Name: Mesurer les réponses physiologiques de Drosophila Neurones sensoriels à Lipid Phéromones Utilisation en direct dimagerie de calcium (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Apprenez à mesurer les réponses physiologiques des neurones gustatifs de Drosophila aux phéromones lipidiques par imagerie calcique in vivo. Cette méthode permet d'étudier l'activité neuronale individuelle chez l'animal intact.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de la recherche de Singapour (subvention NRF-RF2010-06 à J.Y.Y.).

Préparation 1. Echantillon <ol><li> Franchir la ligne Gal4 3,22 pilote pour UAS-GCaMP5G 19 mouches (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Laisser la croix de croître à 25 ° C. Note: Génération vole avec plusieurs copies des transgènes Gal4 ou UAS-GCaMP peut aider à améliorer l&#39;intensité du signal fluorescent. Une version antérieure du transgène UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) a montré très faible intensité de fluorescence lorsqu&#39;elle est exprimée sous le contrôle du pilote Gr68a-Gal4. <ol><li> Recueillir et séparés par sexe nouvellement éclos mouches adultes et d&#39;élever à 25 ° C. Remarque: Le niveau de GCaMP5G florescence de base est optimale dans les mouches âgés de 14-28 jours. Isoler mouches par sexe exclut la possibilité d&#39;interactions sociales qui peuvent influer sur les réponses neuronales. </li></ol></li><li> Anesthetize une mouche sous un courant doux de CO 2. </li><li> Fixer le fly à une lamelle de verre en plaçant d&#39;abord une petite goutte de vernis à ongles dans le centre d&#39;un 0,17 mm lamelle. Placez délicatement une mouche sur son côté sur la goutte de vernis à ongles transparent et veiller à ce que toute la baisse est couvert par la mouche. </li><li> Effectuer les étapes 1.5 et 1.6 sous un stéréomicroscope disséquant, utilisé à un grossissement de 8x. </li><li> Utilisez un pinceau humide pour étendre une patte de la mouche. Fixer la patte en position en plaçant deux bandes minces de ruban adhésif sur les premier et cinquième segments du tarse (figure 2A). Cela permettra d&#39; exposer les segments du tarse T2-T4 pour l&#39; imagerie (figure 2B). </li><li> Pour les neurones d&#39;image sur la trompe, placez une mince bande de ruban adhésif sur la tribune de la trompe pour exposer le labelle (figure 2C, D). </li><li> Tracez une barrière hydrophobe autour de la mouche avec un stylo PAP pour empêcher la solution de circuler sur la surface de la lamelle. Faire des mesures dans les 30 min de montage. </li></ol> 2. Préparation de stimulationSolution <ol><li> Diluer les ligands lipophiles (tels que CH503, utilisé dans cette étude) dans une solution de PBST: NaCl 137 mM, KCl 2,7, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, 0,1% de Triton X-100 (v / v ); pH 7,4. <ol><li> Faire un ml de solution 1 mg / stock du ligand en utilisant PBST. Préparer toutes les dilutions ultérieures de la solution mère en utilisant PBST. Remarque: En fonction de la solubilité du ligand d&#39;intérêt, des solvants différents peuvent être nécessaires pour dissoudre le ligand. La solubilité de l&#39; CH503 dans divers solvants est décrite dans le tableau 1. Contrairement à d&#39; autres solvants, PBST n&#39;a pas produit une augmentation de la fluorescence. </li></ol></li></ol> 3. Stimulation de Gustative Neurones et l&#39;acquisition d&#39;images <ol><li> En utilisant une pipette de 10 ul, placer 10 ul de PBST sur les segments du tarse. Remarque: Cette étape humidifie la jambe et empêche les segments du tarse à la dérive. </li><li> Utiliser un système optique qui comporte une caméra de sula vitesse et la sensibilité FFICIENT pour atteindre un bon signal de fluorescence à haute résolution temporelle. Note: Pour cette étude , nous avons utilisé un microscope confocal à disque tournant et une caméra sCMOS (voir la liste des matériaux). </li><li> Choisissez le segment et les neurones tarse spécifiques à imager. Acquérir trois pré-stimulation confocale Z-piles. <ol><li> Idéalement, les paramètres d&#39;acquisition de l&#39;utilisation que sont assez rapides pour permettre une résolution temporelle maximale tout en capturant le volume de la cellule entière. Paramètres d&#39;acquisition de l&#39; exemple sont les suivants : 200 msec exposition, binning 2 x 2 et 6 x 0,5 um 2 sections optiques, capturées toutes les 2 secondes. Remarque: les jambes immobilisées ont été imagées avec succès jusqu&#39;à 10 min, à intervalles de 30 s, sans blanchiment perceptible du signal GCaMP. Pour de plus longues durées d&#39;enregistrement, veiller à ce que les jambes sont maintenus fermement en place sur la lamelle. </li><li> Optimiser la puissance du laser pour le plus haut rapport signal sur bruit réalisable avec photoblanchiment minimale pendant toute la durée imaging