Name: A Cell Assay libre détudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Découvrez un test cellulaire sans cellules pour étudier la décondensation de la chromatine à la fin de la mitose en utilisant des cellules HeLa et des extraits d'œufs de Xenopus laevis. Cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires impliqués.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche et l&#39;ERC (AN377 / 3-2 et 309528 CHROMDECON à WA) et d&#39;un doctorat de la Bourse Boehringer Ingelheim Fonds AKS Figure 1 &amp; 2 sont reproduites à partir de Developmental Cell 31 (3), Magalska et, la fonction des ATPases RuvB-comme dans décondensation de chromatine à la fin de la mitose, 305-318 2014 al., avec l&#39;aimable autorisation de Elsevier.

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+DNA+replication+and+chromatin+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins.</a> Methods. 57, 203-213 (2012).</li>
<li>Gant, T. M., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).</li>
<li>Magalska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvB-like+ATPases+function+in+chromatin+decondensation+at+the+end+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis.</a> Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).</li>
<li>Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+structure+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome structure and condensation.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).</li>
<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Xenopus laevis extraits d&#39;œufs sont un outil très utile pour reproduire fidèlement les processus cellulaires in vitro, et ce système a été utilisé avec succès dans la caractérisation des événements du cycle cellulaire et la division cellulaire 2, 3,5,6,17. En raison de grands magasins de composants nucléaires séquestrés dans l&#39;œuf cours de l&#39;ovogenèse, extraits d&#39;œufs sont une excellente source de composants cellulaires. Comparé à d&#39;autres approches comme ARNi ...

Xenopus laevis extrait d&#39;oeuf est un outil puissant et largement appliquée pour étudier les événements cellulaires complexes dans la simplicité d&#39;un essai acellulaire. Depuis leur première description par une Lohka &amp; Masui ils ont été largement utilisés pour étudier les processus mitotiques telles que la condensation de la chromatine 2, l&#39;assemblage de broche 3, l&#39;enveloppe nucléaire ventilation 4, mais également transport nucléocytoplasmique 5 ou 6 replication de l&#39;ADN. Les événements qui se déroulent à la fin de la mitose, nécessaires pour la réforme du noyau interphasique tels que la réforme de l&#39;enveloppe nucléaire et pore nucléaire remontage complexes sont beaucoup moins bien compris par rapport aux événements mitotiques précoces, mais peuvent être étudiées de manière similaire en utilisant Xenopus extrait d&#39;oeufs 7. Nous avons récemment mis en place un essai basé sur Xenopus extrait d&#39;oeufs d&#39;étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose 8, un processus de sous-enquête qui attend its caractérisation détaillée. Chez les métazoaires, la chromatine est fortement condensé à l&#39;entrée en mitose, afin de remplir fidèlement la ségrégation du matériel génétique. Pour garantir que la chromatine est accessible pour l&#39;expression des gènes et la replication de l&#39;ADN pendant l&#39;interphase, il doit être dé-compacté à la fin de la mitose. Chez les vertébrés, la chromatine est jusqu&#39;à cinquante-pli plus compacté lors de la mitose par rapport à l&#39;interphase 9, contrairement aux levures mitotique où le compactage est généralement beaucoup plus faible, par exemple, seulement deux fois dans S. 10 cerevisiae. Animal vertébré décondensation de la chromatine a été principalement étudié dans le cadre de la réorganisation de l&#39;ADN de sperme après fécondation des oeufs. Un mécanisme moléculaire, dans laquelle nucléoplasmine, une protéine de l&#39;ovocyte abondante, échange protamines spécifique sperme à histones H2A et H2B stockées dans l&#39;œuf. Ce processus a également été élucidée en utilisant Xenopus extrait d&#39;oeufs 11, 12. Toutefois, l&#39;expressionde nucléoplasmine est limitée à 13 ovocytes et la chromatine mitotique ne contient pas ces protamines spécifique sperme. Par conséquent, la décondensation de la chromatine à la fin de la mitose est indépendant nucléoplasmine 8. Pour la réaction de décondensation in vitro, nous employons extrait généré à partir activés X. laevis œufs et des grappes de chromatine isolés à partir de cellules HeLa synchronisés. Traitement des œufs avec un ionophore de calcium imite la libération de calcium dans l&#39;ovocyte généré par l&#39;entrée des spermatozoïdes lors de la fécondation. La vague de calcium déclenche la reprise du cycle cellulaire et de l&#39;œuf, arrêté dans la deuxième métaphase de la méiose, progresse à la première interphase 14. Par conséquent, les extraits d&#39;œufs préparés forme activée oeufs représentent l&#39;état de sortie / interphase mitotique et sont compétents pour induire des événements spécifiques pour la sortie mitotique comme décondensation de chromatine, enveloppe nucléaire et pores réforme complexe. Pour l&#39;isolement de ch mitotiqueromatin grappes, nous avons utilisé une version légèrement modifiée du protocole publié par Laemmli Gasser et 15, où les grappes de chromosomes sont libérés par lyse de cellules HeLa en mitose synchronisés et isolés dans des tampons contenant des polyamines par centrifugations à gradient.

