Name: Mesure Phagosome pH par Ratiométrique microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Apprenez à mesurer le pH des phagosomes dans les cellules vivantes par microscopie à fluorescence ratiométrique. Cette technique permet de suivre les changements de pH en temps réel et d'analyser l'hétérogénéité individuelle des phagosomes.

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Les auteurs sont soutenus financièrement par le Fonds national suisse de la recherche scientifique par le biais d’une subvention de fonctionnement N° 31003A-149566 (à N.D.), et par le Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust par le biais d’une subvention pour jeunes chercheurs (à P.N.).

Déclaration éthique: Toutes les manipulations d&#39;animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les directives du Comité de recherche animale de l&#39;Université de Genève. 1. Préparation des cibles phagocytaires <ol><li> Ajouter 20 mg de zymosan séché à 10 ml de solution saline stérile de phosphate tamponnée (PBS). Vortex et à la chaleur dans un bain d&#39;eau bouillante pendant 10 min. Refroidir et centrifuger à 2000 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de PBS et de traitement par ultrasons pendant 10 minutes dans un sonicateur à bain-marie. Transférer 500 ul de deux tubes de 1,5 ml. Centrifuger à 11 000 g pendant 5 min. </li><li> Répétez le lavage avec 500 pi de PBS. Le zymosan bouillie peut être aliquoté, congelé et stocké à -20 ° C. </li><li> Laver deux fois le zymosan dans 500 ul fraîchement préparées 0,1 M de Na 2 CO 3, pH 9,3 comme ci-dessus (étape 1.2). </li><li> Remettre en suspension dans 490 pi après le lavage final. Ajouter 10 ul de 10 mg / ml dissous dans FITC diméthyl sulfoxide (DMSO), vortex, couvrir de papier, et incuber sous agitation pendant 4 heures à température ambiante. </li><li> Pour supprimer le colorant non lié, laver comme ci-dessus (étape 1.2), d&#39;abord avec 0,5 ml de DMSO + 150 pi de PBS, puis 0,5 ml de DMSO + 300 pi de PBS, puis 0,5 ml de DMSO + 450 pi de PBS, puis PBS seul. </li><li> Comptez zymosane utilisant un hémocytomètre. Ajouter 1 pi de zymosan à 500 ul de PBS, vortex, puis ajouter 10 ul du bord de la chambre d&#39;hémocytomètre, où elle rencontre la lamelle couvre-objet placé sur la grille centrale. Montez le hémocytomètre sur un microscope à champ lumineux équipé d&#39;un objectif 20X. </li><li> Concentrez-vous sur le coin supérieur gauche contenant 16 carrés et compter toutes les particules de zymosan dans ce domaine en utilisant un compteur à main. Répéter l&#39;opération avec le coin inférieur droit. Calculer la concentration zymosane utilisant l&#39;équation suivante: concentration Zymosan = comte / 2 x 500 x 10 4 zymosane / ml. Zymosane marqué peut être aliquoté, congelé et stocké à -20 ° C. </li><li> Opsoniser le wi zymosane marquéth un anticorps anti-lapin zymosan à 1: 100 dilution. Vortex et incuber pendant 1 heure dans un bain d&#39;eau à 37 C °. Laver avec 500 pi de PBS comme ci-dessus (étape 1.2). Remarque: Le traitement par ultrasons est fortement recommandé, surtout après opsonisation, comme zymosane tend à former des amas qui peuvent rendre plus difficile l&#39;analyse plus tard. Opsonisation avec 65% v / v de sérum humain ou de rat peut être utilisé comme une alternative. </li><li> Comptez zymosane utilisant un hémocytomètre comme décrit dans les étapes 1,7-1,8, et diluer à 100 x 10 6 particules / ml. Opsonisation avec d&#39;autres stimulateurs phagocytaires, comme complément ou pas opsonisation, peut également être réalisé. </li></ol> 2. Live Video Microscopy <ol><li> Isoler neutrophiles primaires de souris comme décrit en détail par ailleurs 38. <ol><li> Vous pouvez également utiliser n&#39;importe quel type de cellule phagocytaire. Gardez neutrophiles sur la glace à Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640 milieu supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal (v / v), 200 U de pénicilline / streptomycin, à une concentration de 10 x 10 6 cellules / ml jusqu&#39;à utilisation. D&#39;autres types de cellules peuvent être ensemencées 1-4 jours avant. </li></ol></li><li> Ajouter 2 x 10 5 (20 ul) de neutrophiles au centre d&#39;une boîte à fond de verre 35 mm, étaler la goutte par addition de 50 ul de milieu et on incube à 37 ° C pendant 5 minutes pour permettre aux cellules d&#39;adhérer. </li><li> Ajouter 1 