Mesure Phagosome pH par Ratiométrique microscopie à fluorescence

L’objectif général de cet ensemble d’expériences est de mesurer le pH phaco-somal dans des cellules vivantes à l’aide de la microscopie à fluorescence métrique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des phagocytes, telles que l’identification de molécules clés dans les interactions entre les agents pathogènes ou l’effet d’une perturbation génétique ou de médicaments sur la phagocytose. Le principal avantage de cette technique est que, contrairement aux méthodes basées sur la population, telles que les faits ou la spectroscopie, des effets tels que des changements dans la migration de liaison aux particules ou dans l’hétérogénéité des phagosomes individuels peuvent être détectés.

L’implication de cette technique s’étend à nos thérapies contre les organismes chimiques pathogènes, car beaucoup de ces micro-organismes peuvent modifier le pH de Fragoso afin d’éviter la distraction à l’intérieur des phagosomes. Pour commencer cette procédure, ajoutez 20 milligrammes de Xan séché à 10 millilitres de vortex PBS stérile et chauffez dans un bain d’eau bouillante pendant 10 minutes. Puis refroidir et centrifuger à 2000 Gs pendant cinq minutes.

Après cela, retirez le surnageant et remettez le Xan en suspension dans un millilitre de PBS. Sonicez-le pendant 10 minutes au bain-marie. Sonicate transfère ensuite 500 microlitres de Xan remis en suspension dans deux tubes de 1,5 millilitre et les centrifuge à 11 000 G pendant cinq minutes.

Répétez le lavage avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, lavez le Xan deux fois dans 500 microlitres de solution de carbonate de sodium 0,1 molaire fraîchement préparée à pH 9,3 et en suspension dans 490 microlitres de solution de carbonate de sodium après le lavage final. Par la suite, ajoutez 10 microlitres de FZ dissous dans du DMSO à raison de 10 milligrammes par millilitre dans le vortex Xan.

Couvrir d’une feuille d’aluminium et incuber en agitant pendant quatre heures à température ambiante Pour enlever l’œil délié, lavez d’abord avec 0,5 millilitre de DMSO plus 150 microlitres de PBS, y compris la sonication entre les étapes de lavage. Laver ensuite avec 0,5 millilitre de DMSO plus 300 microlitres de PBS, puis laver avec 0,5 millilitre de DMSO plus 450 microlitres de PBS suivi de PBS seul. Après cela, ajoutez un microlitre de Xan à 500 microlitres de PBS et de vortex.

Ajoutez ensuite 10 microlitres de sable de Xma dilué sur le bord de la chambre du cytomètre hémologique à l’endroit où il rencontre la lamelle, montez le cytomètre hémologique sur un microscope à fond clair équipé d’un objectif 20 x. Concentrez-vous sur le coin supérieur gauche contenant 16 carrés et comptez toutes les particules de sable de Noël dans cette zone. À l’aide d’un compteur de pointage manuel, répétez la procédure dans le coin inférieur droit.

Calculez ensuite la concentration en Xan à l’aide de cette équation. Ensuite, opsonisez le Xan marqué avec l’anticorps anti-Xan enragé dans un vortex de dilution de un à 100 et incubez l’échantillon pendant une heure dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Par la suite, comptez le sable de Noël à l’aide d’un hémocytomètre, puis dilué à 100 fois 10 à la sixième particules par millilitre.

Après avoir isolé les neutrophiles primaires de souris, ajoutez deux fois 10 à un cinquième des neutrophiles au centre d’une parabole à fond de verre de 35 millimètres. Ensuite, étalez la goutte en ajoutant 50 microlitres de milieu et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour permettre aux cellules d’adhérer. Ensuite, ajoutez un millilitre de HBSS chaud à 37 degrés Celsius contenant un inhibiteur de myélo peroxydase.

Montez la parabole sur un microscope à fluorescence à grand champ, équipé d’un système de chauffage à 37 degrés Celsius et d’un objectif à huile 40x. Incuber les cellules sans imagerie pendant 10 minutes pour permettre aux cellules et à l’équipement de s’équilibrer. Ensuite, ajustez les paramètres du microscope pour acquérir une image de transmission en fond clair avec une excitation de 440 nanomètres ou 490 nanomètres et une émission de 535 nanomètres toutes les 30 secondes.

Après deux minutes, ajoutez 10 fois 10 au sable fitzy zy au centre de la parabole et continuez l’imagerie pendant 30 minutes. Au bout de 30 minutes, arrêtez l’acquisition du time-lapse et démarrez un minuteur. Déplacez la platine et capturez 10 instantanés ou plus dans différents champs de vision pour imager d’autres zones vaga en cinq minutes.

Dans cette procédure, décongelez les solutions d’étalonnage et réchauffez-les à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Vérifiez le pH à l’aide d’un pH-mètre et notez-le. Montez ensuite une pompe péristaltique sur la parabole à fond de verre avant l’acquisition de l’image.

Effectuez ensuite une microscopie vidéo en direct à la fin de la période d’acquisition de 30 minutes. Allumez la pompe pour éliminer la solution dans le plat. Ensuite, ajoutez un millilitre de la première solution d’étalonnage et arrêtez la pompe.

Attendez cinq minutes jusqu’à ce que le signal se stabilise. Répétez la procédure avec chaque solution d’étalonnage. Pour analyser les vidéos en accéléré et les instantanés phagosomes, ouvrez les images avec l’image J.Soustrayez l’arrière-plan dans le canal 490 en dessinant une petite ROI carrée dans une zone sans cellules.