<table><tbody><tr><td>tétrachlorhydrate de spermine</td><td>Fluka analytique</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>trichlorhydrate de spermidine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>digitonine de haute pureté</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>toxique</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td></td></tr><tr><td>thymidine</td> toxique <td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>nocodazole</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>toxique</td></tr><tr><td>37 % formaldéhyde solution</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td>toxik</td></tr><tr><td>trypan blue solution (0,4 % )</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>toxique 1,4-dithiothréitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate AEBSF</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>pepstatine</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>leupeptine</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>aprotinine</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (particules de silice colloïdale solution)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2 ; flacons de culture tissulaire</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur (broyeur de tissus de 40 ml)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>chambre Neubauer</td><td>Assistent</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Oak Ridge Tubes à centrifuger, polycarbonate (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro ; Filtre à cellules m, nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>cytochalasine B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td> toxique <td>Roth</td><td>8682.3</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine</td> toxique <td>Merck</td><td>1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>hCG disponible sous forme Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG disponible sous forme Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (mélange calcium-magnésium-sel)</td><td>Aiguilles</td><td>de</td>seringue toxiques Enzo <td>ALX-450-002-M010</td></tr><tr><td>(1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>créatine phosphat sel disodique</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>créatine phosphokinase</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr> des tubes de centrifugation <tr><td>toxiques</td><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td></tr><tr><td>pour TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 po)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver » (pointes à large ouverture, 1 000 & micro ; l)</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>solution de glutaraldéhyde à 50 %, grade I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td><td></td></tr><tr><td>toxique à 0,1 % (p/v) solution de poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>tubes à fond plat (6 ml, 16,0/55 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>tubes pour TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 po)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver » (pointes à large ouverture, 200 & micro ; l)</td><td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>lamelles de protection 12 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

a cell assay libre d&#39;étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Au cours du cycle cellulaire des vertébrés, la chromatine subit d’importants changements structurels et fonctionnels. Lors de l’entrée mitotique, il se condense massivement en chromosomes en forme de bâtonnet qui sont déplacés individuellement par l’appareil du fuseau mitotique. La condensation mitotique de la chromatine donne des chromosomes compactés cinquante fois plus denses qu’en interphase. Lors de la sortie de la mitose, les chromosomes doivent rétablir leur état d’interphase fonctionnel, qui est entouré d’une enveloppe nucléaire et est compétent pour la réplication et la transcription. Le processus de décondensation est bien décrit morphologiquement, mais en termes moléculaires mal compris : nous manquons de connaissances sur les événements moléculaires sous-jacents et, dans une large mesure, sur les facteurs impliqués ainsi que sur leur régulation. Nous décrivons ici un système acellulaire qui récapitule fidèlement la décondensation de la chromatine in vitro, basé sur des amas de chromatine mitotiques purifiés à partir de cellules HeLa synchronisées et d’extrait d’œuf de X. laevis. Notre système acellulaire fournit un outil important pour la caractérisation moléculaire plus poussée de la décondensation de la chromatine et sa coordination avec les processus se produisant simultanément lors de la sortie mitotique, tels que le réassemblage de l’enveloppe nucléaire et du complexe de pores.

