A Cell Assay libre d'étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose

L’objectif global de cette expérience est de reconstituer fidèlement la chromatine de condensation telle qu’elle se produit à la fin de la mitose dans la simplicité d’un test acellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la recherche sur la mitose car elle permet de caractériser le mécanisme moléculaire de la chromatine, la décolonisation et l’identification du facteur impliqué dans la régulation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être facilement manipulée biochimiquement et la chromatine.

La décolonisation peut être étudiée isolément, séparée des autres événements du cycle cellulaire. Pour commencer, isolez des amas de chromatine mitotique à partir de cellules hélicoïdales et préparez les tampons pour la préparation de l’extrait d’œuf de Xenopus lavis IIC, comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Une fois préparé, utilisez une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 27 pour injecter 500 unités internationales de gonadotrophine chorionique humaine dans des grenouilles induites par l’ovulation.

Injectez les grenouilles sous la peau du sac lymphatique dorsal la veille de l’expérience pour induire la libération des œufs Une fois induits, maintenez les grenouilles à 18 degrés Celsius pendant 13 à 17 heures dans des réservoirs individuels contenant 1,2 litre de tampon de bagues modifiées de marque. Une fois que les grenouilles ont pondu leurs œufs, retirez les œufs qui sont déjà activés ainsi que tous les œufs de mauvaise apparence. Collectez-les en versant correctement les réservoirs dans des béchers en verre de 600 à 1000 millilitres.

Le tri des ovules est essentiel car la qualité supplémentaire globale dépend de l’étape. Retirez les œufs filandreux activés et d’apparence mauvaise. Également dans les étapes ultérieures, continuez à éliminer les mauvais œufs.

Décantez le surnageant S une fois que les œufs se sont déposés, puis remplissez le bécher avec un tampon frais par la suite. Répétez ce processus quatre fois pour laver les œufs après le dernier lavage. Retirez le supinate une fois de plus, puis remplissez le bécher d’une solution de cystéine à 2 % pour délimiter les œufs.

Après deux à quatre minutes, passez à un nouveau tampon contenant de la L-cystéine. Considérez que la gélification est terminée lorsque le volume des œufs diminue considérablement et que les œufs deviennent plus densément emballés après environ cinq à sept minutes. Ensuite, lavez soigneusement les œufs dans le tampon des bagues modifiées de Mark en décantant et en remplissant à nouveau le tampon de supinate sur la paroi du bécher au lieu de le déposer directement sur les œufs.

Activez ensuite les œufs dans 100 millilitres de tampon de bagues modifiées Marx contenant huit microlitres de deux milligrammes par millilitre. Ion calcium. Quatrièmement, arrêtez l’activation lorsque la contraction de la calotte de l’animal devient visible.

Ou après 10 minutes après l’activation, laver soigneusement les œufs dans la sonnerie modifiée de Mark’s, tamponner en décantant et en remplissant à nouveau le tampon en supinat après le dernier lavage. Incuber les œufs à température ambiante pendant 20 minutes dans le tampon de la sonnerie modifiée de Mark. Ensuite, préparez des tubes de centrifugation de cinq millilitres avec 50 microlitres de tampon de saccharose, 50 microlitres d’inhibiteur de protéase 100 fois.

Mélangez cinq microlitres d’une molaire DTT, 12,5 microlitres de cyclo heide et 2,5 microlitres de cyto. B.Lavez les œufs deux fois avec un tampon de saccharose froid, puis transférez-les dans les tubes de centrifugation. À l’aide d’une pipette de pâturage en plastique avec une large ouverture, emballez les œufs en faisant tourner les tubes pendant une minute à 130 G.Après la centrifugation, retirez l’excédent de tampon à l’aide d’une pipette de pâturage en plastique et remplissez l’espace supplémentaire avec plus d’œufs.

Ensuite, centrifugez les tubes remplis d’œufs dans un rotor pivotant de six millilitres sur cinq pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et 21 000 fois g. Une fois la solution séparée en trois couches, poussez une seringue de cinq millilitres avec une aiguille de calibre 16 sur le côté du tube et dans la couche intermédiaire entre le jaune jaune en haut et juste au-dessus des débris d’œufs brisés foncés en bas. Transférez l’extrait phasique à basse vitesse dans un tube frais sur de la glace, puis ajoutez 10 microlitres d’un inhibiteur de protéase 100 fois.

