote liquide.

Pour décongeler les cellules, ajoutez 10 millilitres de milieu de préchauffage dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres. Retirez les cellules de l’azote liquide et décongelez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius en les agitant doucement jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit cristal de glace dans le flacon. Ajoutez ensuite le contenu du flacon goutte à goutte dans le tube de centrifugation conique et tournez à 300 fois G pendant cinq minutes.

Par la suite, aspirez le surnageant et suspendez la pastille cellulaire. Ajoutez la suspension cellulaire dans la fiole T 75 et complétez le fluide à 15 millilitres. Sur cette image, les colonies d’excroissance, qui apparaissent comme des collections de cellules endothéliales, sont disposées en une monocouche de pavés et prolifèrent radialement à partir d’un point central entourant les colonies d’excroissance, sont les cellules monocytaires adhérentes qui constituent la grande majorité des cellules dans les cultures précoces.

Voici une image représentative d’immunofluorescence des immunos de Bo Oecs colorés avec un anticorps contre le marqueur de surface des cellules endothéliales CD 1 44. Et dans cette image, les OEC B étaient immuno-colorés avec un anticorps contre le facteur de von Willebrand de la glycoprotéine sanguine. Une fois maîtrisée, cette technique pourrait être réalisée en moins de deux heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de traiter les échantillons de sang dès que possible et de préférence dans les deux heures suivant le prélèvement. À la suite de cette procédure, les cellules peuvent être utilisées pour étudier la fonction des cellules endothéliales dans la santé et la maladie ou reprogrammées en cellules souches puissantes induites pour une utilisation dans des études de différenciation, la modélisation de maladies ou la thérapie cellulaire après son développement. Cette technique nous a ouvert la voie à l’étude de l’impact des mutations dans le récepteur de la protéine morphogénétique osseuse de type deux sur la pathogenèse de l’hypertension artérielle pulmonaire dans les cellules endothéliales de croissance sanguine du patient et dans les cellules musculaires de l’humeur dérivées de l’IPSC.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer et de caractériser des cellules endothéliales de croissance sanguine stables à partir d’un petit volume de sang périphérique. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain non testé peut être extrêmement dangereux et qu’un équipement de protection individuelle, y compris des gants et une blouse de laboratoire, doit toujours être porté lors de cette procédure.