La dépendance du temps de la réaction de décondensation La figure 1 montre une évolution dans le temps typique de l&#39;analyse de décondensation. Le groupe de chromosomes visibles au début de la réaction decondenses et fusionne en un seul, ronde et lisse noyau. Quand l&#39;extrait d&#39;œuf est remplacé par un tampon saccharose de la grappe reste chromosome condensé, ce qui suggère que l&#39;activité de décondensation est présente dans l&#39;extrait d&#39;œuf. <p class=...

Les mécanismes moléculaires de la décondensation de la chromatine mitotique hautement compactée sont mal définis. Nous présentons un test acellulaire basé sur des amas de chromatine mitotique isolés de cellules HeLa et d’extrait d’œuf de Xenopus laevis qui reconstitue fidèlement le processus de décondensation in vitro.

A Cell Assay libre d&#39;étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

L'objectif général de cette expérience est de reconstituer fidèlement la décondensation de la chromatine telle qu'elle se produit à la fin de la mitose, dans la simplicité d'un test in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la mitose, car elle permet la caractérisation du mécanisme moléculaire de la chromatine, de la décondensation, ainsi que l'identification des facteurs impliqués dans sa régulation. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être facilement manipulée sur le plan biochimique et que la chromatine l'est également.La décolonisation peut être étudiée de façon isolée, séparément des autres événements du cycle cellulaire. Commencez par isoler les agrégats de chromatine mitotique à partir de cellules HeLa et préparez les tampons nécessaires à la préparation de l'extrait d'œuf de Xenopus laevis IIC, comme décrit dans le protocole textuel associé. Une fois préparés, utilisez une seringue de cinq millilitres équipée d'une aiguille de calibre 27 pour injecter 500 unités internationales de gonadotrophine chorionique humaine dans des grenouilles dont l'ovulation a été induite.Injecter les grenouilles sous la peau du sac lymphatique dorsal le soir précédant l'expérience afin d'induire la libération des œufs. Une fois induites, conserver les grenouilles à 18 degrés Celsius pendant 13 à 17 heures dans des aquariums individuels contenant 1,2 litre de solution tampon de Ringer modifiée de Mark. Après que les grenouilles aient pondu leurs œufs, retirer les œufs déjà activés ainsi que ceux ayant une apparence anormale. Les recueillir en versant le contenu des aquariums dans des béchers en verre de 600 à 1000 millilitres correctement.Le tri des œufs est essentiel, car la qualité globale supplémentaire dépend de cette étape. Retirez les œufs activés filandreux et ceux ayant une apparence anormale. Par ailleurs, lors des étapes ultérieures, continuez à éliminer les œufs défectueux.Versez le surnageant S une fois que les œufs se sont déposés, puis remplissez à nouveau le bécher avec du tampon frais. Répétez ce processus quatre fois pour laver les œufs après le dernier lavage. Retirez le surnageant une fois de plus, puis remplissez le bécher avec une solution de cystéine à 2 % pour délimiter les œufs.Après deux à quatre minutes, remplacez par du tampon frais contenant de la L-cystéine. Considérez que la dégélatinisation est terminée lorsque le volume des œufs diminue fortement et que les œufs deviennent plus denses après environ cinq à sept minutes. Ensuite, lavez soigneusement les œufs dans du tampon Ringer modifié de Mark en versant et en rechargeant le tampon sur la paroi du bécher plutôt que directement sur les œufs.Ensuite, activer les œufs dans 100 millilitres de tampon de Ringer modifié de Marx contenant huit microlitres de deux milligrammes par millilitre. Ion calcium. Quatre, arrêter l'activation lorsque la contraction du bourgeon animal devient visible.Ou bien, 10 minutes après l'activation, laver soigneusement les œufs dans du ringer modifié de Mark, tamponner par décantation et remplir à nouveau le tampon en position supine après le dernier lavage. Incuber les œufs à température ambiante pendant 20 minutes dans le tampon de ringer modifié de Mark. Ensuite, préparer des tubes de centrifugation de cinq millilitres contenant 50 microlitres de tampon saccharose, 50 microlitres d'inhibiteur de protéase à 100 fois.Mélanger cinq microlitres de DTT à une molaire, 12,5 microlitres de cyclo heide et 2,5 microlitres de cyto. Laver les œufs deux fois avec un tampon de saccharose froid, puis les transférer dans les tubes de centrifugation. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique à orifice large, compacter les œufs en faisant tourner les tubes une minute à 130 ×g. Après centrifugation, éliminer le tampon excédentaire à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et remplir l’espace libre avec davantage d’œufs.Ensuite, centrifuger les tubes remplis d'œufs dans un rotor à godets de 6 × 5 mL pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius et à 21 000 fois g. Une fois la solution séparée en trois couches, insérer une seringue de cinq millilitres équipée d'une aiguille de calibre 16 sur le côté du tube et dans la couche intermédiaire située entre le jaune d'œuf jaune en haut et juste au-dessus des débris sombres d'œuf brisé en bas. Transférer l'extrait phaseux à basse vitesse dans un tube neuf placé sur de la glace, puis ajouter 10 microlitres d'un inhibiteur de protéase dilué 100 fois.Mélanger un microlitre de DTT à une molaire, 2,5 microlitres de cycloheide à 20 milligrammes par millilitre et 0,5 microlitre de cyto B. Ajouter 10 milligrammes par millilitre à chaque millilitre de l'extrait à faible vitesse. Centrifuger l'extrait phasique à faible vitesse pendant 12 minutes à 355 000 ×g dans un rotor de 10 par 2 millilitres. Puis retirer délicatement la couche lipidique supérieure et transférer le surnageant contenant l'extrait à haute vitesse dans un tube propre.Cette étape est cruciale pour produire un échantillon de haute qualité. Veillez à ce que le liquide prélevé ne contienne aucune contamination provenant de la couche lipidique supérieure ou de la gênante couche inférieure. Pipetez 18 microliters de l'extrait à haute vitesse dans un tube réaction de 1,5 millilitre, puis ajoutez 0,5 microlitre de glycogène et 0,5 microlitre du mélange énergétique.0,3 microlitre de six diméthyl purine et 0,7 microlitre des agrégats mitotiques. Utilisez des embouts à orifice large pour mélanger la réaction aussitôt que la chromatine est ajoutée afin d'éviter le cisaillement de la chromatine en cours de décondensation. Une fois homogénéisé, incubez le mélange réactionnel jusqu'à deux heures à 20 degrés Celsius.Ensuite, fixez l'échantillon en ajoutant 0,5 millilitre de fixateur froid contenant 4 % de paraformaldéhyde, 0,5 % de glutaraldéhyde et 0,1 milligramme par millilitre de DPI. À l’aide de pipettes dotées d’orifices larges, incubez l’échantillon sur de la glace pendant 20 à 30 minutes. Ensuite, traitez des lamelles rondes de 12 millimètres avec une solution de poly-L-lysine à 0,1 % (poids/volume) et incubez les lamelles pendant cinq minutes afin d’augmenter leur affinité.Pour sécher la chromatine, placez les lamelles sur du papier filtre. Une fois sèches, ajoutez les lamelles recouvertes au fond de tubes de centrifugation de 6 millilitres à fond plat, de sorte que la face recouverte soit orientée vers le haut. Ajoutez ensuite 800 microlitres du tampon de 30 % de saccharose et déposez délicatement tout l'échantillon fixé par-dessus.Faire centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et à 2 500 × g. Ensuite, décanté le surnageant S et retirer les lamelles des tubes en piquant soigneusement le fond du tube de centrifugation avec une aiguille de calibre 16. Lorsque la lamelle est soulevée par l'aiguille d'un côté, utiliser une pince pour retirer la lamelle, la rincer rapidement en la trempant dans de l'eau déionisée, puis la sécher délicatement en touchant son bord avec du papier filtre. Ensuite, déposer une goutte de milieu de montage sur une lame de microscope et poser délicatement la face échantillon de la lamelle.Placez la lame dans le milieu de montage. Séchez délicatement la lame à couvre-objets avec un papier absorbant, puis scellez le pourtour de la lame avec du vernis à ongles et conservez la préparation à l’abri de la lumière jusqu’à son observation. Voici le cours typique dans le temps du test de décompensation.L'amas de chromosomes visible au début de la réaction, décon, se condense et fusionne en un noyau unique, rond et lisse. Lorsque l'extrait d'œuf est remplacé par un tampon au saccharose, l'amas de chromosomes reste condensé, ce qui suggère que l'activité de décompensation est présente dans l'extrait d'œuf. Dans l'expérience présentée ici, des analogues non hydrolysables de l'ATP ou du GTP ont été ajoutés à la réaction.Ces deux additifs inhibent la décondensation, ce qui prouve que ce processus actif dépend à la fois de l'hydrolyse de l'ATP et de celle du GTP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures pour la préparation d'extrait d'œufs de niveaux de Singapour, et en trois heures pour le dosage de promotion de la décolonisation. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que son succès dépend fortement de la qualité de l'extrait.En particulier pour les immunodéplétions, il est recommandé d'utiliser un extrait fraîchement préparé selon cette procédure. D'autres méthodes, telles que les immunodéplétions et l'ajout de protéines recombinantes, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme par exemple quels facteurs sont impliqués. Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans les domaines de la mitose ou de la structure et de la fonction nucléaires pour explorer la déchromatinisation telle qu'elle se produit à la fin de la mitose dans les cellules animales.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des extraits d'œufs de foie de Xenopus et comment appliquer cette méthode pour reconstituer la décondensation de la chromatine. N'oubliez pas que manipuler le paraformaldéhyde, l'hydrazine et la DARPA peut présenter des dangers, et que des précautions doivent être prises, comme le port de gants.

