Isolement et compositionnelle Analyse des plantes cuticules lipidiques polyester monomères

Les plantes vasculaires dépendent de couches extracellulaires qui fonctionnent comme des barrières imperméables entre les tissus végétaux et le milieu extérieur. Ces structures associées aux cellules lipophiles limitent les infections pathogènes et régulent le transport passif des gaz, de l'eau et des substances dissoutes entrant et sortant des tissus végétaux. L'une des barrières importantes est la cuticule végétale, une structure complexe propre aux plantes.

La cutine est un polyester de glycérol lipidique insoluble qui constitue la matrice structurale de la cuticule et est associée à des cires extractibles par solvant. Nous présentons ici une technique fiable pour analyser la composition des polyesters lipidiques et retenir les tissus végétaux riches en lipides. Dans ce protocole, des échantillons entiers de tissus sont récoltés, homogénéisés, puis complètement décomposés par une série d'extractions au solvant afin d'éliminer les lipides solubles dans le solvant, notamment les cires cuticulaires et épicuticulaires.

Triglycérol dans les lipides membranaires. Les échantillons sont ensuite dépolymérisés en leurs monomères lipidiques constitutifs par lyse méthylique catalysée par du méthoxyde de sodium. Des réactifs de simulation sont ajoutés pour transméthyler les groupes hydroxyles en leurs dérivés triméthylsilyl correspondants, adaptés à l'analyse en chromatographie en phase gazeuse.

Les résidus dérivés sont ensuite transférés dans des vials de chromatographie en phase gazeuse et chargés dans un système GC-MS pour analyse, générant un chromatogramme permettant de caractériser la composition monomérique des biopolymères. Présents dans les échantillons extraits. Ici, nous récoltons des échantillons complets de feuilles provenant de plantes sauvages et de deux mutants d'Arabidopsis ANA matures.

Pour l'extraction et l'analyse, ajoutez 0,5 gramme de tissu dans des tubes en verre propres préalablement rincés au chloroforme. Placez 100 millilitres d'isopropanol dans un flacon et ajoutez du butylhydroxytoluène jusqu'à une concentration de 0,01 %. Le BHT est un antioxydant ajouté pour protéger les doubles liaisons et les acides gras contre l'oxydation durant les extractions par solvant. Préchauffez le solvant dans un bain-marie à environ 85 degrés.

Ajouter 25 millilitres d'isopropanol chauffé par gramme de tissu végétal et incuber les échantillons dans le bloc chauffant à 85 degrés pendant 15 minutes. Laisser les tubes refroidir à température ambiante, tout en portant une protection auditive et oculaire. Enfin, broyer les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur afin d’obtenir une dispersion homogène, sceller les tubes avec des bouchons à vis et agiter à 100 tr/min pendant une à deux minutes, puis centrifuger les échantillons à 800 ×g pendant 10 minutes.

Pour séparer la phase organique des matériaux de densité plus élevée compacts dans le culot, retirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’un propent. Veillez à ne pas perturber le culot. Ajoutez un volume équivalent d’isopropanol à température ambiante et agitez les échantillons toute la nuit.

Centrifuger les échantillons à 100 tr/min et éliminer le surnageant. J'ajoute 25 millilitres d'une solution de chloroforme-méthanol à deux pour un par gramme de tissu, puis j'agite les échantillons toute la nuit, je les centrifuge et j'élimine la phase organique. Répéter ensuite ce processus en utilisant une solution de chloroforme-méthanol à un pour deux.

Séchez le culot pendant la nuit et transférez les tubes de la hotte à une étuve sous vide contenant du sulfate de calcium anhydre afin de déshydrater les échantillons pendant au moins trois jours ou jusqu'à obtention d'une masse constante. Une fois que les échantillons sont complètement séchés, ils sont prêts pour la défloculation par méthanolyse catalysée par du méthanoxyde de sodium. Ajoutez deux solutions d'étalons internes dans les tubes contenant les tissus secs à l’aide d’une seringue en verre, en commençant par 25 microlitres de décanoate de méthyle HETO et 25 microlitres de pentadécalactone oméga.