régime. Pour les expériences décrites ici, utiliser un 491 nm diode laser (100 mW) à l&#39;émission de 30% pour l&#39;imagerie deux neurones Gr68a et ppk23 gustatifs sur les jambes et proboscis. Utilisez 2 x 2 binning pour permettre la réduction des temps d&#39;exposition tout en obtenant une résolution spatiale suffisante. Remarque: Les réglages de puissance laser ont été optimisés pour permettre la détection du changement fluorescent allant d&#39;une augmentation de 1,2 à 4,5 fois. </li></ol></li><li> Pipette 10 pl de la solution de relance sur les segments du tarse. Pour les expériences de contrôle, ajouter un autre 10 pi de PBST. Immédiatement acquérir 117 images post-stimulation. Remarque: Le nombre d&#39;images post-stimulation acquises est basée sur la quantité de temps dans lequel le changement maximal de la fluorescence a été atteint (environ 2 min). <ol><li> ÉTAPE CRITIQUE: Alors que pipetage solution sur la préparation, ne pas toucher à la volée avec la pointe de la pipette car dans ce cas la patte avant de se déplacer hors de position. Remarque: Vous pouvez également utiliserun micromanipulateur pour positionner avec précision un capillaire en verre contenant du stimulus à proximité du tarsal à imager. Livrer des volumes contrôlés de stimulus en utilisant un distributeur microinjection intracellulaire selon les instructions du fabricant. </li></ol></li></ol> 4. Traitement de l&#39;image et de l&#39;analyse: Quantification de la réponse <ol><li> Ouvrez une série de Z-piles confocale en utilisant Fidji ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 ou ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) analyse et de traitement d&#39; image 24 logiciels. </li><li> Faire une projection d&#39;intensité somme des six tranches Z pour chacun des 120 points temporels. <ol><li> Sélectionnez l&#39;option &quot;Stack&quot; sous &quot;Image&quot;. De plus, sélectionnez l&#39;option &quot;Z de projection&quot; et entrez &quot;1&quot; comme la tranche de début et &quot;4&quot; comme arrêt tranche. Pour le type de projection, sélectionnez R20; somme des tranches &quot;dans le menu déroulant, et choisissez&quot; Tous les délais &quot;. </li></ol></li><li> Définir la région d&#39;intérêt (ROI) en utilisant l&#39;outil de sélection à main levée pour dessiner une frontière autour d&#39;un corps cellulaire ou une projection neuronale. Cliquez sur l&#39;étiquette &quot;Analyser&quot; et sélectionnez l&#39;option «gestionnaire de ROI&quot; dans &quot;Outils&quot;. </li><li> Quantifier la fluorescence du ROI en sélectionnant l&#39;option &quot;Set mesures&quot;, dans le menu &quot;Analyser&quot; et de vérifier les boîtes pour la densité intégrée, zone, moyenne et valeur de gris maximale et étiquette. Ensuite, sélectionnez l&#39;option &quot;Plus&quot; dans le menu du gestionnaire de ROI, et sélectionnez encore l&#39;option &quot;Multi mesure&quot;. Remarque: Cela va générer une boîte de pop-up avec des valeurs pour chacun des paramètres sélectionnés. </li><li> Vérifiez les valeurs de gris maximales pour veiller à ce qu&#39;aucun des pixels ont atteint la saturation (par exemple, 65535 pour une caméra 16 bits). NOTE: Pour les expériences montré en tses papiers, les réponses ont été mesurées soit par des organismes cellulaires ou des projections neuronales, selon l&#39;endroit où on a observé l&#39;augmentation maximale AF / F. </li><li> Calculer la variation relative maximale de la fluorescence (AF / F) au moment t est la suivante: <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Fond Soustraire fluorescence de chaque F (cellulaire) valeur. Pour quantifier la fluorescence de fond, mesurer la densité intégrée d&#39;un retour sur investissement de taille et de forme équivalente d&#39;une zone de la patte avant (ou proboscis) dépourvue de neurones détectables. </li><li> Pour quantifier la fluorescence post-stimulation, F (cellule) t, mesurer la densité intégrée du ROI du corps ou d&#39;un processus cellulaire à point de temps «t» après stimulation. </li><li> Pour quantifier la fluorescence pré-stimulation, F (cellulaire) t = 0, l&#39; analyse des images de pré-stimulation de l&#39;organisme ou d&#39;un processus cellulaire de la même manière quele signal post-stimulation. Utilisez la densité intégrée moyenne de 3 images pour déterminer F (cellule) t = 0. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l&#39; imagerie calcique en direct des neurones périphériques drosophile dans 2 organes sensoriels différents. Ca2 + -evoked GCaMP réponses fluorescentes dans Gr68a-neurones induite par le ligand de phéromone CH503 étaient dose-dépendante et quantitative. Il était également possible de discerner différents modèles tels que phasique et réponses toniques réponse neurale. Neurones montrant les réponses phasiques sont censées perm...

