Name: Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut / Aspergillus Pathosystème (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse des aflatoxines dans les arachides transgéniques utilisant l'ARNi pour contrôler Aspergillus flavus. Cette technique réduit drastiquement la quantité de graines nécessaires aux tests.

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Ce travail a reçu le soutien financier du projet USDA-ARS CRIS 6604-21000-004-00D, du projet CRIS 6604-42000-008-00D, et de l’accord du programme USAID Feed-the-Future numéro 58-0210-3-012. Nous remercions Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell et Kathy Gray pour leur assistance technique. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cet article est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas une recommandation ou une approbation par le ministère américain de l’Agriculture.

Les auteurs n’ont rien à divulguer ni aucun conflit d’intérêts.

Plante-hôte ARNi médiée par le silençage de gènes dans des pathogènes fongiques a été démontré 27,43, cependant, il n&#39;y a pas de publications montrant la faisabilité du contrôle ARNi médiée par l&#39;accumulation de mycotoxines dans les plantes. Un facteur limitant pour ces études à l&#39;arachide était l&#39;absence d&#39;une méthode pour évaluer une accumulation phénotype sans l&#39;aflatoxine dans les plantes individuelles, que les feuilles ne montrent pas de symptômes sur une infection fongique de gousses souterraines. En outre, l&#39;accumulation sans normalement distribué des aflatoxines, et la nécessité pour les grands échantillons pour l&#39;analyse chimique 15,16 ont entravé la quantification de l&#39;effet potentiel sur l&#39;ARNi une seule plante. La méthode présentée ici se compose de 72 expériences de RH en utilisant cinq graines pour effectuer trois prélèvements 24 h-intervalle en trois exemplaires (tableau 1, figure 7). Par rapport à l&#39;analyse des aflatoxines typique qui ne nécessite pas moins de 100 g de graines, notre procédé est particulièrement approprié pour individual d&#39;événements transgéniques de plants d&#39;arachide qui produisent initialement pas plus de deux ou trois gousses. RNA silencing médiée par la synthèse de l&#39;aflatoxine a été démontrée par la transformation génétique Aspergillus flavus et A. parasiticus. Depuis aflR est un régulateur principal de la production d&#39;aflatoxine dans A. flavus et A. 44,45 parasiticus, il devient une cible intéressante pour le silençage de l&#39;ARN à médiation par les plantes. Cependant, les variations génétiques dans aflR a été démontré chez les espèces d&#39;Aspergillus 46, et ces variantes génétiques pourraient échapper taire si il n&#39;y a pas de séquence parfaite correspondant au signal ARNi produite dans la plante hôte. Ainsi, aflR était l&#39;une des cibles pour réduire au silence dans le vecteur p5XCAPD, mais n&#39;a pas été le seul. Répétitions inversées du gène aflR introduits dans A. flavus et A. parasiticus par transformation conduit à taire et peu ou pas de produition des aflatoxines 47 (McDonald et al., 2005b). Aussi, faire taire le gène AFLD a empêché la production d&#39;aflatoxine jusqu&#39;à 98% en A. flavus et A. parasiticus dans la transformation directe 48. Pour augmenter la probabilité de succès dans notre système, l&#39;arachide a été transformé avec des fragments inversées répétées de cinq gènes impliqués dans la production d&#39;aflatoxine dans A. flavus. Ici, il est indiqué que l&#39;utilisation de p5XCAPD qui cible pour faire taire plusieurs gènes dans la voie de synthèse de l&#39;aflatoxine, 90% des niveaux inférieurs à 100% de l&#39;aflatoxine B 1 et B 2 ont été atteints dans la ligne de 288 à 72, et les niveaux 60-100% inférieurs accumulé dans ligne 288 à 74 par rapport à la commande, lorsque les cotylédons et demi ont été inoculés avec A. flavus, les figures 4, 7. Plus important encore, cette méthode a détecté des différences statistiquement significatives dans l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine par des lignes 288-72, 288-74 contre le contrôle tout au long de l&#39;expérience en appliquant statis paramétriquetics, figure 7. Compte tenu de la petite taille de l&#39;échantillon, il est important de souligner la nécessité d&#39;utiliser une méthode puissante pour détecter les aflatoxines, ces expériences ont été analysés par UPLC qui a une haute résolution, cinq fois de meilleures performances et une sensibilité trois fois plus élevé que HPLC 49. Expression de l&#39;ARNi insert dans 288-74 n&#39;a été détectée dans les cotylédons immatures (jaune) à 24 heures d&#39;incubation. L&#39;insert ARNi n&#39;a pas été détecté par RT-PCR sur des cotylédons matures de 288 à 74 à 24 h, ou sur un groupe d&#39;échéance à 48 h, la figure 6. Ce même phénomène a été observé dans d&#39;autres lignes d&#39;arachides transgéniques ARNi (Arias, RS 2015 non publié), où généralement les transcriptions ARNi ont été détectés que sur des cotylédons immatures à 24 h. Des échantillons d&#39;ARN ont été traités par la DNase avant la synthèse d&#39;ADNc, les données ont été normalisées pour le niveau d&#39;expression d&#39;actine et aucun signe de contamination de l&#39;ADN a été observée. Si l&#39;ADN a pu être présente dans les échantillons, il devraitont été détectés dans les échantillons de 48 h aussi, mais de façon constante que fut pas le cas. Expression sous le contrôle de la 35S-promoteur est pas toujours uniforme; il peut être affecté par des conditions environnementales 50, type de tissu et le stade de développement 51,52. Dans le même temps, dans