Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

L’objectif global de cette procédure est de produire des matériaux biomimétiques constitués d’adhérences recombinantes pures, couplées à des billes de polystyrène, qui peuvent ensuite être utilisés pour disséquer les interactions biochimiques et fonctionnelles entre les adhérences bactériennes individuelles et les récepteurs de la cellule hôte. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions hôte-pathogène, telles que la mesure des effets sur la signalisation de la cellule hôte et l’inhibition de la cytotoxicité induite par l’agent pathogène. Le principal avantage de cette technique est que les adhérences purifiées, a AEA, sont couplées de manière directionnelle et covalente à des particules de polymère de taille similaire à celle des bactéries et imitent ainsi l’affichage de la surface bactérienne.

La démonstration de la procédure avec moi sera assurée par un doctorant de notre laboratoire. Le couplage directionnel de l’amine thalique sera démontré ici. Ce protocole convient au couplage de protéines contenant de la cystine à des billes de polymère fonctionnalisées à l’aide de SUL succinyle pour le butyrate de phényle de p meli, ou SMPB En tant qu’agent de réticulation, préparez tous les réactifs nécessaires juste avant l’utilisation comme décrit dans le texte du protocole pour commencer la procédure d’activation des billes.

Mélangez une suspension de billes en l’inversant doucement, puis transférez la quantité requise de suspension de billes dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Contenant un millilitre de PBS stérile pH 7,0, pipetez doucement de haut en bas pour laver les billes et les granulés par centrifugation dans une micro-centrifugeuse. Retirez soigneusement le piège à l’aide d’une pipette et d’une cicatrice.

Reese suspend la pastille de bille dans un millilitre de PBS frais et stérile et répète l’étape de lavage. Remettez la bille en suspension Dans 0,8 millilitres de PBS, ajoutez 200 microlitres de SFO SMPB de 10 millimolaires fraîchement préparé.

Pour obtenir une concentration finale de deux millimolaires, incubez la suspension des billes pendant une heure à 25 degrés Celsius sur une roue rotative pendant que les billes sont en incubation. Préparez la protéine pour l’étape de couplage suivante afin qu’elle puisse être immédiatement ajoutée aux billes activées. Vérifiez la concentration en protéines et ajustez-la à la concentration finale requise pour la réaction de couplage. Six.

Des micromolaires de protéines et de PBS et un volume d’un millilitre sont généralement utilisés pour la réduction des protéines. Ajouter une solution mère TEP pour obtenir une concentration finale de cinq millimolaires. Incuber la solution pendant 30 minutes À température ambiante, conserver quelques microlitres de la solution protéique pour déterminer la concentration initiale en protéines et un calcul de l’efficacité du couplage.

Démarrez la procédure de couplage des protéines en granulant les billes activées et en lavant la pastille. Une fois dans un millilitre de PBS frais et stérile, remettre la pastille en suspension dans la solution protéique préparée pour obtenir la concentration protéique souhaitée. Incuber la suspension de billes de protéines pendant deux heures à 25 degrés Celsius sur une roue rotative Après deux heures, désactivez les groupes activés restants sur les billes en ajoutant une solution mère Sixtine à une concentration finale de 50 millimolaires et en incubant en suspension pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius sur une roue rotative.

Maintien des billes par centrifugation. Conservez le snat pour déterminer la concentration en protéines et calculer l’efficacité du couplage. Lavez la pastille de billes deux fois avec un millilitre de PBS et de Resus bend et un millilitre de PBS frais pour donner le produit final un jour avant l’essai de compétition : semer chaque puits d’une plaque de 24 puits avec un millilitre de cellules hela à une concentration de 150 000 cellules par millilitre.

Cela permettra aux cellules d’atteindre environ 80 % de fluidité avant de commencer l’expérience. Inoculez une culture marine de cinq millilitres de LB avec une colonie fraîche de V para hémolytique et cultivez pendant la nuit à 30 degrés Celsius en secouant. Préparez suffisamment de molécules d’adhésion multivalente couplées à des billes, comme démontré précédemment.

Prévoyez 100 microlitres de 10 x stock de billes par puits ou une concentration finale de 500 protéines nanomolaires le jour de l’essai de compétition. Mesurer la DO 600 de la culture bactérienne. Préparez le milieu infectieux en diluant les cultures bactériennes dans du DMM incolore sans additifs.

Préchauffer à 37 degrés Celsius avec 10 % de suspension de battement de volume à volume. Pour obtenir un MOI de 10, préparez un millilitre par puits et 10 à 20 % de volume excédentaire par échantillon. Retirez l’ancien milieu des puits et lavez les produits cultivés.

