Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut /

L’objectif global de ce travail est de fournir une méthode fiable, précise, peu coûteuse et rapide pour tester l’efficacité du silençage médié par l’ARNi des gènes de synthèse de l’aflatoxine de l’aspergillus dans l’arachide transgénique en utilisant un nombre minimum de graines, généralement des centaines de grammes de graines sont nécessaires pour quantifier efficacement les aflatoxines dans les échantillons. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise moins de cinq graines pour tester un traitement particulier 10 jours avant la préparation des graines, mettre en place une culture d’aflatoxine positive aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 dans un milieu de tarière ZAP Pex. Cultivez cette culture à 25 degrés Celsius.

Il sera utilisé pour l’inoculation des graines. Après avoir préparé les plantes transgéniques exprimant l’ARN, qui est détaillé dans le protocole de texte, procédez à la récolte de leurs graines. Tout d’abord, retirez la carpe périque à l’aide de l’abrasion d’un nettoyeur haute pression réglé à basse pression, ou grattez la carpe périque à la main.

Une fois la péricarpe retirée, identifiez la couleur de la mésocarpe en plaçant les gousses sur une planche de maturité dans les groupes appropriés. Retirez maintenant les trous et traitez les graines jaunes et brunes séparément. Calculez le nombre de graines nécessaires pour l’expérience au moins trois graines, ce qui signifie que trois moitiés de co-plombine sont nécessaires par ligne d’arachide échantillonnée.

Couvrez le fond d’un bécher stérile avec une couche de graines, puis couvrez simplement les graines avec un volume mesuré de 75 % d’éthanol. Ensuite, doublez ce volume. Laissez les graines incuber en solution pendant 30 secondes, puis rincez-les à l’eau distillée stérilisée.

Ensuite, traitez les graines avec un volume de 2 % d’hypochlorite comme fait avec l’éthanol F. Laissez cette incubation se poursuivre pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez trois rinçages dans des volumes quintuples d’eau distillée stérilisée.

Pour éliminer l’hypochlorite, il est essentiel que toute la solution d’hypochlorite soit lavée au cours de cette étape. Les graines sont maintenant stérilisées en surface. Ensuite, hydratez les graines en les immergeant dans de l’eau distillée stérilisée pendant deux heures préparées pour mettre les graines hydratées sur une boîte de Pétri stérile.

Tous les matériaux doivent être stérilisés à ce stade. Retirez les téguments à l’aide d’une pince, puis séparez le cohaïne. Enfin, retirez les embryons à l’aide d’un scalpel.

Les embryons peuvent être jetés ou utilisés pour régénérer de nouvelles plantes. Ensuite, coupez l’oléine en deux avec un scalpel et immergez les moitiés et l’eau distillée stérilisée jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’inoculation. Ensuite, épongez l’excès d’eau de la moitié du plomb sur du papier absorbant stérile et placez les morceaux de graines dans des plaques de vis séparées à 1,5 % avec des divots de la taille des graines et rentrez-y les graines avec le côté coupé vers le haut pour inoculer les moitiés de plomb de co.

Ajoutez deux microlitres d’une suspension de 10 000 spores d’aspergillus par microlitre sur les surfaces coupées. Ne laissez pas la suspension couler sur les côtés de la moitié de la graine. Enfin, placez la vaisselle dans un incubateur sombre à 30 degrés Celsius pendant un à quatre jours jusqu’à ce qu’elle soit testée.

Après un jour, après deux jours et après trois ou quatre jours, échantillonnez les graines, retirez délicatement les moitiés inoculées sélectionnées au hasard au besoin. Utilisez un mouchoir pour essuyer l’excès de spores et une tarière et placez l’échantillon dans un flacon à bouchon à vis en verre. Transférez les échantillons non inoculés dans des tubes de deux millilitres pour l’analyse R-T-P-C-R.

Libérez les échantillons dans de l’azote liquide et conservez les échantillons congelés dans un congélateur jusqu’à ce qu’ils soient traités. Pour l’analyse de l’aflatoxine, obtenez la demi-plombine de cochon inoculée dans un flacon à bouchon à vis en verre de quatre millilitres si nécessaire. L’échantillon sera stable pendant de nombreux mois à moins 80 degrés Celsius.

