Haute résolution La quantification du comportement Odor-guidée dans Drosophila melanogaster Utilisation de la Flywalk Paradigm

L’objectif global de cet essai biologique comportemental est d’étudier le comportement guidé par les odeurs chez les mouches du vinaigre. Fly Walk est un système à haut débit qui suit et analyse automatiquement les réponses comportementales de plusieurs mouches individuelles aux stimuli olfactifs. Cette nouvelle technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’olfaction des insectes.

Par exemple, qu’est-ce que l’équilibre hédonique d’une odeur, ou que signifie l’ajout d’odorisants supplémentaires à cet équilibre ? Le principal avantage de cette expérience est que nous pouvons guider le comportement des odeurs en haute résolution temporaire, et nous utilisons des stimuli olfactifs similaires à ceux que les insectes ressentent dans la nature ou à ceux que nous utilisons également dans les enregistrements électrophysiologiques. En général, les personnes qui essaient d’utiliser cette méthode peuvent avoir des difficultés parce qu’il faut vraiment un système étanche à l’air, vous devez donc savoir où l’air passe et vous devez être sûr qu’il n’y a pas de fuites du tout où l’air peut quitter le système I Pour ces expériences, il est important d’élever les mouches sous un cycle d’obscurité de 12 à 12 lumières dans des cultures basses à trimères contenant un milieu alimentaire normal.

Maintenez la température ambiante entre 23 et 25 degrés Celsius et l’humidité relative doit être d’environ 70 % en préparation. À l’aide de grands flacons de culture, on a fait 20 à 30 adultes pendant une semaine et j’ai recueilli des groupes de 30 à 40 descendants de sexe mixte pour former une cohorte expérimentale. Lorsqu’une cohorte a de deux à quatre jours, transférez-la dans un nouveau flacon contenant un bouchon de mousse humide ou un papier de soie humide.

Laissez les mouches mourir de faim dans ce flacon pendant 24 heures avant le test. Il est essentiel que les mouches ne soient pas anesthésiées lors de ce transfert. Pour cette configuration, des bouteilles de 250 millilitres servent d’humidificateurs.

Remplissez chaque bouteille avec 100 millilitres d’eau distillée. Ensuite, préparez des stocks de travail d’un demi-millilitre de chaque odorisant en une dilution de 1000 des odeurs pures et de l’huile minérale. De même, préparez un tube PCR avec uniquement de l’huile minérale pour servir de contrôle négatif.

Préparez maintenant le système de diffusion des odeurs pour chaque odorant. Dans l’expérience. Connectez deux clapets anti-retour à bille à chaque flacon d’odeur.

Assurez-vous de connecter les flacons d’odeur dans le bon sens d’écoulement. Une mauvaise connexion compromettra non seulement l’expérience prévue, mais elle peut également contaminer le système de livraison. Ensuite, vérifiez que le système ne présente pas de fuites.

Tout d’abord, scellez la sortie de la chambre de mélange. Vérifiez ensuite que tout le flux d’air avant que le dispositif de stimulation ne tombe à zéro. S’il y a des fuites dans le système, écoutez-les.

Ils peuvent généralement être résolus en remplaçant les joints en caoutchouc au niveau des connexions cruciales ou en échangeant des tubes en téflon. Pour la première étape de cette procédure, il est important de briser le verre, alors mettez un équipement de protection. Transférez avec précaution 15 mouches d’essai individuelles dans les différents tubes en verre À l’aide d’un aspirateur, fermez les tubes en verre des deux côtés à l’aide des adaptateurs correspondants, ils doivent être très bien ajustés.

Ensuite, connectez les tubes de verre chargés à la mise en place de la marche anti-mouches. Une fois que tous les tubes sont attachés, laissez les mouches s’habituer au nouvel environnement pendant au moins 15 minutes avant de commencer l’expérience. Allumez maintenant la source lumineuse.

Assurez-vous de fournir suffisamment de lumière pour un suivi efficace sans augmenter la température à l’intérieur des tubes de verre. Les flacons d’odeur doivent tous être connectés à ce stade pour créer un système fermé. La période d’habituation repose sur un système fermé sans fuites, de sorte que le flux d’air à travers les tubes est à la même vitesse que pendant les périodes de test.

Vérifiez le débit d’air sur l’ordinateur, connectez-le aux débitmètres numériques. Le nombre total de débits d’air sortant du système doit être égal au débit d’air entrant dans le système. Si ce n’est pas le cas, il y a une fuite.

La fuite affectera le flux d’air dans tous les tubes, mais le tube problématique est généralement celui qui affiche la plus grande baisse de flux d’air. Si une nouvelle fuite est identifiée, elle est généralement causée par un tube de verre qui s’est brisé à l’intérieur de l’adaptateur, ou elle est causée par des éclats de verre à l’intérieur des adaptateurs provenant d’expériences précédentes. Au cours de ce processus, assurez-vous que l’humidité de l’air sortant du système se situe entre 60 et 80 %Une fois que les mouches se sont acclimatées à leurs tubes, l’expérience peut être exécutée.

En principe, n’importe quelle séquence d’odeurs peut être présentée jusqu’à présent. Les meilleurs résultats peuvent être obtenus en randomisant les stimuli et en les séparant d’au moins 90 secondes. Au total.

Présentez chaque odeur 40 fois par impulsions de 500 millisecondes. Ensuite, configurez une région d’intérêt en faisant glisser une image sur la zone à surveiller. Incluez les 15 tubes de verre dans le cadre, mais excluez les cinq millimètres extérieurs des extrémités des tubes.