Les animaux comptent sur l&#39;information olfactive et gustative à la médiation des décisions essentielles pour la survie et la reproduction. Comprendre comment les indices chemosensory sont détectées et traitées par le système nerveux exige l&#39; identification du récepteur (s) sensoriel et les ligands chimiques correspondants. Drosophila détecter une variété stupéfiante de composés volatiles et non-volatiles et sont un excellent modèle pour étudier l&#39; état ​​physiologique mécanismes sous-jacents chemosensation. Alors que les organes olfactifs perçoivent des molécules volatiles, les organes gustatifs sont spécialisés pour détecter des composés à faible volatilité. Ici, nous présentons une méthode pour mesurer directement les réponses neuronales des organes du goût de Drosophila melanogaster à faible volatilité, les ligands lipophiles. organes gustatifs de la mouche comprennent les pattes antérieures, proboscis et les ailes. Distribué à la surface des organes de goût sont des structures ressemblant à des cheveux appelés sensilles qui répondent aux sugars, bitters, les sels, l&#39; eau et les phéromones 8. Le sensilles ont été classés morphologiquement en poils de goût et le goût des pegs 9. Il y a environ 31 poils de goût sur le labelle qui sont classés dans le (type l) de long, court (type s) et (de type i) morphologies intermédiaires. Sensilla maison 4 neurones sensoriels «L» et «s qui répondent physiologiquement à sucre (la cellule S), faible teneur en sel (la cellule L1), en sel et des composés amers (la cellule L2) et de l&#39; eau (la cellule W) 10 , 11. Les «i» maison 2 neurones sensilles sensoriels, dont répond à la fois à faible teneur en sel et de sucre, tandis que l&#39;autre répond à haute teneur en sel 12. Il y a environ 41 goût sensilles chez les hommes et 26 sensilles chez les femelles répartis sur chacune des pattes. Pour les deux hommes et les femmes, il y a 21 sensilles sur le midleg, et environ 22 sensilles sur la patte arrière 13. Les neurones gustatifs clos par le sensilles du goût sur les jambes sont aussi classified en types L1, L2, W et S. Une méthode standard pour mesurer l&#39;activité électrique de neurones isolés utilise des électrodes extracellulaires ou intracellulaires pour enregistrer le flux d&#39;ions. Mesures d&#39;électrodes permettent la fonction neuronale à étudier dans les organismes non-modèles tels que les espèces de drosophile, les papillons et les abeilles qui manquent des outils génétiques étendus pour l&#39; étiquetage neural. Cependant, alors que les méthodes électrophysiologiques ont été couramment utilisés pour mesurer l&#39; activité de Drosophila goût sensilla 4,13,14, en appliquant cette approche présente plusieurs défis techniques. Tout d&#39;abord, le goût des poils doivent être identifiés sur la base de la morphologie et la localisation spatiale. Après identification, les mesures électrophysiologiques peuvent être entravées par la petite taille de l&#39;sensilla, l&#39;accessibilité limitée en raison de la position, et la difficulté à appliquer des volumes contrôlés d&#39;un stimulus chimique à un goût de poils. En outre, la stimulation de sensilles peut générer des signaux de plus d&#39;unneuronal de type 15. Deuxièmement, la détection de signaux électriques peut être confondu par le bruit de fond résultant des vibrations mécaniques et le bruit des équipements électroniques. Troisièmement, l&#39;utilisation d&#39;une électrode affûtée peut endommager la préparation du vol, si elle est utilisée de façon incorrecte 14. Enfin, l&#39;assemblage d&#39;un appareil de électrophysiologie nécessite des composants électroniques spécialisés pour la livraison de relance, l&#39;enregistrement du signal, et l&#39;analyse de données et peut être coûteux. Dans D. melanogaster, la disponibilité des outils génétiquement encodés a facilité le développement des techniques d&#39;imagerie qui permettent les réponses des petites populations de neurones à étudier. Une telle approche est l&#39;utilisation de la journaliste CaLexA 16. Dans ce procédé, les séquences de gènes codant pour le facteur de transcription VP16-LexA et une protéine sensible NFAT de calcium sont fondus ensemble. l&#39;activation de calcium de la calcineurine protéine phosphatase de catalyse la phosphorylation de NFAT et, à son tour, facitES son importation dans le noyau. A l&#39;intérieur du noyau, le domaine LexA se lie à un motif de liaison LexAop-ADN qui dirige l&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente (GFP) reporteur verte, permettant ainsi l&#39;identification durable de neurones fonctionnellement activés. L&#39;approche a été utilisée avec succès pour mesurer la réponse des glomérules olfactifs spécifique dans le lobe antennaire après une exposition de mouches vivantes à un odorant 16. Récemment, les réponses physiologiques des neurones récepteurs gustatifs de IR52c ont été mesurées à partir de mouches en direct en utilisant CaLexA 7. Cependant, pour cette étude, il était nécessaire de vol d&#39;âge jusqu&#39;à 6 semaines pour améliorer la GFP transcription. Bien que immunocoloration avec un anticorps anti-GFP peut être utilisé pour amplifier le signal CaLexA, cette méthode nécessiterait la fixation des tissus, excluant ainsi la possibilité pour l&#39;imagerie des cellules vivantes. Calcium protéine indicatrice GCaMP codé génétiquement a également été largement utilisée pour étudier les réponses neuronales dans un certain nombre d&#39;17 espèces. La GCaMP protéine fluoresce avec une faible intensité avant la stimulation neuronale. Application d&#39;un stimulus déclenche un potentiel d&#39;action dans les neurones, ce qui entraîne l&#39;influx de Ca 2+. GCaMP, liés au Ca 2+, subit un changement de conformation, ce qui provoque la fluorescence avec une intensité plus claire (figure 1). Un seul neurone approche d&#39;imagerie de calcium récemment mis au point a été utilisé pour identifier le glucose comme ligand pour les neurones gustatifs de patte spécifiques Gr61a 18. Dans cette étude, les pattes antérieures disséqués à partir de Drosophila exprimant GCaMP transgénique dans les neurones gustatifs Gr61a ont été recouvertes d&#39;une couche d&#39;agarose avant la formation d&#39; image. Cependant, l&#39;utilisation de tissus disséqués peut causer une éventuelle diminution de l&#39;expression GCaMP, limitant ainsi le temps de mesure et de la sensibilité de détection. En outre, l&#39;agarose peut limiter la sensibilité en raison de niveaux de fond élevés de fluorescence et de ses propriétés de diffusion de la lumière. To résoudre certains de ces inconvénients, nous décrivons l&#39;utilisation de l&#39;imagerie calcique GCaMP médiation pour enregistrer les réponses physiologiques de patte et proboscis neurones gustatifs des animaux intacts. On montre les réponses physiologiques de Gr68a et les neurones exprimant ppk23 codés génétiquement GCaMP5G 19 à un lipide phéromone chez la drosophile, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acétoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. les réponses neuronales sont mesurées par la quantification de l&#39;augmentation de la fluorescence du signal GCaMP5G lors de la stimulation de la phéromone. Dans ce protocole, les neurones sont imagées pour une durée totale de 120 secondes, ce qui est suffisant pour différencier les modes d&#39;activation neuronale dans des cellules individuelles.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Cadeau de H. Amrein (Texas A& M Health Science Center, TX, États-Unis) et J. Carlson (Université de Yale, CT, États-Unis)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Don de K. Scott (Univ. de Californie, Berkeley, CA, États-Unis)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&nbsp ;</td><td></td><td>42037</td><td>Drosophile de Bloomington&nbsp ; Couverture centrale de</td></tr><tr><td>0,17 mm (lamelle Gold-Seal)</td><td>Services de microscopie électronique</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles, « Dur comme des ongles clairs"&nbsp ;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stylo PAP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>Z377821</tr><tr><td>Pinceau</td><td></td><td></td><td>pinceau à pointe fine</td></tr><tr><td>Ruban adhésif&nbsp ;</td>Marque <td></td><td></td><td>Scotch</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, qualité laboratoire</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, qualité HPLC</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>472301</tr><tr>Recette<td>PBST</td><td></td><td></td><td>décrite dans la section</td></tr><tr><td>du protocole CH503</td><td></td><td></td><td>Synthesis décrite dans Mori et al., 2010</td></tr><tr><td>Caméra sCMOS (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&nbsp ;</td><td>Microscope C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>(Ti-Eclipse)</td><td>Tête</td> de balayage à disque rotatif <td>Nikon Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td></tr></tbody></table>