la voie de l&#39;interférence ARN, le taux de dégradation de l&#39;ARNm et le taux de décroissance siRNA peuvent varier considérablement 53. Il est possible que la dégradation rapide de l&#39;ARNm par le mécanisme de l&#39;interférence ARN aurait pu empêcher la détection de l&#39;ARNm et 48 heures d&#39;incubation. Que l&#39;absence d&#39;expression à 48 h était due à de faibles 35S-promoteur entraîné la transcription ou à la dégradation rapide de l&#39;ARN double brin par Dicer reste sans réponse. Ainsi, la détection de petits ARN par séquençage à haut débit donnerait une meilleure idée sur les processus qui se déroulent à travers ARNi 54 dans ces expériences. Cependant, depuis RNA silencing propage systémique, principalement à travers le phloème de photosynthaïr sources au saccharose puits (dans ce cas arachide graines) 55, le musellement de l&#39;aflatoxine-synthèse peut se produire dans les graines sans expression locale de l&#39;ARNi insert. Beaucoup de recherche reste à faire pour déterminer le niveau de petits ARN interférents (siRNA) nécessaires pour empêcher l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine dans les graines de seuil. Il est important de souligner le fait que les deux, expression de l&#39;ARNm de l&#39;ARNi construire (Figure 6), et l&#39;accumulation des aflatoxines B 1 et B 2 (figure 7) a montré des résultats différents pour les immatures (jaune) vs. mature (marron) cotylédons. Plants d&#39;arachide ont une croissance indéterminée, qui est, ils présentent à la récolte d&#39;une gamme de dosettes échéance, la figure 2. En outre, les graines de différents groupes de maturité diffèrent par leur composition chimique, par exemple., 2,4% de saccharose dans les graines immatures, et de 1,9% en graines matures dans les mêmes conditions sur le terrain 56,57. Ainsi, pour comprendre la réelle efficiency de contrôle d&#39;ARN médiée par l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, il est important d&#39;analyser séparément les groupes de maturité. Une défense naturelle de graines d&#39;arachide est la production de phytoalexines, qui varie dans la diversité des composés produits et leurs quantités relatives en fonction de la maturité des graines et des conditions environnementales 58-61, et il est particulièrement élevé dans les embryons comparativement à 62 cotylédons. Les embryons ont également des concentrations significativement plus élevées d&#39;acides nucléiques, aussi bien ADN et l&#39;ARN que les cotylédons (RS Arias, non publié). Comme graines d&#39;arachide mûrissent, les changements dans leur physiologie et leur composition chimique se produisent 63. Antioxydants phénoliques dans les arachides forme de testa tanins condensés avec une activité fongistatique 64; cela est également évidente dans la couleur de la mésocarpe qui reflète les stades de maturité, jaune au noir 35, comme sa teneur en tanins et composés phénoliques augmente avec la maturité 65. Ainsi, la présence de testa ou d&#39;embryons dans l&#39;expérience, compte tenu de leurs propriétés antimicrobiennes, auraient pu limiter la croissance des champignons et donc surestimé l&#39;effet de l&#39;ARNi au silence, par conséquent, ils ont été enlevés. En outre, la suppression de Testa et embryons permet de limiter les sources de variation dans l&#39;analyse, que la moitié des cotylédons qui porte l&#39;embryon aura plus de phytoalexines et plus de contenu de l&#39;ARN. En plus de l&#39;analyse par groupes de maturité et l&#39;élimination des testa et de l&#39;embryon dans ces expériences, il est important de souligner quelques observations: a) si les résultats sont indiqués pour un maximum de 96 heures d&#39;incubation, il est recommandé de ne pas utiliser plus de 72 h pour obtenir des résultats cohérents, que les graines se dégradent de 96 h; et b), tandis que les cotylédons demi de la même graine, bien échantillonné au hasard, ne constituent pas des échantillons parfaitement indépendants, RT-PCR et l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine dans les événements transgéniques ont montré variation minimale entre les graines. En outre, un spores fongiques précise compte, le volume de l&#39;inoculums de 2 pl, et l&#39;application de spores sur la surface des cotylédons évitant dégoulinant sur les côtés de coupe sont importants pour assurer que les spores germées sont exposés à du tissu végétal. L&#39;eau / agar sur les plaques devrait être à 1,5% (p / v), l&#39;agar mou provoque le ruissellement des spores comme indiqué sur la dernière image de la figure 4 (en bas). Si la disponibilité des semences à partir d&#39;un événement transgénique notamment être limité, l&#39;échantillonnage peut être fait en double exemplaire au lieu de triple obtenir des résultats similaires (par exemple, la figure 7); Cependant, les échantillons en triple aideront à réduire l&#39;erreur-type. La seule limitation de cette méthode est qu&#39;elle nécessite un système très sensible (UPLC) pour la détection de l&#39;aflatoxine / quantification, mais en même temps, ce qui réduit la probabilité d&#39;une surestimation de l&#39;effet de l&#39;ARNi doit aflatoxines pas être détecté par des méthodes moins sensibles. En conclusion, cette méthode offre pour la première fois une approche fiable pour étudier laeffet de l&#39;ARNi dans le contrôle des aflatoxines. Réduire le temps pour une expérience de toute une saison de culture à moins d&#39;une semaine, cette méthode sera énormément accélérer la recherche sur l&#39;ARNi arachide / Aspergillus pathosystème vers l&#39;atténuation et / ou de l&#39;élimination des aflatoxines.