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) chauffé à 37 ° C contenant le MPO spécifique hydrazide inhibiteur de 4-aminobenzoïque (4-ABH, 10 M). MPO inhibiteurs non spécifiques, tels que l&#39;azoture de sodium (5 mM), peuvent également être utilisés mais ont récemment été suggéré d&#39;exercer des effets non spécifiques supplémentaires à pH 39. </li><li> Monter le plat sur un microscope à fluorescence à grand champ équipé d&#39;un système de chauffage C de 37 ° et un objectif de l&#39;huile 40X. Incuber les cellules sans imagerie pendant 10 minutes pour permettre aux cellules et du matériel à équilibrer. </li><li> Réglez les paramètres de microscope pour acquérir une image de transmission à champ lumineux [phaSE ou contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) si disponible] avec 440 nm ou 490 nm excitation et 535 nm émissions toutes les 30 secondes. </li><li> Ajuster le temps d&#39;exposition et la fréquence d&#39;acquisition en fonction du système de microscope pour éviter trop de photoblanchiment et de phototoxicité et en fonction de la question posée expérimentales. Commencez acquisition d&#39;image. </li><li> Après 2 minutes, ajouter 10 x 10 6 (50 pi) zymosan opsonisé FITC vers le centre du plat. Ajuster cible: ratios de cellules en fonction du type de phagocyte et cible utilisée. </li><li> Continuer imagerie pendant 30 min. Après 30 min d&#39;interrompre l&#39;acquisition time-lapse et commencer une minuterie. Déplacez la scène et capturer 10 ou plusieurs instantanés dans différents champs de vision à l&#39;image d&#39;autres phagosomes, tous à moins de 5 min. </li></ol> 3. étalonnage et de contrôle expériences <ol><li> Préparer les solutions d&#39;étalonnage de pH (recettes sont décrites dans le Tableau 1) avant le jour de l&#39;expérience et de geler en portions de 10 ml.Décongeler les solutions d&#39;étalonnage et chaude à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Vérifier le pH avec un pH-mètre et d&#39;enregistrer le pH réel de solutions. </li><li> Monter une pompe péristaltique sur le plat de fond de verre avant l&#39;acquisition de l&#39;image et effectuer la microscopie de la vidéo en direct, comme décrit ci-dessus (article 2). </li><li> A la fin de la période d&#39;acquisition de 30 min tourner sur la pompe pour éliminer la solution à l&#39;intérieur de la cuvette, ajouter 1 ml de la première solution d&#39;étalonnage et d&#39;arrêter la pompe. </li><li> Attendre que le signal se stabilise, habituellement de 5 min. Répéter l&#39;opération avec chaque solution d&#39;étalonnage. <ol><li> Effectuer au moins une calibration par jour expérimental, et étalonner en commençant par le plus haut et le pH de travail de manière séquentielle à la plus basse, ainsi que le pH de départ et de travail séquentiellement le plus bas vers le plus haut. </li></ol></li><li> A titre de témoin, ajouter 100 ul de 100 uM de l&#39;inhibiteur de la NADPH oxydase diphényl propionium iodure (DPI) dilué dans du HBSS à 900 ul de cellules dans du HBSS dans le fond plat en verre, etincuber pendant 10 min. </li><li> Commencez acquisition et ajouter zymosane comme ci-dessus (étape 2.7). Après 15 min de la phagocytose, ajouter 10 ul de 10 uM de l&#39;inhibiteur V-ATPase concanamycin A (ConcA) dilué dans du HBSS et continuer imagerie pour 15 minutes supplémentaires. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Analyse des films time-lapse et instantanés phagosome. Remarque: Les instructions suivantes sont spécifiques pour ImageJ. Étape par étape les instructions peuvent varier considérablement en fonction du logiciel utilisé, mais les fonctions décrites dans cette section sont disponibles dans la plupart des logiciels professionnels d&#39;analyse d&#39;image. <ol><li> Ouvrez les images avec un logiciel professionnel d&#39;analyse d&#39;image. Soustraire le fond dans le canal 490 en dessinant un petit ROI carré avec l&#39;outil de sélection de polygone carré dans une zone où il n&#39;y a pas de cellules, et en cliquant sur Plugins&gt; BG Soustraction de ROI. Ensuite, téléchargez le même retour sur investissement sur le canal 440 en cliquant sur Modifier&gt; Sélection&gt; Restaurer la sélection et répétez. </li><li>Faire un rapport d&#39;image 32 bits du canal 490 divisé par le canal 440 en cliquant sur Processus&gt; Calculatrice de l&#39;image ..., en sélectionnant les images appropriées dans les