mesurer les réponses physiologiques de<em&gt; drosophila</em&gt; neurones sensoriels à lipid phéromones utilisation en direct d&#39;imagerie de calcium

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Contrairement aux mammifères, les insectes tels que la drosophile ont plusieurs organes de goût. Les neurones chimiosensorielles sur les jambes, les proboscidiens, les ailes et tarière de Drosophila expriment des récepteurs gustatifs 1,2, canaux ioniques 3-6, et les récepteurs ionotropiques 7 qui sont impliqués dans la détection des signaux sensoriels volatiles et non-volatiles. Ces neurones contacter directement tastants tels que la nourriture, les substances et les phéromones nocives et influencent donc beaucoup de comportements complexes tels que l&#39;alimentation, la ponte et l&#39;accouplement. enregistrements d&#39;électrodes et de l&#39;imagerie de calcium ont été largement utilisés dans les insectes pour quantifier les réponses neuronales évoquées par ces sapides. Cependant, l&#39;électrophysiologie nécessite un équipement spécialisé et des mesures d&#39;obtention d&#39;un seul sensille goût peut être techniquement difficile en fonction du type cellulaire, la taille et la position. En outre, la résolution de neurone unique chez la drosophile peut être difficile à atteindre puisque le goût sensilla houSE plus d&#39;un type de neurone chémosensoriel. Procédé d&#39;imagerie en temps réel de calcium décrite ici permet aux réponses des neurones gustatifs simples dans les mouches vivantes à mesurer. Ce procédé est particulièrement adapté pour imager les réponses neuronales aux phéromones lipides et d&#39;autres types de ligands qui ont une faible solubilité dans les solvants à base d&#39;eau.

L&#39;indicateur de calcium GCaMP a été génétiquement exprimé en utilisant Gr68a-Gal4 ou pilote ppk23-Gal4. Populations distinctes de neurones et les cellules de patte support non-neuronales sont marqués par chaque pilote (figure 3A-C). Réponses spécifiques Ligand à la phéromone CH503 lipophile ont été observées dans Gr68a-Gal4 et les cellules ppk23-Gal4 exprimant GCaMP (Figure 3D). La variation relative de l&#39;intensité de fluorescence du signal GC...

Les pattes antérieures et la trompe de la drosophile contiennent un riche répertoire de neurones sensoriels gustatifs. Ici, nous présentons une méthode utilisant l’imagerie calcique pour mesurer les réponses physiologiques des neurones sensoriels de la patte antérieure et du proboscis de mouches vivantes lors de l’application exogène d’une phéromone gustative.

Mesurer les réponses physiologiques de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones sensoriels à Lipid Phéromones Utilisation en direct d&#39;imagerie de calcium

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les réponses physiologiques des neurones gustatifs de Drosophila aux phéromones lipidiques. Cette technique peut être utilisée pour répondre à des questions clés en neurobiologie sensorielle, comme l'identification des ligands pour les récepteurs gustatifs orphelins. Le principal avantage de cette technique est que les réponses de neurones gustatifs individuels peuvent être étudiées chez un animal vivant et intact.Après avoir anesthésié la mouche, fixez-la sur un coverslip de 0,17 millimètre à l'aide d'une très petite goutte de vernis à ongles transparent. Appliquez toute la goutte sur le côté de la mouche pour la fixer à la lame. Ensuite, au microscope stéréoscopique, utilisez un pinceau humide pour étendre une patte antérieure de la mouche.Ensuite, à l’aide de deux bandes très fines de ruban adhésif, fixez le premier et le cinquième segment tarsien sur la lamelle. Si l’on souhaite observer les neurones du proboscis, placez une autre bande fine de ruban adhésif sur le rostre du proboscis afin d’exposer le labellum. Maintenant, tracez un petit rebord autour de la drosophile à l’aide d’un stylo PAP.Laisser l'anesthésie se dissiper

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Mesurer les réponses physiologiques de Drosophila Neurones sensoriels à Lipid Phéromones Utilisation en direct dimagerie de calcium (Vidéo) | JoVE Journal

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