a-cell-free-assay-to-study-chromatin-decondensation-at-end

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit comment la chromatine immunoprécipitation (ChIP) est utilisée pour étudier les altérations dynamiques du modèle de la chromatine qui régulent la transcription induite par une voie de transduction du signal.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

Analyse de l'interaction de la chromatine par Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) est une méthode...

Analyse de l&#39;interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement

Métaphase anaphase de transition est déclenchée par l'anaphase de promotion de complexe (APC / C) en fonction de l'ubiquitination et la destruction subséquente de la cycline B. Ici, nous avons mis en place un système qui, à la suite pulse-chase étiquetage, permet de suivre la cycline B protéolyse dans des populations de cellules entières et facilite la détection des interférences par le checkpoint mitotique.

L&#39;étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

Nous décrivons une méthode robuste pour immunoprécipitation de la chromatine en utilisant des cellules T primaires. La méthode est fondée sur des approches standard, mais utilise un ensemble spécifique de conditions et de réactifs qui améliorent l'efficacité pour une quantité limitée de cellules. Surtout, une description détaillée de la phase d'analyse des données est présentée.

Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

La plasticité d’architecture nucléaire est contrôlée par des mécanismes épigénétiques dynamiques, y compris non codantes ARN, ADN méthylation, repositionnement du nucléosome ainsi que histone composition et modification. Nous décrivons ici un protocole d’isolement Formaldehyde-Assisted des éléments réglementaires (FAIRE) qui permet la détermination de l’accessibilité de la chromatine de façon reproductible, peu coûteuse et simple.

Formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères

Ce protocole décrit une méthode simple et pratique pour étiqueter et visualiser direct chromosomes dans les cellules mitotiques en utilisant l’étiquette Histone2B-GFP BacMam 2.0 et un système de microscopie confocale tourne disque.

Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

L'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l'obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d'enfant en utilisant la digestion enzymatique.

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l'imagerie en time-lapse permet à l'utilisateur d'identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d'identifier les défauts mitotiques, et d'analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l'exposition à des médicaments anti-mitotiques.

Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle

La microscopie time-lapse est un outil précieux pour étudier la méiose chez la levure bourgeonnante. Ce protocole décrit une méthode qui combine la synchronisation du cycle cellulaire, la microscopie accélérée et l’épuisement conditionnel d’une protéine cible pour démontrer comment étudier la fonction d’une protéine spécifique pendant la ségrégation chromosomique méiotique.

Utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez S. cerevisiae

Découvrez un test cellulaire sans cellules pour étudier la décondensation de la chromatine à la fin de la mitose en utilisant des cellules HeLa et des extraits d'œufs de Xenopus laevis. Cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires impliqués.

A Cell Assay libre d'étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose

Explorer plus de vidéos