Mélangez un microlitre d’une molaire DTT 2,5 microlitres de cyclo heide à 20 milligrammes par millilitre et 0,5 microlitre de cyto B. Ajoutez 10 milligrammes par millilitre à chaque millilitre de l’extrait à basse vitesse. Faites tourner l’extrait phasique à basse vitesse pendant 12 minutes à 355 000 fois G dans un rotor de 10 millilitres sur deux. Ensuite, retirez délicatement la couche lipidique sur le dessus et transférez le supinate contenant l’extrait à grande vitesse dans un tube frais.

Cette étape est essentielle pour produire un échantillon de haute qualité. Veillez à ce que le liquide retiré ne contienne pas de contaminations de la couche lipidique supérieure ou de la couche inférieure gênante. Pipetez 18 microlitres de l’extrait à grande vitesse dans un tube de réaction de 1,5 millilitre, puis ajoutez 0,5 microlitre de glycogène 0,5 microlitre du mix énergétique.

Point trois, microlitres de six diméthylpurine, et 0,7 microlitre des amas mitotiques. Utilisez des pointes à large ouverture pour mélanger la réaction dès que la chromatine est ajoutée afin d’éviter le cisaillement de la chromatine décompensante. Une fois mélangé, incubez le mélange réactionnel jusqu’à deux heures à 20 degrés Celsius.

Ensuite, fixez l’échantillon en ajoutant 0,5 millilitre de fixateur glacé contenant 4 % de paraldéhyde, 0,5 % de glutaraldéhyde et 0,1 milligramme par millilitre dpi. À l’aide d’embouts à large ouverture, incubez l’échantillon sur de la glace pendant 20 à 30 minutes. Ensuite, codez des lamelles rondes de 12 millimètres avec une solution de poly L lysine de 0,1 % en poids et volume et incubez les lamelles pendant cinq minutes pour augmenter l’affinité des lamelles de protection.

Pour sécher à la chromatine, le couvercle se glisse ensuite sur du papier filtre. Une fois secs, ajoutez les lamelles revêtues au fond de tubes de centrifugation à fond plat de six millilitres de manière à ce que le côté revêtu soit vers le haut. Ajoutez ensuite 800 microlitres du coussin à 30 % de saccharose et superposez l’ensemble de l’échantillon fixé.

Faites tourner l’échantillon pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et 2 500 fois G.Ensuite, décampez le surnageant S et retirez les lamelles des tubes en enfonçant soigneusement le fond du tube de centrifugation avec une aiguille de calibre 16. Lorsque la lamelle est soulevée par l’aiguille d’un côté, utilisez une pince à épiler pour retirer la lamelle, lavez-la rapidement en la trempant dans de l’eau déminéralisée, puis séchez-la doucement en touchant son côté sur du papier filtre. Ensuite, placez une goutte de support de montage sur une lame de microscope et abaissez le côté échantillon du couvercle.

Glisser sur le support de montage. Séchez délicatement la lamelle avec un tampon en papier sur le pourtour du bord de la lamelle avec du vernis à ongles et maintenez la lame dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elle soit imagée. Voici l’évolution temporelle typique du test de décompensation.

L’amas de chromosomes visible au début de la réaction, se décon, se condense et fusionne en un seul noyau rond et lisse. Lorsque l’extrait d’œuf est remplacé par un tampon de saccharose, l’amas de chromosomes reste condensé, ce qui suggère que l’activité de décompensation est présente dans l’extrait d’œuf. Dans l’expérience présentée ici, des analogues non hydrolysés de A TP ou de GTP ont été ajoutés à la réaction.

Ces deux additifs inhibent la décondensation, prouvant que ce processus actif dépend à la fois de l’hydrolyse de A TP et de GTP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures pour la préparation de l’extrait d’œuf de Singapour, et en trois heures pour le test de promotion de la colonisation. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le succès dépend essentiellement de la qualité de l’extrait.

En particulier pour les immunodéplétions, il est recommandé d’utiliser un extrait fraîchement préparé après cette procédure. D’autres méthodes telles que l’immuno-appauvrissement et l’ajout de protéines recombinantes peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les facteurs impliqués. Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans les domaines de la mitose ou de la structure et de la fonction nucléaires pour explorer la déshumanisation de la chromatine telle qu’elle se produit à la fin de la mitose dans les cellules animales.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des extraits d’œufs de foie de xénope et comment appliquer la méthode de reconstitution de la décolonisation de la chromatine. N’oubliez pas que travailler avec Paraform Hyde, Hyde et DARPA peut être dangereux et que des précautions doivent être prises, comme porter des gants.