Environ 4,5 milliards de personnes sont exposées de façon chronique aux aflatoxines 1, les substances cancérogènes les plus puissantes connues dans la nature 2. Ces mycotoxines contaminent 25% des cultures vivrières dans le monde 3, y compris le maïs, le manioc, le riz, les noix, les céréales et les épices. 4. Les aflatoxines entraînent des retards de croissance chez les enfants de 5, compromettent le système immunitaire 6, sont présents dans 58% des carcinomes hépatocellulaires-en biopsies humaines 7,8, et tuent des centaines de personnes au cours des flambées périodiques de aflatoxicose 9,10. Les aflatoxines sont des mycotoxines polykétide dérivé normalement produites par Aspergillus flavus et A. parasiticus; aflatoxines B 1 et B 2 sont produites par A. flavus, alors que A. parasiticus produit également des G 1 et G 2. La structure chimique de ces composés et un chromatogramme montrant leur séparation par UPLC sont présentées dans la figure 1. </strong&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> Figure 1. Les aflatoxines et RNAi insérer Haut:. Structure chimique (à gauche) et l&#39;exemple de chromatogramme (à droite) des quatre aflatoxines polyketides dérivés les plus courants: B 1, B 2, G 1 et G 2, produite par Aspergillus parasiticus, A . flavus produit B 1 et B 2 Bottom: Schéma de fragments de gènes dans l&#39;ARNi construire p5XCAPD utilisé pour la transformation d&#39;arachide, numéros sous les flèches sont les numéros d&#39;accession de gènes fragment dans le génome d&#39;Aspergillus flavus;. PIV2: la pomme de terre intron; paires de bases;: pb RT_5X_1 et RT_5X_2:. En temps réel des sites d&#39;amorce PCR <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Les pertes économiques dans les exportations en raison de aflatoxines dans l&#39;arachide dépassent seuls 450 millions de dollars américains si calculé sur la base de 4 ng. G -1 limite de l&#39;aflatoxine autorisé pour la consommation humaine dans l&#39;Union européenne 11. Les aflatoxines sont connus depuis 60 ans 12; Toutefois, si de nombreuses pratiques agricoles ont été développés pour en atténuer les effets, y compris l&#39;application d&#39;autres souches fongiques 13,14, aucune méthode uniforme de contrôle existe, et les variétés de plantes résistantes ne sont pas disponibles. Test matériel phytogénétique pour la résistance aux aflatoxines est particulièrement difficile, parce que même dans des conditions propices à l&#39;invasion de l&#39;agent pathogène, l&#39;accumulation de mycotoxines est imprévisible et ne suit pas une distribution normale. Ainsi, les expériences nécessitent généralement de vastes zones de plantation, des centaines de graines et de multiples échantillons de 100-1,700 g pour réduire la variabilité de la 15,16 de données. L&#39;interférence ARN étaitdécouvert en 1998 17; et les avantages de &quot;faire taire&quot; sont actuellement explorées dans un certain nombre de nouvelles applications, par exemple., dans les thérapies humaines contre le cancer du sein métastatique 18, le cancer du foie 19, la leucémie myéloïde 20, et dans la protection des plantes contre les insectes 21 et nématodes 22. Dans les usines, les signaux d&#39;interférence d&#39;ARN peuvent voyager cellule en cellule, avec des petits ARN interférents (siRNA) et de l&#39;ARN de haut poids moléculaire étant responsable pour le gène posttranscriptional systémique taire 23,24, même à l&#39;intérieur des agents pathogènes fongiques qui sont en contact étroit avec la plante hôte 25. L&#39;efficacité de l&#39;ARNi sur le silençage des plantes médiée par des gènes fongiques-pathogène a été décrite dans quelques pathosystèmes végétales, pour ces derniers, l&#39;examen visuel des symptômes dans les parties aériennes des plantes (feuilles) a permis la quantification de la maladie, à savoir, oomycète Bremia dans la laitue 26 , Puccinia chez le blé <sup&gt; 27 et Fusarium dans la banane 28. Beaucoup plus difficile est d&#39;évaluer l&#39;efficacité ARNi pour contrôler les mycotoxines dans les plantes, en particulier les aflatoxines dans les arachides que les feuilles ne présentent aucun symptôme d&#39;infection, les organes envahis (graines) sont sous plusieurs pouces du sol, l&#39;apparition de l&#39;infection est imprévisible, et seul produit chimique l&#39;analyse permet de déterminer la présence d&#39;aflatoxines. En outre, chaque événement transgénique arachide produit normalement quelques graines (4-6 par plante); Par conséquent, le test traditionnel pour une accumulation sans trait d&#39;aflatoxine dans les grandes parcelles de terrain, d&#39;une durée saisons de culture entières, et en utilisant des centaines de graines est pas possible. Une méthode est décrite ici pour analyser en moins d&#39;une semaine, l&#39;ARNi graines d&#39;arachide pour présence de transgène et pour une accumulation sans trait d&#39;aflatoxine, en utilisant seulement quelques graines.

