Isolement et compositionnelle Analyse des plantes cuticules lipidiques polyester monomères

Les plantes vasculaires s’appuient sur des couches extracellulaires qui fonctionnent comme des barrières étanches entre les tissus végétaux et l’environnement extérieur. Ces cellules lipophiles, bien que des structures associées, limitent l’infection pathogène et régulent le transport passif des gaz, de l’eau et des substances dissoutes à l’intérieur et à l’extérieur des tissus végétaux. Une barrière importante est la cuticule de la plante, une structure complexe unique aux plantes.

La cutine est un polyester lipidique glycérol insoluble qui constitue la matrice structurelle de la cuticule et est associé à des cires extractibles par solvant. Nous présentons ici une technique fiable pour doser la composition des polyesters lipidiques et maintenir les tissus végétaux lipidiques. Dans ce protocole, des échantillons de tissus entiers sont récoltés, homogénéisés et, de manière exhaustive, dilapidés par une série d’extractions par solvant pour éliminer les lipides solubles dans les solvants, y compris les cires cuticulaires et épi particulières.

Triglycérol dans les lipides membranaires. Les échantillons sont ensuite dépolymérisés en leurs monomères lipidiques constitutifs par méthyllyse catalysée par du méthoxyde de sodium. Des réactifs de simulation sont ajoutés aux groupes hydroxyles transméthylés dans leurs dérivés de cellules triméthyles correspondants adaptés à l’analyse par chromatographie en phase gazeuse.

Les résidus dérivés sont ensuite transférés dans des flacons GC et chargés dans A-G-C-M-S pour analyse, générant un chromatogramme, caractérisant la composition monomère des biopolyesters. Présent dans les échantillons extraits. Ici, nous récoltons des échantillons de feuilles entières de type sauvage et deux mutants de plantes matures d’arabidopsis ANA.

Pour l’extraction et l’analyse, ajoutez 0,5 gramme de tissu dans des tubes de verre propres qui ont été pré-rincés au chloroforme. Placez 100 millilitres d’isopropanol dans un flacon et ajoutez de l’hydroxy toluène butylé à une concentration de 0,01 %. Le BHT est un antioxydant ajouté pour protéger les doubles liaisons et les acides gras de l’oxydation lors des extractions par solvant. Préchauffez le solvant dans un bain-marie à environ 85 degrés.

Ajoutez 25 millilitres d’isopropanol chauffé par gramme de tissu végétal et incubez les échantillons dans la chaleur LOC à 85 degrés pendant 15 minutes. Laissez les tubes refroidir à température ambiante et avec une protection auditive et oculaire. Enfin, broyez les échantillons avec un homogénéisateur pour obtenir une dispersion homogène des tubes scellés avec des bouchons à vis et agitez à 100 tr/min pour un à deux échantillons de centrifugation à 800 G pendant 10 minutes.

Pour séparer la phase organique des matériaux de plus haute densité compactés dans la pastille, retirez et jetez le surnageant à l’aide d’un Pasteur ou d’un propant. Attention à ne pas déranger la pastille. Ajoutez un volume égal d’isopropanol à température ambiante et agitez les échantillons pendant la nuit.

À 100 tr/min, centrifugez les échantillons et jetez le surnageant. J’ajoute 25 millilitres d’une solution de chloroforme, de méthanol, par gramme de tissu, et je secoue les échantillons pendant la nuit en centrifugeuse et je jette la phase organique. Répétez ensuite ce processus en utilisant une à deux solutions de méthanol chloroforme.

Sécher la pastille pendant la nuit et transférer les tubes de la hotte vers un dessiccation sous vide contenant du sulfate de calcium anhydre pour déshydrater les échantillons sur une période d’au moins trois jours ou jusqu’à ce qu’une masse constante soit atteinte. Une fois complètement séchés, les échantillons sont prêts à être déflorés par métalyse catalysée par l’oxyde de sodium. Ajoutez deux solutions d’étalons internes dans des tubes contenant des tissus secs à l’aide d’une seringue en verre, en commençant par 25 microlitres de décanoate de méthyle HETO et 25 microlitres d’oméga pentec et de lactone.