menus déroulants ci-Image1 et Image2, puis en sélectionnant &#39;Divide&#39; dans le menu déroulant Opération et la vérification de la case à cocher de résultat de 32 bits (float). </li><li> Modifiez la table de consultation codage couleur à un codage couleur ratio compatible en cliquant sur Image&gt; Tables de recherche&gt; arc RVB. Seuil de l&#39;image de rapport pour éliminer 0 et l&#39;infini pixels en cliquant sur Image&gt; Réglages&gt; Seuil .... Ajustez les barres de défilement pour que zymosane apparaît en rouge et cliquez sur Appliquer, faire que le jeu des pixels de fond à case Nan est sélectionné. </li><li> Combinez ce ratio pile avec le canal champ lumineux en un composite multi-canal en cliquant sur Image&gt; Couleur&gt; Fusionner les couches, et en sélectionnant l&#39;image lumineuse-champ dans le menu gris canal de la liste déroulante et le rapport d&#39;image dans le menu déroulant de la voie verte, et la sélection de laGardez images source case à cocher. Numérisation des films time-lapse ou des instantanés pour déterminer les phagosomes doivent être analysés. Le canal champ lumineux est utile pour cela. </li><li> Dessiner des régions d&#39;intérêt (ROI) en utilisant l&#39;outil de sélection de polygones ovale autour phagosomes, et les ajouter au gestionnaire de ROI en cliquant sur Analyse&gt; Outils&gt; Gestionnaire de ROI&gt; Ajouter. Mesurer leur ratio d&#39;intensité zymosane en cliquant sur Plus&gt; Multi-mesures et de-la sélection de la ligne par un chèque-boîte de tranche. </li><li> Pour les films time-lapse, piste phagosomes un à la fois en dessinant un retour sur investissement, en tapant Ctrl + M pour mesurer chaque point de temps, et en déplaçant le ROI lorsque cela est nécessaire pour suivre les valeurs d&#39;intensité au fil du temps. Copiez les mesures de la fenêtre de résultats dans un tableur. Remarque: L&#39;analyse de 15 (5 cours à temps par expérience x 3) expériences indépendantes est idéal, mais plus ou moins peuvent être nécessaires en fonction de la variabilité observée. Sauvegarde des Rois est toujours recommandé. Certains logiciels permettent REGI d&#39;imagestration et mise à jour dynamique de Rois, faciliter cette partie de l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Conversion de fluorescence à des valeurs de pH <ol><li> Mesurer le rapport 490/440 pour phagosomes dans les films time-lapse étalonnage comme décrit dans la section 4.1. </li><li> Dans une feuille de calcul, tracer les valeurs de ratio au fil du temps, et de calculer les valeurs moyennes du ratio de tous les phagosomes dans le champ de vue (généralement, entre 5-20) à partir de 5 points dans le temps dans le milieu de la période de temps correspondant à chaque étalonnage de pH solution. (Voir aussi les boîtes rouges dans la figure 5A.) </li><li> Tracer ces 490/440 valeurs de ratio moyen contre le pH mesurée réelle. Combinez au moins 3 étalonnages indépendants en un seul graphique. Utilisez un logiciel de statistique ou numérique pour effectuer une régression non linéaire (le meilleur de la courbe de forme), généralement à une équation sigmoïde. Note: Par exemple, dans la figure 5B l&#39;équation utilisée était une sigmoïde de Boltzmann [Y = Bottom + ((Haut-Bas)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], où les valeurs y sont les ratios 490/440, X sont les valeurs de pH et haut, en bas, les paramètres V50 et la pente sont calculées par le logiciel. </li><li> Utilisez l&#39;équation obtenue pour transformer les valeurs du rapport au pH. Remarque: Par exemple, sur la figure 5B l&#39;équation obtenue pour la courbe d&#39;étalonnage en présence d&#39;azoture de sodium est 490/440 Ratio = 1,103 + [(2,89 à 1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . La résolution de pH donne l&#39;équation suivante: pH = 6,993 à 0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que plus de temps que d&#39;autres méthodes, telles que la spectroscopie et FACS, qui emploient une stratégie similaire en utilisant un colorant sensible au pH couplé à des objectifs, mais mesurer le pH moyen d&#39;une population de phagosomes, microscopie offre plusieurs avantages. La première est que interne et externe lié, mais pas intériorisé, les particules peuvent être aisément distingué sans avoir à ajouter d&#39;autres produits chimiques, comme le bleu trypan ou des anticorps, pour étancher ou étiqueter par...