Guérissez les cellules en ajoutant à chaque puits un millilitre de PBS stérile préchauffé à 37 degrés Celsius. Retirez le PBS et ajoutez un millilitre de milieu d’infection par puits. Ajouter des solutions contenant des billes de contrôle et des bactéries comme témoins positifs et des billes d’adhérence et aucune bactérie comme négative. Contrôles.

Ajoutez du DMM contenant 0,1 % de TRITTON X 100 comme contrôles de lyse. Mettre en place chaque condition expérimentale, y compris les contrôles, en trois exemplaires. Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant la durée souhaitée.

La cytotoxicité est évaluée. Quatre heures après l’infection. Retirez 200 microlitres de chaque puits utilisé dans la plaque de 24 puits et transférez-les sur une nouvelle plaque de 96 puits.

Faites tourner la plaque à 96 puits à 1 500 G pendant cinq minutes et transférez 100 microlitres de chaque puits dans une nouvelle plaque à 96 puits. Ajoutez 100 microlitres du milieu utilisé lors des expériences d’infection à trois puits frais de la plaque de 96 puits à utiliser comme blancs. Effectuer le test de libération de lactate déshydrogénase à l’aide d’un kit de détection de cytotoxicité LDH et en suivant les instructions du fabricant.

Tout d’abord, calculez la quantité de réactif nécessaire par incréments de 25. Par exemple, pour 100 échantillons. Mélangez 11,25 millilitres de réactif A avec 250 microlitres de réactif B inversé pour éviter la formation de mousse, ne vortex pas.

Ensuite, mettez le mélange dans un réservoir. Ajoutez ensuite 100 microlitres du mélange de réactifs à chaque échantillon et incubez la plaque à température ambiante pendant 10, 20 et 30 minutes. Lire l’absorbance à 490 nanomètres sur un lecteur de plaques.

Par la suite, calculez le pourcentage de cytotoxicité tel que décrit dans le manuscrit, les mesures de l’adhésion bactérienne sont effectuées une heure après l’infection. Retirez le milieu de la couche cellulaire et lavez soigneusement la couche cellulaire avec du PBS préchauffé stérile pour éliminer toutes les cellules non attachées. Lavez au moins trois à quatre fois avec un millilitre de PBS chaque fois que vous vous rendez aux cellules hôtes en ajoutant à chaque puits un millilitre d’une solution stérile de Triton X 100 à 1 % de volume à volume dans du PBS, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pipetez chaque échantillon de haut en bas plusieurs fois avant de transférer le contenu de chaque puits pour le séparer. Tubes de 1,5 millilitre. Préparez des dilutions en série de dix fois les échantillons dans une plaque PBS stérile, 100 microlitres de chaque échantillon sur une gélose LB marine et étalez-les à l’aide d’un épandeur de cellules, optimisez la dilution à mettre en plaque en fonction des souches bactériennes et du moment de cette configuration expérimentale.

Une dilution de 10 à la cinquième ou de 10 à la sixième fois donnera un nombre approprié d’UFC. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit du lendemain, dénombrer les bactéries par comptage de colonies. Dans les essais de compétition, les cellules heela ont été infectées par la souche para-hémolytique V.

Médiocre indiqué avec positif ou laissé non infecté en présence de différentes entités concurrentes. L’infection in vitro avec une mauvaise billes a entraîné des niveaux très élevés de lyse cellulaire qui a été inhibée par les billes couplées MAM 7, mais pas par les billes couplées MA’AM One ou GST. Dénombrement de v paralytique attaché soit à des cellules HELOC non traitées, soit à des cellules incubées avec MAM.

Sept billes de contrôle MAM un ou GST ont révélé que MAM. Sept perles, mais pas une MAM ou des perles de contrôle de la TPS. Surpasser v para hémolytique pour la fixation aux récepteurs de surface de la cellule hôte.

Adhérences couplées à des fluorés. Quatre billes marquées peuvent imiter l’adhésion bactérienne aux cellules hôtes et sont des outils puissants pour l’imagerie cellulaire. Le tube de droite contient une suspension de perles biomimétiques bleu fluo. Mam.

Sept billes bleues fluorescentes couplées ont été utilisées pour caractériser le processus de fixation médiée par la MAM sept aux cellules épithéliales. La fixation de MAM sept aux cellules hôtes a entraîné des réarrangements de l’actine et la formation de fibres de stress qui ont été co-visualisées à l’aide de Rumine Phin pour colorer l’actine f. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la purification d’affinité couplée à la protéomique ou au western blot peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les facteurs cellulaires de l’hôte impliqués dans les processus de signalisation en aval de l’attachement bactérien.