Pour amorcer la polymérisation profonde, ajoutez 0,9 millilitre d’acétate de méthyle aux échantillons, suivi de 1,5 millilitre de catalyseur d’oxyde de méthamphétamine de sodium et de 3,6 millilitres de méthanol. Incuber des échantillons à 60 degrés pendant deux heures avec un vortex périodique dans le système réactionnel, les polyesters lipidiques réagissent avec les anions d’oxyde de méthamphétamine nucléophiles pour former des intermédiaires tétraédriques instables, qui se dissocient facilement en acides gras, en esters méthyliques et en anions oxydes. Ces oxydes sont des bases conjuguées et réagissent avec le méthanol en régénérant les anions IDE de méthamphétamine actifs à la chaîne, soutenant ainsi des réactions de polymérisation profondes supplémentaires.

Si de l’eau est présente dans le système, elle réagira avec l’oxyde de méthamphétamine de sodium pour former de l’hydroxyde de sodium. Une base solide qui convertit irréversiblement les polyesters en acides gras libres indésirables. Au lieu de fas pour empêcher l’hydrolyse, de l’acétate de méthyle est ajouté pour éliminer tout hydroxyde de sodium dans le système.

Laissez les tubes refroidir à température ambiante. Après l’incubation, extrayez les monomères en ajoutant 10 millilitres de dichlorure de méthylène dans chaque tube. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre d’acide glacial pour acidifier les échantillons.

Remplissez les tubes avec une solution de chlorure de sodium à 0,5 molaire, agitez à fond et centrifugez pendant quelques minutes. Sous la hotte. Transférez soigneusement la phase organique inférieure à l’aide d’une pipette dans des tubes propres et prérincés de taille moyenne.

Lavez à nouveau les échantillons avec une solution saline, un vortex et centrifugez-les pendant 10 minutes. Retirez la phase aqueuse supérieure, puis ajoutez du sulfate de sodium anhydre aux échantillons comme agent de séchage pour éliminer les traces d’eau restantes dans la centrifugeuse d’échantillons à vortex de solution, et transférez le solvant dans des tubes de petite taille pré-rincés, chargez les tubes dans un évaporateur d’azote pour évaporer le solvant et obtenez des résidus secs de monomères. À l’aide d’une seringue en verre, ajoutez 100 microlitres de purine et 100 microlitres de B-S-T-F-A pour convertir les groupes hydroxyles en dérivés volatils des cellules triméthyles.

Incuber les échantillons à 100 degrés pendant 10 minutes. Laissez les tubes refroidir et s’évaporer sous l’azote gazeux. Ajoutez 500 microlitres d’une solution individuelle de toluène HEPTANE aux résidus de dissolution rouge, qui sont ensuite brièvement centrifugés.

Transférez les échantillons dérivés dans des flacons GC contenant des inserts de 400 microlitres. Enfermez les flacons et chargez les échantillons dans un chromatographe en phase gazeuse, qui les injecte dans une colonne capillaire pour analyse, puis les éluats sont détectés par un spectromètre de masse quadruple. Les données brutes acquises par l’analyse du SMGC sont traitées et présentées sous forme de chromatogramme pour chaque échantillon.

Les monomères individuels correspondant à différents pics chromatographiques sont identifiés par leurs spectres de masse spécifiques. Dans les temps de rétention GC, les quantités de monomères individuels sont déterminées à l’aide de la méthode standard interne de quantification, ce qui permet de comparer l’abondance et la composition des monomères entre les échantillons. On voit ici des chromatogrammes superposés provenant d’analyses représentatives de monomères, libérés à partir d’un tissu foliaire d’abcès de lapin correspondant au type sauvage et de deux allèles mutants d’un gène codant pour une enzyme P quatre 50 mono oxygénase démontrant des profils monomères distincts.

Nos résultats démontrent des différences significatives, l’abondance de trois grandes plantes de cutine, de monomères et d’arabidopsis de type sauvage et mutant. Ce protocole est une méthode robuste pour doser la composition des polyesters lipidiques végétaux par isolement, identification et quantification de leurs monomères constitutifs. La procédure est évolutive et peut être facilement adaptée pour traiter des quantités massives de diverses matières végétales, y compris des racines, des graines, des feuilles et d’autres tissus entiers.

Cette technique est applicable aux études portant sur la biosynthèse, la régulation et la distribution de la cutine et de la subérine dans les plantes supérieures.