Phagocytose, le processus par lequel les cellules immunitaires innées engloutissent de grosses particules, a évolué à partir du mécanisme alimentaire des organismes unicellulaires, et implique de se lier à une cible, de l’envelopper d’une membrane et de pincer la membrane pour former une vacuole dans le cytosol appelée phagosome. Alors que la membrane phagosomale est dérivée de la membrane plasmique, le tri actif des protéines et des lipides, ainsi que la fusion avec les endomembranes lors de la formation du phagosome, transforment le phagosome en un organite distinct au sein de la cellule avec des propriétés dégradantes qui permettent la destruction, la neutralisation et la décomposition du matériel ingéré1-3. Ce processus, appelé maturation phagosomale, repose sur l’administration d’une foule d’enzymes protéolytiques et microbicides, y compris la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase qui transfère des électrons dans les phagosomes produisant l’oxydant fort O2- et son dérivé l’espèce réactive de l’oxygène (ROS) 2,4. 
Le pH luminal des phagosomes a une influence profonde sur plusieurs événements nécessaires à la fonction des phagosomes. Tout d’abord, le pH influence le trafic des endomembranes en général, car les changements conformationnels dépendants du pH des régulateurs du trafic transmembranaire modifient le recrutement des déterminants du trafic tels que Arfs, Rabs et les protéines de l’enveloppe vésiculaire, qui à leur tour définissent quelles vésicules peuvent fusionner avec les phagosomes 5 à 8. Deuxièmement, la composition ionique de la lumière phagosomale est également transformée à mesure que les phagosomes mûrissent, et certains transporteurs d’ions, tels que l’échangeur Na+/H+ ou les antiporteurs Cl-/H+ de la famille ClC, qui favorisent la fonction phagocytaire, reposent sur la translocation H+ 9,10. De même, la production de ROS est intimement liée au pH phagosomal. Les ROS et leurs sous-produits oxydants toxiques sont depuis longtemps reconnus comme cruciaux pour la destruction des phagosomes dans les neutrophiles 4, 11, 12, et il a été démontré qu’ils jouent un rôle essentiel dans d’autres phagocytes, notamment les macrophages, les cellules dendritiques (DC) et les amibes 13-16. La NADPH oxydase est une enzyme électrogène qui libère H+ dans le cytosol lorsque le NADPH est consommé, et qui nécessite le transfert simultané de H+ à travers les canaux HVCN1 compagnons le long des électrons transportés dans la lumière phagosomale, afin d’atténuer la dépolarisation massive qui conduirait autrement à l’auto-inhibition de l’enzyme 17-21. Enfin, plusieurs enzymes protéolytiques ont une activité optimale à différents pH, de sorte que les changements de pH phagosomal en fonction du temps peuvent influencer quelles enzymes sont actives et quand. L’importance du pH phagosomal est mise en évidence par des organismes tels que Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis et Salmonella typherium qui subvertissent la destruction phagosomale au moins en partie en modifiant le pH phagosomal de 22 à 24.
Chez les mammifères, les principaux phagocytes sont les neutrophiles, les macrophages et les cellules dendritiques, et selon le type de cellule, les changements de pH phagosomal en fonction du temps peuvent varier considérablement et semblent jouer des rôles différents. Dans les macrophages, une acidification forte et rapide médiée par la pompe à protons vacuolaire ATPase (V-ATPase) dépendante de l’ATP est l’un des facteurs clés médiant la destruction 25-27, ressemblant aux mécanismes présents dans les amibes qui utilisent la phagocytose comme mécanisme alimentaire 28. Dans ces cellules, on pense que l’activation des protéases acides joue un rôle clé. En revanche, la destruction des neutrophiles repose davantage sur les ROS ainsi que sur le HOCl produit par la myéloperoxydase (MPO)11, et le pH reste neutre ou alcalin pendant les 30 premières minutes, ne s’acidifiant que plus tard 29,30. Un pH neutre a été suggéré pour favoriser l’activité des protéases oxydatives telles que certaines cathepsines. Dans les DC, le pH phagosomal est controversé, certains signalant une acidification et d’autres un pH neutre ou alcalin de 31,32, mais les ROS et le pH peuvent profondément influencer la capacité de ces cellules à présenter des antigènes aux lymphocytes T, l’une de leurs principales fonctions 33. 
Il est important de noter que les hormones, les chimiokines et les cytokines peuvent produire des événements de signalisation qui induisent la maturation et des changements dans le comportement des phagocytes, et influencent à leur tour le pH phagosomal 34,35. De même, des médicaments, par exemple l’antipaludique chloroquine, qui est également envisagé pour les thérapies anticancéreuses 36, peuvent affecter le pH phagosomal et donc les résultats immunitaires. Ainsi, une variété de biologistes cellulaires, d’immunologistes, de microbiologistes et de développeurs de médicaments peuvent s’intéresser à la mesure du pH phagosomal lorsqu’ils cherchent à comprendre les mécanismes sous-jacents aux effets d’une perturbation génétique, d’un composé bioactif ou d’un micro-organisme particulier sur les réponses immunitaires innées et adaptatives. 