À l’aide de l’outil de sélection de polygones carrés et en cliquant sur les plugins. Puis soustraction BG par la suite. Téléchargez le même retour sur investissement sur le canal 440 en cliquant sur modifier.

Puis sélection suivie de restaurer la sélection et de répéter la procédure de soustraction d’arrière-plan. Faites une image au rapport de 32 bits du canal 490 divisé par le canal 440 en cliquant d’abord sur le processus. Puis calculateur d’image.

Après cela, sélectionnez les images appropriées dans les menus déroulants de l’image un et de l’image deux. Sélectionnez diviser dans le menu déroulant de l’opération et cochez la case 32 bits du résultat. Après cela, remplacez la table de correspondance de codage des couleurs par un codage de couleur compatible avec les rapports en cliquant sur image, puis sur les tables.

Puis arc-en-ciel RGB. Définissez un seuil pour que le rapport de l’image élimine les pixels zéro et infini en cliquant sur l’image. Ajustez ensuite suivi du seuil.

Ajustez les barres de défilement de sorte que le Xan apparaisse en rouge et cliquez sur Appliquer, puis assurez-vous que la case Définir les pixels d’arrière-plan sur nan est cochée. Si les valeurs d’arrière-plan et de signal Xan produisent des valeurs de rapport très similaires, ce qui donne une image de rapport bruyante, rajoutez une petite quantité d’arrière-plan au canal 440 en cliquant sur Traiter. Puis les mathématiques.

Ensuite, ajoutez, puis refaites l’image de rapport pour obtenir un résultat plus net. Vous pouvez également omettre la soustraction d’arrière-plan de 440 canaux. Ensuite, combinez cette pile de rapports avec un canal en fond clair dans un composite multicanal en cliquant sur la couleur de l’image.

Fusionnez ensuite les canaux. Sélectionnez l’image en fond clair dans le menu déroulant des canaux gris et l’image de rapport dans le menu déroulant des canaux verts. Cochez ensuite la case Conserver les images sources.

Ensuite, parcourez les vidéos en accéléré ou les instantanés comparant les canaux en fond clair et en rapport pour déterminer quels phagosomes doivent être analysés, dessinez une ROI autour des phagosomes à l’aide de l’outil de sélection de polygones ovales et ajoutez-les au gestionnaire de ROI en cliquant sur Outils d’analyse. Ensuite, le gestionnaire de retour sur investissement, suivi de l’ajout, puis de la mesure de leur rapport d’intensité Xan en cliquant sur plus de multi-mesure et en désélectionnant la case à cocher une ligne par tranche. Pour les vidéos en accéléré.

Suivez les zones FGA une par une en dessinant un contrôle de type ROI M pour mesurer chaque point temporel et déplacer le ROI si nécessaire pour suivre les valeurs d’intensité au fil du temps. Copiez ensuite les mesures de la fenêtre des résultats dans une feuille de calcul pour convertir la fluorescence en valeurs de pH. Après avoir mesuré le rapport 490-440 pour les phagosomes dans les vidéos d’étalonnage en accéléré dans une feuille de calcul, tracez les valeurs de rapport au fil du temps.

Calculez ensuite les valeurs moyennes du rapport pour tous les phagosomes dans le champ de vision à cinq points temporels au milieu de la période correspondant à chaque solution d’étalonnage du pH. Tracez ces valeurs moyennes de rapport de 490 à 440 par rapport au pH réel mesuré en combinant au moins trois étalonnages indépendants dans un seul graphique. Effectuez ensuite une analyse de régression non linéaire afin d’obtenir une équation permettant de transformer les valeurs de rapport en pH.

Cette figure montre comment on distingue les phagosomes et le Xan ingéré. Le panneau de gauche montre une image en fond clair fusionnée et un rapport de Fitz et un rapport de 490 à 440. Alors que le panneau de droite affiche l’image en fond clair seule.

Les phagosomes peuvent être distingués des particules externes qui ne se localisent pas avec les cellules ou dont la fluorescence ne correspond pas à un centre sombre entouré d’un anneau plus brillant caractéristique des phagosomes dans l’image en fond clair montrée. Voici les évolutions temporelles typiques du type sauvage et du neutrophile knock-out HV CN one FGA pH omal dans les neutrophiles de type sauvage, le pH neu neutre ou légèrement alcalin pendant les premiers points temporels Après l’ingestion, les phagosomes des neutrophiles knock-out HV CN one peuvent être compilés de manière alcaline ou acide. Les instantanés pris 30 à 35 minutes après l’ajout des cibles permettent de calculer le pH moyen de la population à partir d’un grand nombre de phagosomes dans les histogrammes des rapports de Fitz Xan présentés ici.

Nous avons pu voir les différences de pH minimes entre le type sauvage et les neutrophiles knock-out HVCN Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures. En commençant par l’étape d’optimisation lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’optimiser les conditions d’imagerie. Tout d’abord, l’optimisation de la concentration d’anticorps pour l’étape d’optimisation peut également être utile pour assurer une phagocytose robuste après cette procédure.

D’autres méthodes, telles que la mesure de la production de Ross ou la mesure de la destruction bactérienne, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la question de savoir si le Ross petit ou la capacité du phagosome à tuer les bactéries est altéré en même temps que le pH après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des phagocytes pour explorer les facteurs qui influencent la capacité des cellules phagocytaires à tuer ou à traiter les matériaux ingérés pour susciter d’autres réponses immunitaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la microscopie géométrique à fluorescence afin de mesurer les paramètres physiologiques des phagosomes en temps réel dans des cellules vivantes.

N’oubliez pas que travailler avec des inhibiteurs d’UNIFOR et des cellules vivantes peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.