<table><tbody><tr><td>Amorces, oligonucléotides</td><td>DNA Technologies, Coralville, IA, États-Unis</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>Czapek Dox agar medium</td><td>Oxoid, par Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>CM0095</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>BP 1423</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur -80&nbsp ; &deg ; C</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde d’aluminium, Al2O3</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941</td><td></td></tr><tr><td>Réservoirs SPE 1,5 ml</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>210011</td><td></td></tr><tr><td>Frits pour réservoir SPE de 1,5 ml</td> Flacons <td>d’échantillonneur</td> automatique <td>Grace Davison Discovery Scientific</td> 211401 <td></td></tr><tr><td>Waters</td><td>Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td>186005221</tr><tr><td>Waters Acquity Chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) ; Gestionnaire de solvants quaternaires UPLC-H-Class ; Gestionnaire d’échantillons UPLC ; Détecteur fluorescent UPLC (FLR) ; UPLC BEH C18 2.1&nbsp ; mm x 50&nbsp ; mm, 1,7 mm colonne</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnigan Spectromètre de masse à piège ionique LCQ Advantage MAX, avec logiciel Xcalibur version 1.4</td><td>Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normes Aflatoxin, B1, B2, G1 et G2</td><td>Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO</td><td>A6636 ; A9887 ; A0138 ; A0263</td><td></td></tr><tr><td>Systat Software 12.2</td><td>SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactif de trizol</td><td>Invitrogen, CA</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Synthèse de premier brin Super Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11752-050</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 PCR en temps réel</td><td>Lifetechnologies, Grand Island, NY</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth-Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>R453642</td><td></td></tr><tr><td>pENTR1A</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A10462</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Mélange d’enzymes</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1919</td><td></td></tr><tr><td>Acétosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Poste de travail robot QIAcube</td><td>Qiagen, Valence, Californie</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques : kanamycine, céfotaxime, gentamicine ; streptomycine</td><td>Goldbio, St. Louis, MO</td><td>cef. : C-104-25 ; kan : K-120-5 ; gent. : G-400-1 ; streptocoque : S-150-50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11304-029</td><td></td></tr></tbody></table>

contrôle des aflatoxines dans les arachides arni médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et transgene expression dans la peanut /<em&gt; aspergillus</em&gt; pathosystème