Pour initier la polymérisation profonde, ajouter 0,9 millilitre d'acétate de méthyle aux échantillons, suivi de 1,5 millilitre de catalyseur de méthoxyde de sodium et de 3,6 millilitres de méthanol. Incuber les échantillons à 60 degrés pendant deux heures avec des vortex périodiques dans le système réactionnel ; les polyesters lipidiques réagissent avec les anions méthoxyde nucléophiles pour former des intermédiaires tétraédriques instables, qui se dissocient facilement en acides gras, esters méthyliques et anions oxyde. Ces oxydes sont des bases conjuguées et réagissent avec le méthanol pour régénérer les anions méthylate catalytiquement actifs, perpétuant ainsi des réactions supplémentaires de polymérisation profonde.

Si de l'eau est présente dans le système, elle réagira avec le méthanoate de sodium pour former de l'hydroxyde de sodium, une base forte qui convertit irréversiblement les polyesters en acides gras libres indésirables. Afin d'éviter l'hydrolyse, du méthylacétate est ajouté à la place pour éliminer tout hydroxyde de sodium présent dans le système.

Laisser les tubes refroidir à température ambiante. Après l'incubation, extraire les monomères en ajoutant 10 millilitres de dichlorométhane dans chaque tube. Puis ajouter 1,5 millilitre d'acide acétique glacial pour acidifier les échantillons.

Remplir les tubes avec une solution de chlorure de sodium 0,5 M, vortexer soigneusement et centrifuger pendant plusieurs minutes. Sous la hotte. Transférer délicatement la phase organique inférieure à l’aide d’une pipette dans des tubes propres, préalablement rincés, de taille moyenne.

Lavez à nouveau les échantillons avec une solution saline, vortexez et centrifugez pendant 10 minutes. Éliminez la phase aqueuse supérieure, puis ajoutez du sulfate de sodium anhydre aux échantillons comme agent desséchant afin d'éliminer les traces d'eau restantes dans la solution ; vortexez les échantillons, centrifugez-les, et transférez le solvant dans des tubes propres de petite taille préalablement rincés. Placez les tubes dans un évaporateur à azote pour évaporer le solvant et obtenir des résidus secs de monomères. À l’aide d’une seringue en verre, ajoutez 100 microlitres de purine et 100 microlitres de B-S-T-F-A pour convertir les groupes hydroxyles en dérivés volatils de triméthylsilyl.

Incuber les échantillons à 100 degrés pendant 10 minutes. Laisser les tubes refroidir et évaporer sous un courant d'azote. Ajouter 500 microlitres d'une solution équivalente (un pour un) de HEPTANE et de toluène pour redissoudre les résidus, puis centrifuger brièvement.

Transférez les échantillons dérivés dans des vials de chromatographie gazeuse contenant des inserts de 400 microlitres. Fermez les vials, chargez les échantillons dans un chromatographe en phase gazeuse, qui les injecte dans une colonne capillaire pour analyse ; les éluats sont ensuite détectés par un spectromètre de masse quadrupôle. Les données brutes obtenues par l'analyse GC-MS sont traitées et présentées sous forme de chromatogramme pour chaque échantillon.

Les monomères individuels correspondant à différents pics chromatographiques sont identifiés par leurs spectres de masse spécifiques. À partir des temps de rétention en chromatographie en phase gazeuse (GC), les quantités de monomères individuels sont déterminées par la méthode du standard interne, permettant des comparaisons de l'abondance et de la composition des monomères entre échantillons. Sont représentés ici des chromatogrammes superposés issus d'analyses représentatives de monomères libérés à partir d'un tissu foliaire d'abcès de lapin, correspondant au type sauvage et à deux allèles mutants d'un gène codant une enzyme monooxygénase P450, montrant des profils monomériques distincts.

Nos résultats démontrent des différences significatives, l'abondance de trois monomères majeurs de la cutine, ainsi que des plantes arabidopsis de type sauvage et mutantes. Ce protocole constitue une méthode robuste pour analyser la composition des polyesters lipidiques végétaux par l'isolement, l'identification et la quantification de leurs monomères constitutifs. La procédure est évolutive et peut être facilement adaptée pour traiter de grandes quantités de divers matériaux végétaux, notamment des racines, des graines, des feuilles et d'autres tissus entiers.

Cette technique s'applique aux études portant sur la régulation de la biosynthèse et la distribution de la cutine et de la subérine chez les plantes supérieures.