L’étape suivante consiste à désactiver le logiciel de suivi et à apporter des modifications au script. Cela changera la position de l’axe Y des 14 lignes parallèles qui séparent les tubes individuels. Lorsque le logiciel de suivi est de nouveau en marche, une seule mouche doit être présente entre deux lignes.

Ensuite, assurez-vous que les paramètres de la caméra sont réglés de manière à ce que les mouches soient suivies de manière fiable dans les tubes de verre. Si les mouches se perdent sur les bords de la région d’intérêt, augmentez la luminosité ou le gain du logiciel de suivi. Maintenant que le système est entièrement préparé, démarrez le protocole de stimulus.

Enregistrez les positions des mouches à une vitesse de 20 images par seconde et enregistrez ces positions de coordonnées en combinaison avec l’état de la vanne d’odeur dans des fichiers texte. Parce que l’expérience est très sensible aux odeurs, un nettoyage régulier est nécessaire pour nettoyer les tubes en verre, les tremper dans un détergent, puis les rincer à l’eau distillée courante. Après le rinçage, séchez les tubes sous pression, puis chauffez-les à 200 degrés Celsius pendant huit heures.

Pour nettoyer d’abord le système de diffusion des odeurs, retirez tous les flacons et les tubes d’odeurs de la chambre de mélange centrale. Retirez ensuite les adaptateurs de tube de la chambre de mélange. Nettoyez la chambre de mélange vidée en la rinçant avec un solvant sous une hotte comme les tubes.

Séchez la chambre de mélange à l’aide d’air comprimé et chauffez-la à 200 degrés Celsius pendant huit heures. Pour nettoyer les flacons d’odeurs et les vannes, retirez les bouchons en acier, jetez les joints en caoutchouc et retirez les clapets anti-retour, les clapets anti-retour de savon et l’éthanol, ainsi que d’autres composants de l’éthanol et de l’acétone. Ensuite, sonicez les composants trempés pendant 30 minutes au réglage maximum et rincez-les à l’eau distillée.

Comme précédemment, utilisez de l’air sous pression pour le séchage et chauffez les composants à 200 degrés Celsius pendant huit heures. Lorsqu’il s’agit d’acétone dans le sens du flux d’air, car l’acétone attaque les pièces en caoutchouc, séchez immédiatement chaque clapet anti-retour rincé avec de l’air sous pression pour éliminer toutes les odeurs résiduelles des clapets anti-retour rincés. Pulsez de l’air à travers eux pendant plusieurs jours, installez-les dans un incubateur à 60 degrés Celsius avec un flux d’air pulsé à intervalles d’une seconde.

15 mouches femelles affamées ont été exposées au butyrate d’éthyle. La barre jaune représente l’impulsion de l’odeur. Les carrés bleus représentent le mouvement au près dans un laps de temps de 100 millisecondes.

Les carrés rouges correspondants représentent le mouvement sous le vent. Les mêmes mouches ont également montré un mouvement vers le haut en réponse à la stimulation avec de l’acétate d’isop pentyle, de l’acétate d’éthyle ou deux trois butane d en moyenne par rapport à la population. La réponse de la mouche à l’acétate d’éthyle avait un début brusque, une amplitude élevée et une courte durée.

En revanche, la réponse à deux Dion au butane trois avait un début moyen plus tardif, une amplitude plus faible et une durée plus longue. En fin de compte, les données de chaque odorisant ont été résolues de cette manière, puis analysées plus en détail pour montrer que les quatre odeurs ont provoqué un déplacement au près plus élevé en quatre secondes que le solvant. De plus, en ouvrant les flacons d’odorisant, les mouches ont été exposées de manière synchrone à tous les mélanges possibles.

Après avoir stimulé les mouches avec les quatre odeurs individuelles, les stimulations avec des mélanges des quatre odeurs étaient toutes au moins aussi attrayantes que le composé unique le plus attrayant du mélange. Une fois maître, vous pouvez exécuter cette expérience en une heure, puis elle dure huit heures et déjà 30 minutes plus tard, vous pouvez visualiser vos premiers résultats. Cette méthode permet donc vraiment d’obtenir des données de nombreuses mouches en peu de temps avec une haute résolution temporaire.

Mais attention. Cette expérience nécessite un nettoyage approfondi entre les expériences. Si votre système est toujours contaminé par les fourmis de la dernière expérience, vous pouvez oublier vos résultats dans la marche des mouches.

Vous pouvez bien sûr, également tester des mouches génétiquement modifiées avec lesquelles vous pouvez étudier l’impact des circuits neuronaux individuels ou d’usine sur le comportement guidé par OD. Après le développement de cette nouvelle technique, cela nous a ouvert la voie pour faire des recherches dans ce domaine, la faction des insectes, pour comprendre le codage de ces odeurs dans le cerveau de l’insecte. Et surtout, l’utilisation du même type de stimulation pour le comportement dans la marche des mouches et pour l’expérience physiologique signifie que nous pouvons vraiment comparer ces deux paradigmes expérimentaux différents.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’établir la marche des mouches, et vous devriez être en mesure d’établir cette expérience sur vos propres genoux et de commencer bientôt vos propres expériences à haut débit sur l’affection des insectes. Mais n’oubliez pas que travailler avec de la verrerie et des produits chimiques peut être extrêmement dangereux, alors portez toujours une blouse de laboratoire. Utilisez des lunettes de protection et des gants.