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

L&#39;Organisation des Nations Unies pour l&#39;alimentation et l&#39;agriculture estime que 25% des cultures vivrières dans le monde sont contaminées par des aflatoxines. Cela représente 100 millions de tonnes de nourriture détruites ou détournées vers la consommation non-humaine chaque année. Les aflatoxines sont cancérigènes puissants normalement accumulées par les champignons Aspergillus flavus et A. parasiticus dans les céréales, les noix, les légumes racines et les autres produits agricoles. Silence de cinq gènes aflatoxine-synthèse par interférence ARN (ARNi) dans les usines d&#39;arachide a été utilisé pour contrôler l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine après inoculation avec A. flavus. Auparavant, aucune méthode existait pour analyser l&#39;efficacité de l&#39;ARNi dans les événements transgéniques d&#39;arachide individu, que ceux-ci produisent généralement peu de graines, et les méthodes traditionnelles de grandes expériences sur le terrain dans des conditions d&#39;aflatoxine ont été propices pas une option. Sur le terrain, la probabilité de trouver des graines naturellement contaminés est souvent 1/100-1/1,000. En outre, la contamination par l&#39;aflatoxine est pas uniformément répartis. Notre méthode utilise quelques graines par événement transgénique, avec de petits morceaux transformés pour PCR en temps réel (RT-PCR) ou petite séquençage de l&#39;ARN, et pour l&#39;analyse de l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine par chromatographie liquide ultra performance (UPLC). Lignes d&#39;arachide ARNi exprimant 288-72 et 288-74, ont montré jusqu&#39;à 100% de réduction (de p≤0.01) en aflatoxine B 1 et B 2 par rapport à la commande qui se sont accumulés jusqu&#39;à 14.000 ng. G -1 de l&#39;aflatoxine B 1 lorsque inoculé avec aflatoxigènes A. flavus. Comme référence, le total maximum d&#39;aflatoxines autorisées pour la consommation humaine aux Etats-Unis est de 20 ng g -1.. Ce protocole décrit l&#39;application du contrôle de l&#39;ARNi médiée par des aflatoxines dans les graines et les méthodes pour l&#39;évaluation des arachides transgéniques. Nous pensons que son application dans l&#39;élevage d&#39;arachide et autres cultures apportera progrès rapides dans ce domaine important de la science, De la médecine et de la nutrition humaine, et contribueront de manière significative à l&#39;effort international visant à contrôler les aflatoxines, et potentiellement d&#39;autres mycotoxines dans les principales cultures vivrières.