Nous décrivons ici une méthode de mesure du pH phagosomal dans les neutrophiles qui nous a permis de montrer l’importance du canal HVCN1 dans la régulation du pH phagosomal 19 des neutrophiles. La méthode est basée sur la propriété ratiométrique de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dont l’émission de fluorescence à 535 nm est sensible au pH lorsqu’elle est excitée à 490 nm mais pas à 440 nm 37. Lorsque ce colorant est couplé chimiquement à une cible, dans ce cas le zymosan, il peut être suivi à l’aide de la microscopie à fluorescence à champ large, où les cellules sont imagées pendant qu’elles phagocytent, et les changements de pH phagosomal sont mesurés en temps réel à mesure que le phagosome mûrit. Le pH réel est ensuite glané en effectuant une expérience d’étalonnage où les cellules qui ont phagocyté sont exposées à des solutions de pH différents contenant les ionophores nigéricine et monensin, qui permettent l’équilibre rapide du pH dans les phagosomes avec la solution externe. Les valeurs de rapport sont ensuite comparées au pH connu des solutions, une courbe d’étalonnage est construite par régression non linéaire et l’équation résultante est utilisée pour calculer le pH à partir de la valeur du rapport.

<table><tbody><tr><td>Poudre Zymosan A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Isothiocyanate de fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Différents fournisseurs existent</td></tr><tr><td>Anticorps anti-zymosan (réactif d’opsonisation des bioparticules Zymosan A)</td><td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 est un produit équivalent. Alternativement, le sérum à 25 % peut être utilisé comme réactif d’opsonisation.</td></tr><tr><td>Hydrazide 4-aminobenzoïque (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Toxique, utilisez des gants, il existe divers fournisseurs Chlorure</td></tr><tr>de<td>diphénylèneiodonium (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Toxique, utilisez des gants, il existe plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>Concanamycine A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Toxique, utilisez des gants, divers fournisseurs existent</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Toxique, utilisez des gants, il existe plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>Toxique, utilisez des gants, divers fournisseurs existent</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Toxique, utilisez des gants, différents fournisseurs existent</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank</td> Life <td>Technologies</td><td>14025092</td><td>La solution saline équilibrée de Ringer ou d’autres tampons physiologiques clairs peuvent être substitué.</td></tr><tr><td>Carbonate de sodium (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp ;</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>de N-méthyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp ;</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N&prime ;,N&prime ;,-acide tétraacétique (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp ;</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Il existe différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Éthanol absolu (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td> Il <td>existe</td></tr> <tr><td>différents fournisseursBoîtes de Pétri à fond en verre de 35 mm (Fluorodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi &micro ;-clear Boîtes ou lamelles avec chambres d’imagerie appropriées peuvent être remplacées</td></tr><tr><td>Bain-marie soniquant</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>Un sonicateur peut être utilisé à la place, il existe différents fournisseurs d’instruments</td></tr><tr><td>Héamocytomètre</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Il existe</td></tr> <tr><td>différents fournisseurs d’instrumentsMicroscope d’imagerie en direct à grand champ</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Il existe différents fournisseurs d’instruments, mais le microscope doit être capable d’imager respectivement 440/535 et 490/535 d’excitation/émission. Les configurations confocales à disque rotatif avec des capacités de fond clair peuvent être remplacées, mais le zymosan a tendance à se défocaliser plus souvent. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique (Dynamax RP-1)</td>Rainin <td>Il existe différents fournisseurs</td> <td>d’instruments</td><td></td></tr><tr><td>pH mètre</td><td>Schott Geräte GmbH</td><td></td><td>Différents fournisseurs d’instruments existent</td></tr><tr><td>Manual Counter</td><td>Milian SA</td><td></td> Il <td>existe différents fournisseurs d’instruments</td></tr></tbody></table>

mesure phagosome ph par ratiométrique microscopie à fluorescence

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

