Laser-microdissection de la prostate humaine épithélium pour l'analyse de l'ARN

L’objectif global de ce protocole de micro-dissection par capture laser est d’isoler l’ARN total de populations pures de types de cellules épithéliales prostatiques à partir de tissus prostatiques hétérogènes congelés pour des analyses d’expression génique en aval. Cette méthode peut aider à analyser des échantillons de patients et à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer de la prostate, telles que la façon dont l’expression de l’ARN diffère dans les échantillons de tissus prothéliales épithéliales bénins et pathologiques, ou dans les échantillons d’essais cliniques. Le principal avantage de cette technique est que la microdissection par capture laser permet d’isoler par ARN des populations homogènes de cellules épithéliales ou str à partir de tissus prostatiques congelés.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à acquérir un ARN de haute qualité parce qu’elles ne savent pas quelles étapes sont essentielles pour maintenir les ARN. Commencez par rassembler tous les réactifs et outils nécessaires à la procédure. Après avoir laissé le tissu prostatique congelé s’équilibrer à l’intérieur du cryostat pendant 30 minutes, injectez le milieu de montage dans le fond de la cassette et montez rapidement le tissu à l’aide d’une pince réfrigérée.

Placez la cassette dans le refroidisseur du cryostat pendant cinq minutes pour régler le support de montage. Une fois réglé, giclez le support de montage congelé sur le mandrin et appuyez soigneusement sur le tissu monté à l’intérieur. Bas vers le haut.

Laisser reposer la préparation pendant cinq minutes. Avant de placer le mandrin dans le support, verrouillez la poignée en position et insérez une nouvelle lame dans le cryostat. Après avoir déverrouillé la poignée, faites avancer l’échantillon avec précaution jusqu’à ce que l’exposition souhaitée des tissus soit atteinte.

Lorsque vous êtes prêt, ajustez le cryostat à cinq microns et coupez une ou deux sections. Placez ces sections sur une lame de verre chargée pour la coloration à l’hématine et à l’éoine. Placez immédiatement la lame dans du froid, 100 % éthanol pendant deux minutes.

Après ce temps, retirez la lame et laissez-la sécher à température ambiante. Les lames colorées h et d permettent une meilleure visualisation des textures nucléaires et doivent être utilisées par le pathologiste pour marquer les zones d’intérêt. Ensuite, placez un cadre de stylo à température ambiante.

Glissez-le dans un support de cadre, ajustez le cryostat à 10 microns et créez des sections. Une à quatre sections peuvent être placées sur chaque lame, en fonction de la taille du tissu. Plongez immédiatement la glissière dans du 100 % éthanol froid.

Retirez la lame au bout de deux minutes et conservez-la au congélateur pour une analyse ultérieure. Le jour même de la microdissection par capture laser, récupérez les lames du cadre du stylo du congélateur en travaillant dans une zone sans ARN. Hydratez les lames en les trempant doucement dans de l’éthanol à 90 % pendant deux minutes, puis dans de l’éthanol à 75 % pendant deux minutes.

Une fois hydraté, colorez le tissu prostatique en trempant doucement les lames dans du bleu toine à 0,5 % pendant cinq à 30 secondes. Maintenez le tissu en lavant les lames deux fois dans de l’eau profonde pendant 15 secondes, puis avec de l’éthanol à 75 % pendant 30 secondes à trois minutes. Enfin, transférez les lames du cadre du stylet dans un récipient sec sans ARN sur de la glace.

Avant de commencer la procédure, placez une lame à sécher sur un chauffe-lames pendant 15 minutes. Séchez uniquement la lame qui sera traitée et stockez le reste sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Allumez les composants LCM dans l’ordre suivant.

L’alimentation du microscope, la clé laser, l’interrupteur laser, puis l’ordinateur. Ensuite, lancez le logiciel de microdissection laser à l’aide du logiciel. Demandez au microscope de charger les lames et les tubes de prélèvement.

Cliquez sur décharger le porte-échantillon et chargez la lame sur le porte-lame avec le tissu vers le bas. Insérez le porte-lames dans la fente appropriée du microscope et cliquez sur Continuer. Ensuite, cliquez sur décharger les tubes de collecte.

Étiquetez et chargez les tubes sur le support de tube et insérez-les dans la fente appropriée. Fixez les bouchons et ajoutez 35 microlitres de tampon de lyse. En prenant soin d’éviter les bulles.

Une fois les plafonds de collecte chargés, cliquez sur OK. Utilisez le logiciel pour sélectionner la position de la lame dans le support, puis sélectionnez le capuchon de collecte pour prélever l’échantillon. Visualisez et faites la mise au point de la diapositive à travers l’ordinateur à un grossissement de 10 x.

Utilisez le logiciel pour calibrer le laser en sélectionnant laser. Ensuite, calibrez, ajustez l’ouverture de puissance et la vitesse du laser en sélectionnant laser, puis contrôlez. Continuez à faire des ajustements jusqu’à ce que le laser coupe complètement le tissu.

Il est crucial de décrire les zones d’intérêt généralement effectuées par un pathologiste certifié afin de disséquer avec précision les zones désirables du tissu soumis à la LCM en utilisant le balisage du pathologiste de huit par 11 h et e comme guide visuel. Utilisez l’outil de dessin de forme dans le logiciel pour circonscrire les zones souhaitées de l’épithélium dans la vue et éviter de collecter du stroma. Cliquez sur couper pour démarrer le laser.

Si une zone n’est pas complètement coupée, utilisez l’outil de déplacement et de coupe pour la parcourir manuellement. Continuez à déplacer l’objectif vers de nouvelles vues et répétez la découpe laser jusqu’à ce que la lame soit complètement disséquée ou que la quantité souhaitée de tissu ait été collectée. Une fois terminé, retirez soigneusement les tubes du support de collecte et fermez les bouchons en tenant compte de la lyse, du tampon et du tissu dans les bouchons.

Brièvement, centrifugez pendant 30 secondes pour recueillir le liquide et le tissu au fond du tube. Incuber les échantillons à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes et les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’isolement de l’ARN. Ces exemples montrent des coupes représentatives de la prostate colorées au bleu de toluidine sur une diapositive de cadre de stylo avant et après la capture au laser de contrôles spécifiques au type de cellule d’épithélium bénin.

Confirmez la spécificité de la zone du tissu capturée par laser. Épithélium et stroma bénins. N’exprimez pas le gène spécifique du cancer de la prostate, A-M-A-C-R.

Le stroma n’a pas exprimé le gène spécifique de l’épithélium et KX 3.1 lors de la tentative de cette procédure. Il est important de se rappeler de travailler dans un environnement exempt d’ARN pour éviter la dégradation de l’ARN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’ARN de populations homogènes de cellules épithéliales ou orageuses à partir de tissus congelés pour de nombreuses techniques d’analyse en aval.

N’oubliez pas que travailler avec un cryostat peut être extrêmement dangereux en termes de précautions, telles qu’une bonne formation et une très bonne attention à la lame doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.