Plasmide p5XCAPD a été fait comme un dérivé de pCAPD 29, et l&#39;a utilisé pour transformer des plantes d&#39;arachide; Ce vecteur porte répétitions inversées de cinq petits fragments, 70-80 pb chacun, de gènes de synthèse de l&#39;aflatoxine-A. flavus séparés par un intron (Figure 1). Fragments de AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (AFLS ou aflJ), AFL2G_05027 (aflatoxine pompe d&#39;efflux, aflep), AFL2G_07228 (CATF / pksA / pksL1), et AFL2G_07731 (pes1) ont été utilisés pour la construction, les numéros sur la figure 1 correspondent à une . flavus annotation du génome au Broad Institute, Cambridge, MA, et la littérature 42. Un total de 99 lignes d&#39;arachide ont été régénérés après être passé par le processus de transformation, 50 étaient positifs par PCR pour NPTII détecté par STN-PCR, et 33 lignes étaient PCR positives et les graines produites. Seulement sept lignes positifs PCR ont été propagées par clonage et testés par le présenméthode de t pour l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, tous les sept montré entre 60% et 100% moins d&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine que le contrôle. Ici, nous montrons les résultats de deux de ces sept lignes. Comme les événements transgéniques individuels produisent généralement peu de graines, une méthode a été développée pour utiliser un nombre minimum de graines tout en étant capable de faire l&#39;analyse statistique paramétrique. Un organigramme de la préparation de l&#39;échantillon et montage expérimental est représenté sur la Figure 5 et le Tableau 1. Bien que la première génération de graines transgéniques est généralement hémizygotes, il est prévu que la cellule à cellule et la circulation systémique de petits ARN interférents (siRNA) générés par interférence ARN devrait conférer aflatoxine synthèse silence dans toute la plante. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> Figure 5. organigramme schématique de la méthode pour analyser l&#39;efficacité de l&#39;ARNi à faire taire </strong&gt; Aspergillus gènes aflatoxine-synthèse dans les graines d&#39;arachide. Représentation graphique du flux de travail lors du traitement des échantillons d&#39;arachide pour l&#39;expression du gène ou de l&#39;analyse de l&#39;aflatoxine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ARNi lignes d&#39;arachide 288-72 et 288-74 ont montré la présence de l&#39;sélectionnable fabricant NPTII lorsqu&#39;il est testé par STN-PCR, sections de gel sont présentés dans la figure 6 (en haut), les images originales sont disponibles auprès des auteurs sur demande. Plasmide pCAPD n&#39;a pas été utilisé comme témoin de la transformation car il encode répétitions inversées de deux gènes Cmr (résistance au chloramphénicol) et la CCDB (toxine) de l&#39;effet inconnu sur les plantes. PCR en ligne d&#39;arachide négative 288-9 et d&#39;autres qui sont passés par le processus de régénération et a été cultivé dans les mêmes conditions que les lignes ARNi, ont été utilisés comme con négativecontrôle. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . Figure 6. Détection de transgéniques et d&#39;expression en temps réel de l&#39;ARNi insert Haut: monotube, la détection PCR nichée de lignes d&#39;arachides transgéniques ARNi-288-72 et 288-74 ARNi, plantes positives. Contrôles: W (eau), PP (usine positif), MM (Master Mix), p (plasmide p5XCAPD); Les fractions 1/2 1/4 1/8 1/16 représentent des dilutions de 2 fois de l&#39;ADN de fond. PCR en temps réel détection de l&#39;expression du RNAi insert (jeux d&#39;amorces: RT_5X_1, RT_5X_2, comme sur la figure 1, sur immature ( jaune) et matures (cotylédons) brunes de lignées transgéniques à 24 et 48h d&#39;incubation; ligne grise: C T = 1. Les histogrammes représentent les moyens et les barres d&#39;erreur standard (T) de trois échantillons biologiquesavec trois répétitions techniques. La quantification relative de l&#39;insert ARNi a été normalisée par rapport à la gène de ménage actine comme contrôle interne et comparative fois l&#39;expression du transgène, calculée comme indiqué en 5.2.2 et 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Pour tester l&#39;efficacité du contrôle éventuelle des plantes-hôte ARNi médiée de l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, conidies fraîchement récoltées d&#39;Aspergillus flavus NRRL 3357 ont été appliquées sur la surface de coupe des cotylédons et demi à partir de laquelle avaient été enlevés les embryons et testa (figures 3, 4). A. flavus NRRL 3357, dont le génome a été séquencé et a servi de base pour la conception p5XCAPD, a été aimablement fourni par le Dr Horn USDA-ARS-NPRL. L&#39;invasion fongique résultant de la moitié cotylédons après 24, 48 et 72 heures