Lorsque les graines sont à température ambiante, extrayez l’échantillon en ajoutant quatre volumes de méthanol et laissez les tubes incuber toute la nuit dans l’obscurité à température ambiante sans agitation. Le lendemain, effectuez d’abord l’UPLC, préparez une mini-colonne de propylène de 1,5 millilitre avec une fritte assortie. Ajoutez ensuite 200 milligrammes d’oxyde d’aluminium.

Et ensuite, insérez une autre fritte. Position suivante, flacon d’échantillonneur automatique A-U-P-L-C sous et en contact avec la mini-colonne pour minimiser l’évaporation. Ajoutez maintenant 0,5 millilitre d’extrait de méthanol de l’échantillon dans un verre jetable deux fois pas en plastique.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitre d’acéto nitrile dans le tube et mélangez les solutions à l’aide d’une pipette. Appliquez maintenant 0,5 millilitre du mélange sur la mini-colonne préparée et collectez l’EIT en utilisant uniquement la gravité. Une fois que l’EIT est collecté, fixez rapidement un bouchon septique au flacon de collecte pour l’utiliser sur l’UPLC.

Placez les flacons dans A-U-P-L-C déjà préparés avec une phase mobile d’essai d’eau, de méthanol et d’acédonite. Quantifiez ensuite la teneur en aflatoxine dans les EIT. Voir le protocole texte pour plus de détails ainsi que l’analyse UPLC.

Placez les morceaux de semence utilisés pour l’extraction dans des flacons en verre individuels. Ensuite, lyophilisez les flacons pendant la nuit et mesurez le poids sec de l’échantillon de tissu le matin afin que les concentrations d’aflatoxine puissent être exprimées en nanogrammes par gramme d’échantillon. Ensuite, sortez les échantillons du congélateur et ajoutez-y du triol et broyez les tissus congelés avec un homogénéisateur de broyeur à billes à 3, 100 tr/min pendant 40 secondes et procédez à l’extraction de l’ARN : un vecteur ARNAI portant de petits fragments de cinq gènes de synthèse de l’aflatoxine à partir d’un flavis a été utilisé pour transformer les plantes d’arachide.

Les numéros d’identification correspondent aux numéros d’annotation du génome de l’institut : 99 TRANSFORMANTS régénérés, sept lignées positives à la PCR ont été clonées et testées comme décrit. Tous les sept ont montré une accumulation d’aflatoxine de 60 à 100 % inférieure par rapport aux lignées témoins. Les résultats de deux des sept lignes sont présentés.

Ces deux raies RN AI ont montré la présence du marqueur sélectionnable NPT deux. Selon les résultats S-T-N-P-C-R, le contrôle négatif utilisé était une lignée négative PCR qui est passée par le processus de transformation pour tester la capacité des lignées ARNi à résister aux aflatoxines fraîchement récoltées ou à un aflatoxine positif. Une lignée flavis NRRL 3, 3, 5, 7 a été appliquée sur un demi-cot, du plomb dépourvu d’embryon et de testum après une incubation pouvant aller jusqu’à 96 heures.

Les tissus inoculés ont été traités à l’aide de l’UPLC pour mesurer leurs niveaux d’aflatoxine comme décrit. Ces résultats ont été confirmés par chromatographie liquide par spectrométrie de masse. Dans l’ensemble, l’ARNi 2 88 72 a montré une réduction de 94 à 100 % de l’aflatoxine B deux et une réduction de 90 à 100 % de l’aflatoxine B un par rapport au témoin.

Alors que l’ARNi 2 88 74 a montré une réduction de 60 à 100 % des deux aflatoxines. Suite à cette procédure, les mêmes extraits de graines peuvent être utilisés pour analyser le phyto Xin afin de mieux comprendre la réponse des graines à l’invasion fongique. Cette méthode fournira également un outil unique pour aider à développer la technologie de l’ARN pour le contrôle des mycotoxines.