La phagocytose est un processus fondamental par lequel les cellules immunitaires innées engloutissent les bactéries, les cellules apoptotiques ou d&#39;autres particules étrangères dans le but de tuer ou neutraliser la matière ingérée, ou de le présenter comme antigènes et d&#39;initier des réponses immunitaires adaptatives. Le pH de phagosomes est un paramètre critique régulation de fission ou fusion avec endomembranes et l&#39;activation des enzymes protéolytiques, des événements qui permettent à la vacuole phagocytaire à mûrir dans une organelle dégradable. En outre, la translocation des ions H + est requis pour la production de niveaux élevés d&#39;espèces oxygénées réactives (ROS), qui sont essentiels pour la destruction efficace et signalisation à d&#39;autres tissus de l&#39;hôte. De nombreux agents pathogènes intracellulaires subvertissent assassinat phagocytaire en limitant l&#39;acidification du phagosome, soulignant l&#39;importance du pH dans phagosome biologie. Nous décrivons ici une méthode pour mesurer phagosomale quotientométrique pH dans les neutrophiles en utilisant l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué au zymosan que phagocytaire targETS, et imagerie des cellules vivantes. Le dosage est basé sur les propriétés de fluorescence du FITC, qui est refroidi par un pH acide lorsqu&#39;il est excité à 490 nm mais non lorsqu&#39;il est excité à 440 nm, ce qui permet la quantification d&#39;un rapport dépendant du pH, au lieu de fluorescence absolue, d&#39;un seul colorant. Un protocole détaillé pour réaliser in situ colorant étalonnage et la conversion de rapport aux valeurs réelles de pH est également fourni. Simple-dye méthodes ratiométriques sont généralement considérés comme supérieurs à longueur d&#39;onde unique ou protocoles de pseudo-ratiométrique double teinture, car ils sont moins sensibles aux perturbations telles que le blanchiment, les changements de focus, les variations de laser, et l&#39;étiquetage inégale, qui faussent le signal mesuré. Ce procédé peut être facilement modifié pour mesurer le pH dans d&#39;autres types de cellules phagocytaires, et zymosan peut être remplacée par toute autre particule contenant une amine, à partir de billes inertes à des micro-organismes vivants. Enfin, ce procédé peut être adapté pour utiliser d&#39;autres sondes fluorescentes sensibles à des gammes de pH ou d&#39;autres phagosomactivités al, ce qui en fait un protocole généralisé pour l&#39;imagerie fonctionnelle de phagosomes.

Voici les résultats représentatifs pour une expérience où le phagosome pH de neutrophiles de souris primaires isolées de la moelle osseuse de type sauvage ou Hvcn1 - / - les souris ont été comparés. Pour une expérience réussie, il est important d&#39;obtenir suffisamment phagosomes dans le champ de vision pendant toute la durée du film time-lapse, tout en évitant de trop nombreux phagosomes, qui sera ensuite plus difficile de segmenter lors de l&#39;analyse d&#39;image. La figure 1...

Le pH phagosomal influence la maturation des phagosomes, la production d’oxydants, la destruction des phagosomes ainsi que la présentation de l’antigène. Nous décrivons ici une méthode ratiométrique pour mesurer les changements de pH dans le temps et les paramètres finaux dans les phagosomes individuels des phagocytes vivants à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Mesure Phagosome pH par Ratiométrique microscopie à fluorescence

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

L'objectif général de cette série d'expériences est de mesurer le pH des phagosomes dans des cellules vivantes à l'aide de la microscopie de fluorescence en mode rapport métrique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des phagocytes, telles que l'identification de molécules essentielles impliquées dans les interactions avec les agents pathogènes ou l'effet de perturbations génétiques ou de médicaments sur la phagocytose. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité, contrairement aux méthodes basées sur des populations telles que les faits ou la spectroscopie, à détecter des effets tels que les changements dans la migration ou la liaison des particules, ou encore l'hétérogénéité des phagosomes individuels.Les implications de cette technique s'étendent à nos thérapies contre les organismes chimiques pathogènes, car bon nombre de ces micro-organismes peuvent modifier le pH de fragoso afin d'éviter la dégradation dans les phagosomes. Pour commencer cette procédure, ajoutez 20 milligrammes de Xan séché à 10 millilitres de PBS stérile, vortexez et chauffez dans un bain-marie bouillant pendant 10 minutes. Ensuite, refroidissez et centrifugez à 2000 Gs pendant cinq minutes.Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez les Xan dans un millilitre de PBS. Soniquez pendant 10 minutes dans un bain d'eau. Après la sonication, transférez 500 microlitres de la suspension de Xan dans deux tubes de 1,5 millilitre et centrifugez-les à 11 000 ×g pendant cinq minutes.Répétez le lavage avec 500 microliters de PBS. Ensuite, lavez deux fois les Xan avec 500 microliters de solution fraîchement préparée de carbonate de sodium 0,1 molaire à pH 9,3 et RÉSUSPENDUS dans 490 microliters de solution de carbonate de sodium après le dernier lavage. Par la suite, ajoutez 10 microliters de FZ dissous dans du DMSO à 10 milligrammes par millilitre au vortex des Xan.Couvrir avec du papier d’aluminium et incuber sous agitation pendant quatre heures à température ambiante. Pour éliminer l’œil non lié, effectuer un premier lavage avec 0,5 millilitre de DMSO additionné de 150 microlitres de PBS, en incluant une sonication entre les étapes de lavage. Ensuite, laver avec 0,5 millilitre de DMSO additionné de 300 microlitres de PBS, puis avec 0,5 millilitre de DMSO additionné de 450 microlitres de PBS, suivi de PBS seul. Par la suite, ajouter un microlitre de Xan à 500 microlitres de PBS et vortexer.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de sable xma dilué sur le bord de la chambre du cytomètre sanguin, là où elle rejoint la lame. Montez le cytomètre sanguin sur un microscope en champ clair équipé d'un objectif 20 x. Focalisez sur le coin supérieur gauche contenant 16 carrés, et comptez toutes les particules de sable xma présentes dans cette zone. À l'aide d'un compteur manuel, répétez la procédure sur le coin inférieur droit.Ensuite, calculez la concentration en Xan à l'aide de cette équation. Puis, opsonisez le Xan marqué avec l'anticorps anti-Xan à un dilution de un à 100, vortexez et incubez l'échantillon pendant une heure dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Comptez ensuite les particules Xmas à l'aide d'un hémocytomètre, puis diluez-les à 100 fois 10 à la puissance six particules par millilitre.Après avoir isolé les neutrophiles primaires de souris, ajouter deux fois 10 à la puissance cinq neutrophiles au centre d'une boîte de 35 millimètres à fond en verre. Ensuite, étaler la goutte en ajoutant 50 microlitres de milieu et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour permettre l'adhésion des cellules. Par la suite, ajouter un millilitre de HBSS préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius contenant un inhibiteur de la myéloperoxydase.Monter la boîte sur un microscope à fluorescence à grand champ, équipé d'un système de chauffage à 37 degrés Celsius et d'un objectif à immersion à 40 x. Incuber les cellules sans imagerie pendant 10 minutes afin de permettre l'équilibre des cellules et du matériel. Ensuite, régler les paramètres du microscope pour acquérir une image de transmission en champ clair avec une excitation à 440 nanomètres ou 490 nanomètres et une émission à 535 nanomètres toutes les 30 secondes.Après deux minutes, ajouter 10 fois 106 de fitzy zy sand au centre de la boîte, puis poursuivre l'acquisition d'images pendant 30 minutes. Après 30 minutes, arrêter l'acquisition en laps de temps et démarrer un chronomètre. Déplacer la platine et capturer 10 images ou plus dans différents champs pour visualiser d'autres zones vaga dans les cinq minutes suivantes.Dans cette procédure, décongeler les solutions d'étalonnage et les réchauffer à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre et l'enregistrer. Ensuite, monter une pompe péristaltique sur la boîte en verre avant l'acquisition d'images.Ensuite, effectuez une microscopie vidéo en direct à la fin de la période d'acquisition de 30 minutes. Activez la pompe pour éliminer la solution dans la boîte. Ajoutez ensuite un millilitre de la première solution d'étalonnage et arrêtez la pompe.Attendez cinq minutes jusqu'à ce que le signal se stabilise. Répétez la procédure avec chaque solution d'étalonnage. Pour analyser les films en accéléré et les images instantanées des phagosomes, ouvrez les images avec ImageJ. Soustrayez le fond dans le canal 490 en dessinant une petite région d'intérêt (ROI) carrée dans une zone sans cellules.Utiliser l'outil de sélection polygonale carrée et cliquer sur les greffons. Ensuite, soustraire le fond après coup. Téléverser la même zone d'intérêt sur le canal 440 en cliquant sur modifier.Ensuite, effectuez une sélection, puis restaurez la sélection et répétez la procédure de soustraction du fond. Créez une image de rapport en 32 bits du canal 490 divisé par le canal 440 en cliquant d'abord sur Traitement, puis sur Calculatrice d'image.Ensuite, sélectionnez les images appropriées dans les menus déroulants image un et image deux. Sélectionnez diviser dans le menu déroulant opération et cochez la case résultat 32 bits. Ensuite, modifiez la table de correspondance de codage couleur en un codage couleur compatible avec les rapports en cliquant sur image, puis sur tables.Ensuite, RGB arc-en-ciel. Définissez un seuil pour l'image de rapport afin d'éliminer les pixels ayant une valeur nulle ou infinie en cliquant sur l'image. Ajustez ensuite le seuil.Réglez les barres de défilement de manière à ce que la Xan apparaisse en rouge, cliquez sur « appliquer », et assurez-vous que la case « définir les pixels de fond à nan » est cochée. Si les valeurs du fond et du signal de la Xan produisent des rapports très proches, entraînant une image de rapport bruitée, ajoutez à nouveau une faible quantité de fond au