à 30 ° C est spectacle<html> n sur la figure 4. Des échantillons de cotylédons demi inoculés ont été prélevés à 24, 48, 72, 96 h d&#39;incubation et analysés pour l&#39;essentiel quatre aflatoxines B 1, B 2, G 1 et G 2 en utilisant UPLC et confirmée par LC-MS ; résultats sont présentés sur la figure 6. Les concentrations de l&#39;aflatoxine ont été déterminées en utilisant un procédé publié, avec les adaptations 36. A 96 heures d&#39;incubation, les cotylédons commencent à se désintégrer en raison de l&#39;infection fongique. Ligne ARNi 288-72 exposé baisse significative des niveaux d&#39;aflatoxines que le contrôle à toutes les dates d&#39;échantillonnage dans les cotylédons immatures et à la plupart des dates d&#39;échantillonnage dans les arrivées à maturité. Ligne ARNi 288-74 montré des niveaux significativement plus bas d&#39;aflatoxines dans la plupart des dates d&#39;échantillonnage. Les niveaux de signification du test de Tukey sont indiqués par des astérisques dans le graphique de la figure 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . Figure 7. aflatoxines B 1 et B 2 dans la moitié cotylédons d&#39;arachide après incubation (24, 48, 72 et 96 h) avec Aspergillus flavus contrôle: graines de ligne 288-9 non transgénique; ARNi: graines de RNAi-288-72 et 288-74 ARNi, transgénique pour ARNi p5XCAPD au silence cinq gènes aflatoxine-synthèse. (A) l&#39;aflatoxine B 1 dans les graines matures (brun); (B) les aflatoxines B 2 graines matures; (C) l&#39;aflatoxine B 1 dans les graines immatures (de jaune) et (D) les aflatoxines B 2 dans les graines immatures. Les valeurs moyennes avec les barres d&#39;erreur standards correspondants (T) d&#39;échantillons biologiques en double sont représentés. Des différences statistiquement significatives test * de Tukey: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Dans l&#39;ensemble, l&#39;ARNi a montré 288-72 long de l&#39;expérience (24 à 96 h d&#39;incubation), une réduction de 94% -100% de l&#39;aflatoxine B 2, et une réduction de 90% -100% de l&#39;aflatoxine B 1 par rapport au témoin. RNAi-288-74 a montré une réduction de 63% -100% de l&#39;aflatoxine B 2 et 60% -100% de réduction dans l&#39;aflatoxine B 1, la figure 7. Amorces utilisées pour la détection par PCR en temps réel de l&#39;expression de l&#39;insert ARNi sont présentés dans la figure 1. Cotylédons arachides semences ont été analysés sans embryons, de retirer leurs défenses naturelles et être capable de détecter l&#39;effet potentiel de l&#39;ARNi sur la zone la plus exposée aux l&#39;invasion fongique, les cotylédons. Expression de l&#39;ARNi insert détecté dans les cotylédons immatures (jaune) de la ligne 288 à 74 par jeu d&#39;amorces RT_5X_1 était quatre fois au cours de la C T </sub&gt; = 1 seuil du contrôle négatif, et en ensemble d&#39;amorces RT_5X_2 était 19 fois au-dessus du seuil, le tout à 24 heures d&#39;incubation. Au moins trois des cinq fragments de gène consécutifs utilisés dans la transformation d&#39;arachide, 5027, 7223 et 7228 (aflep, AFLS / aflJ, et AFLC / pksA, respectivement) ont été détectés par RT-PCR (Figure 1, 6). Expression de l&#39;insert ARNi n&#39;a pas été détecté dans les cotylédons matures à 24 h, ou sur cotylédons matures ou immatures, à 48 heures d&#39;incubation, la figure 6 (en bas). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> Peanut Ligne </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Durée de l&#39;échantillonnage </td><td colspan="3" style="width:192px;"> Les échantillons pour RT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> Les échantillons destinés à l&#39;analyse des aflatoxines (inoculé) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Nombre de semences </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (non inoculé) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td><td style="width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> ARNi (jaune) </td><td style="width:64px;"> 24 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdstyle = &quot;width: 64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Contrôle </td><td style="width:64px;"> 24 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (jaune) </td><td style="width:64px;"> 48 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Exemple de montage de petits échantillons pour analyser l&#39;expression des gènes et de l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine dans les ARNi graines d&#39;arachide. L&#39;analyse complète d&#39;expression et d&#39;aflatoxines pour un groupe de maturité (ie., Jaune), avec trois périodes d&#39;échantillonnage (24, 48 et 72 h) , en trois exemplaires, exigerait 4,5 semences, chaque numéro un dans le tableau représente la moitié cotylédons.

Nous démontrons une méthode pour l&#39;analyse des aflatoxines et l&#39;expression du transgène dans les graines d&#39;arachide qui contiennent des signaux ARN interférence pour réduire au silence des gènes de synthèse de l&#39;aflatoxine dans le champignon Aspergillus flavus. Contrôle de l&#39;ARNi médiée par des mycotoxines dans les plantes n&#39;a pas été signalé précédemment.

Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystème

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

L’objectif global de ce travail est de fournir une méthode fiable, précise, peu coûteuse et rapide pour tester l’efficacité du silençage médié par l’ARNi des gènes de synthèse de l’aflatoxine de l’aspergillus dans l’arachide transgénique en utilisant un nombre minimum de graines, généralement des centaines de grammes de graines sont nécessaires pour quantifier efficacement les aflatoxines dans les échantillons. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise moins de cinq graines pour tester un traitement particulier 10 jours avant la préparation des graines, mettre en place une culture d’aflatoxine positive aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 dans un milieu de tarière ZAP Pex. Cultivez cette culture à 25 degrés Celsius.Il sera utilisé pour l’inoculation des graines. Après avoir préparé les plantes transgéniques exprimant l’ARN, qui est détaillé dans le protocole de texte, procédez à la récolte de leurs graines. Tout d’abord, retirez la carpe périque à l’aide de l’abrasion d’un nettoyeur haute pression réglé à basse pression, ou grattez la carpe périque à la main.Une fois la péricarpe retirée, identifiez la couleur de la mésocarpe en plaçant les gousses sur une planche de maturité dans les groupes appropriés. Retirez maintenant les trous et traitez les graines jaunes et brunes séparément. Calculez le nombre de graines nécessaires pour l’expérience au moins trois graines, ce qui signifie que trois moitiés de co-plombine sont nécessaires par ligne d’arachide échantillonnée.Couvrez le fond d’un bécher stérile avec une couche de graines, puis couvrez simplement les graines avec un volume mesuré de 75 % d’éthanol. Ensuite, doublez ce volume. Laissez les graines incuber en solution pendant 30 secondes, puis rincez-les à l’eau distillée stérilisée.Ensuite, traitez les graines avec un volume de 2 % d’hypochlorite comme fait avec l’éthanol F. Laissez cette incubation se poursuivre pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez trois rinçages dans des volumes quintuples d’eau distillée stérilisée.Pour éliminer l’hypochlorite, il est essentiel que toute la solution d’hypochlorite soit lavée au cours de cette étape. Les graines sont maintenant stérilisées en surface. Ensuite, hydratez les graines en les immergeant dans de l’eau distillée stérilisée pendant deux heures préparées pour mettre les graines hydratées sur une boîte de Pétri stérile.Tous les matériaux doivent être stérilisés à ce stade. Retirez les téguments à l’aide d’une pince, puis séparez le cohaïne. Enfin, retirez les embryons à l’aide d’un scalpel.Les embryons peuvent être jetés ou utilisés pour régénérer de nouvelles plantes. Ensuite, coupez l’oléine en deux avec un scalpel et immergez les moitiés et l’eau distillée stérilisée jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’inoculation. Ensuite, épongez l’excès d’eau de la moitié du plomb sur du papier absorbant stérile et placez les morceaux de graines dans des plaques de vis séparées à 1,5 % avec des divots de la taille des graines et rentrez-y les graines avec le côté coupé vers le haut pour inoculer les moitiés de plomb de co.Ajoutez deux microlitres d’une suspension de 10 000 spores d’aspergillus par microlitre sur les surfaces coupées. Ne laissez pas la suspension couler sur les côtés de la moitié de la graine. Enfin, placez la vaisselle dans un incubateur sombre à 30 degrés Celsius pendant un à quatre jours jusqu’à ce qu’elle soit testée.Après un jour, après deux jours et après trois ou quatre jours, échantillonnez les graines, retirez délicatement les moitiés inoculées sélectionnées au hasard au besoin. Utilisez un mouchoir pour essuyer l’excès de spores et une tarière et placez l’échantillon dans un flacon à bouchon à vis en verre. Transférez les échantillons non inoculés dans des tubes de deux millilitres pour l’analyse R-T-P-C-R.Libérez les échantillons dans de l’azote liquide et conservez les échantillons congelés dans un congélateur jusqu’à ce qu’ils soient traités. Pour l’analyse de l’aflatoxine, obtenez la demi-plombine de cochon inoculée dans un flacon à bouchon à vis en verre de quatre millilitres si nécessaire. L’échantillon sera stable pendant de nombreux mois à moins 80 degrés Celsius.Lorsque les graines sont à température ambiante, extrayez l’échantillon en ajoutant quatre volumes de méthanol et laissez les tubes incuber toute la nuit dans l’obscurité à température ambiante sans agitation. Le lendemain, effectuez d’abord l’UPLC, préparez une mini-colonne de propylène de 1,5 millilitre avec une fritte assortie. Ajoutez ensuite 200 milligrammes d’oxyde d’aluminium.Et ensuite, insérez une autre fritte. Position suivante, flacon d’échantillonneur automatique A-U-P-L-C sous et en contact avec la mini-colonne pour minimiser l’évaporation. Ajoutez maintenant 0,5 millilitre d’extrait de méthanol de l’échantillon dans un verre jetable deux fois pas en plastique.Ajoutez ensuite 0,5 millilitre d’acéto nitrile dans le tube et mélangez les solutions à l’aide d’une pipette. Appliquez maintenant 0,5 millilitre du mélange sur la mini-colonne préparée et collectez l’EIT en utilisant uniquement la gravité. Une fois que l’EIT est collecté, fixez rapidement un bouchon septique au flacon de collecte pour l’utiliser sur l’UPLC.Placez les flacons dans A-U-P-L-C déjà préparés avec une phase mobile d’essai d’eau, de méthanol et d’acédonite. Quantifiez ensuite la teneur en aflatoxine dans les EIT. Voir le protocole texte pour plus de détails ainsi que l’analyse UPLC.Placez les morceaux de semence utilisés pour l’extraction dans des flacons en verre individuels. Ensuite, lyophilisez les flacons pendant la nuit et mesurez le poids sec de l’échantillon de tissu le matin afin que les concentrations d’aflatoxine puissent être exprimées en nanogrammes par gramme d’échantillon. Ensuite, sortez les échantillons du congélateur et ajoutez-y du triol et broyez les tissus congelés avec un homogénéisateur de broyeur à billes à 3, 100 tr/min pendant 40 secondes et procédez à l’extraction de l’ARN : un vecteur ARNAI portant de petits fragments de cinq gènes de synthèse de l’aflatoxine à partir d’un flavis a été utilisé pour transformer les plantes d’arachide.Les numéros d’identification correspondent aux numéros d’annotation du génome de l’institut : 99 TRANSFORMANTS régénérés, sept lignées positives à la PCR ont été clonées et testées comme décrit. Tous les sept ont montré une accumulation d’aflatoxine de 60 à 100 % inférieure par rapport aux lignées témoins. Les résultats de deux des sept lignes sont présentés.Ces deux raies RN AI ont montré la présence du marqueur sélectionnable NPT deux. Selon les résultats S-T-N-P-C-R, le contrôle négatif utilisé était une lignée négative PCR qui est passée par le processus de transformation pour tester la capacité des lignées ARNi à résister aux aflatoxines fraîchement récoltées ou à un aflatoxine positif. Une lignée flavis NRRL 3, 3, 5, 7 a été appliquée sur un demi-cot, du plomb dépourvu d’embryon et de testum après une incubation pouvant aller jusqu’à 96 heures.Les tissus inoculés ont été traités à l’aide de l’UPLC pour mesurer leurs niveaux d’aflatoxine comme décrit. Ces résultats ont été confirmés par chromatographie liquide par spectrométrie de masse. Dans l’ensemble, l’ARNi 2 88 72 a montré une réduction de 94 à 100 % de l’aflatoxine B deux et une réduction de 90 à 100 % de l’aflatoxine B un par rapport au témoin.Alors que l’ARNi 2 88 74 a montré une réduction de 60 à 100 % des deux aflatoxines. Suite à cette procédure, les mêmes extraits de graines peuvent être utilisés pour analyser le phyto Xin afin de mieux comprendre la réponse des graines à l’invasion fongique. Cette méthode fournira également un outil unique pour aider à développer la technologie de l’ARN pour le contrôle des mycotoxines.

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Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut /

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