canal 440 en cliquant sur « traiter », puis sur « mathématiques ».Ensuite, ajoutez, puis recréez l'image de rapport pour obtenir un résultat plus net. Sinon, omettez la soustraction du fond du canal 440. Ensuite, combinez cette pile de rapports avec un canal de champ clair pour former un composite multicanal en cliquant sur « couleur de l'image ».Ensuite, fusionnez les canaux. Sélectionnez l'image en champ clair dans le menu déroulant du canal gris et l'image de rapport dans le menu déroulant du canal vert. Cochez ensuite la case « conserver les images sources ».Ensuite, analyser les films en accéléré ou les instantanés comparant les canaux de champ clair et de rapport pour déterminer quels phagosomes doivent être analysés, dessiner une région d'intérêt (ROI) autour des phagosomes à l'aide de l'outil de sélection polygonale ovale et les ajouter au gestionnaire de ROI en cliquant sur les outils d'analyse, puis sur le gestionnaire de ROI, suivi de l'ajout. Mesurer ensuite leur rapport d'intensité Xan en cliquant sur « plus de mesures multiples » et désélectionner la case à cocher « une ligne par coupe ». Pour les films en accéléré.Suivez les zones de FGA une par une en dessinant un ROI de type contrôle M pour mesurer chaque point temporel et déplacez le ROI si nécessaire afin de suivre les valeurs d'intensité au fil du temps. Ensuite, copiez les mesures depuis la fenêtre des résultats vers un tableur pour convertir la fluorescence en valeurs de pH. Après avoir mesuré le rapport 490 sur 440 pour les phagosomes dans les films en laps de temps de calibration dans un tableur, tracez les valeurs du rapport en fonction du temps.Ensuite, calculez les valeurs moyennes du rapport pour toutes les phagosomes présentes dans le champ de vision à cinq points temporels situés au milieu de la période correspondant à chaque solution de calibration du pH. Reportez ces valeurs moyennes du rapport 490 sur 440 en fonction du pH mesuré réellement, en combinant au moins trois calibrations indépendantes sur un seul graphique. Effectuez ensuite une analyse de régression non linéaire afin d'obtenir une équation permettant de transformer les valeurs de rapport en pH.Cette figure montre comment distinguer les phagosomes des Xan ingérés. Le panneau de gauche présente une image en champ clair superposée à un rapport de fluorescence 490/440 nm. Le panneau de droite montre uniquement l’image en champ clair.Les phagosomes peuvent être distingués des particules externes qui n'interagissent soit pas avec les cellules, soit dont la fluorescence ne correspond pas à un centre sombre entouré d'un anneau plus brillant, caractéristique des phagosomes dans l'image en champ clair présentée. Voici les courbes temporelles typiques du pH des phagosomes chez les neutrophiles de type sauvage et chez les neutrophiles présentant une invalidation du gène HV CN un. Chez les neutrophiles de type sauvage, le pH est neutre ou légèrement alcalin durant les premiers instants. Après l'ingestion, les phagosomes des neutrophiles invalidés pour HV CN un peuvent devenir soit alcalins, soit acides. L'analyse d'images prises entre 30 et 35 minutes après l'ajout des cibles permet de calculer le pH moyen de la population à partir d'un grand nombre de phagosomes, comme illustré dans les histogrammes des rapports Fitz Xan présentés ici.Nous pouvions observer les différences de petit pH entre les neutrophiles de type sauvage et les neutrophiles avec invalidation du gène HVCN1. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures. À compter de l'étape d'optimisation, lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler d'optimiser les conditions d'imagerie. Premièrement, l'optimisation de la concentration en anticorps pour l'étape d'optimisation peut également être utile afin de garantir une phagocytose robuste en suivant cette procédure.D'autres méthodes, telles que la mesure de la production de ROS ou l'évaluation de la capacité bactéricide, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme savoir si le niveau de ROS ou la capacité du phagosome à tuer les bactéries est modifié en même temps que le pH après sa formation. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des phagocytes pour explorer quels facteurs influencent la capacité des cellules phagocytaires à tuer ou à traiter les matériaux ingérés afin d'induire des réponses immunitaires supplémentaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une microscopie de fluorescence géométrique afin de mesurer en temps réel, dans des cellules vivantes, les paramètres physiologiques des phagosomes.N'oubliez pas que le travail avec des inhibiteurs UNIFOR et des cellules vivantes peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Research

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Visualisation de la formation et de la fermeture des phagosomes par microscopie TIRF

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Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

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