Name: Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Découvrez un test d'invasion de sphéroïdes cancéreux utilisant une matrice 3D de membrane basale et de collagène de type I. Cette méthode permet d'évaluer la dynamique d'invasion cellulaire dans un environnement physiologiquement pertinent in vitro.

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Pris en charge par le NIH subventions P30 CA051008 et CA009686 T32 (ATR).

1. Génération de Sphéroïdes <ol><li> Préparer une suspension de cellules isolées pour accrocher des cultures de goutte à détacher des cultures de cellules adhérentes cancer de ~ 70% de confluence en utilisant un WASH PBS suivi par l&#39;exposition à la solution de trypsine-EDTA à 0,05%. <ol><li> Neutraliser la solution de trypsine avec des milieux de culture de cellules et compter les cellules en utilisant une aliquote de la suspension cellulaire. Remarque: Les milieux de culture cellulaire spécifique dépendra de la lignée cellulaire testée. Suivre ATCC recommandations de média, où le milieu de culture cellulaire est généralement DMEM + 10% de FBS. Plus d&#39;informations peuvent être trouvées dans le tableau des matériaux. </li><li> Effectuer une dilution pour permettre l&#39;ensemencement de 500-1000 cellules par goutte 20 ul de milieu de culture cellulaire. </li></ol></li><li> Acquérir de 10 cm et ajouter 5 ml de PBS stérile vers le bas. Remarque: Cette étape protège la pendaison chute de l&#39;évaporation. Basse-coût »bactériologiques de qualité&quot; plats peut être utilisé à la place de plats de qualité de culture de cellules, comme les cellules ne sera pas suiteagir la surface de culture. </li><li> Utiliser une pipette à canaux multiples pour transférer 20 pi de gouttelettes de la suspension cellulaire diluée à la surface intérieure du couvercle. <ol><li> Pipet 40 gouttes (5 rangées de 8 gouttes) sur le couvercle de la boîte de 10 cm. </li></ol></li><li> Inversez le couvercle et la placer sur la boîte de culture. Incuber les cultures de goutte suspendue à 37 ° C pendant 72 heures pour générer sphéroïdes. <ol><li> Retournez le couvercle d&#39;une manière confiante, mais contrôlée. Remarque: L&#39;inversion du couvercle trop rapide ou trop lent peut causer des gouttelettes pour décaler. Certaines lignées de cellules peuvent former des sphéroïdes 48 h ou moins, tandis que d&#39;autres peuvent nécessiter plus de 72 heures pour produire des agrégats compacts. </li></ol></li></ol> 2. Embedding de Sphéroïdes en 3D Matrix <ol><li> Décongeler une aliquote de sous-sol matériaux membranaires facteur réduit la croissance à 4 ° C pendant la nuit avant de l&#39;intégrer sphéroïdes. <ol><li> Facultatif: puits de couche avec ECM à l&#39;avance pour éviter l&#39;interaction sphéroïde potentiel avec le tissu de culture surface. <ol><li> Pipet 200 pi de ECM par puits sur une plaque de 24 puits. </li><li> Incliner la plaque pour que le ECM couvre la surface du puits tout entier. </li><li> Retirez délicatement l&#39;excès ECM avec une pipette. </li><li> Incuber la plaque jusqu&#39;à ce que les puits sont à sec: 3 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Recueillir les sphéroïdes en inclinant le couvercle de la boîte de culture de tissus et de mutualiser les médias. Transférer les médias avec les sphéroïdes dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Autoriser 10 min pour les sphéroïdes à se déposent au fond du tube à centrifuger. Sphéroïdes devraient être visibles à l&#39;œil nu. </li><li> Mélanger 100 pi des matériaux de la membrane basale avec 100 pi de froid (4 ° C) collagène de type I dans un tube pré-réfrigéré séparé. Gardez le mélange à 4 ° C pour éviter la gel de se solidifier prématurément. <ol><li> Utilisez les embouts de pipettes pré-réfrigérées si le transfert de petits volumes. </li><li> Donner des soins quandmélanger les matières de la membrane basale et de collagène de type I pour empêcher la formation de bulles d&#39;air. Remarque: Les bulles d&#39;air peuvent entraver imagerie plus tard dans le protocole si elles deviennent intégrés dans le gel. </li></ol></li><li> Aspirer les sphéroïdes de la partie inférieure de 40 ul du tube de microcentrifugeuse, et de combiner avec les matériaux de la membrane basale / collagène de type I mélange. Soyez prudent pour éviter la formation de bulles d&#39;air lors du mélange. Remarque: La solution contenant des matières de la membrane basale 100 pi, 100 pi de collagène de type I, ainsi que 40 ul de sphéroïdes vais créer suffisamment de matière pour 4 3D cultures indépendantes. Cela peut être agrandie ou réduite. </li><li> Pipet 40 Les gouttes ul du mélange visqueux dans les centres de puits sur une plaque de 24 puits. Maintenir le niveau de la plaque pour empêcher le mélange de courir dans le côté du puits. Remarque: Une seule colonne sur la plaque de 24 puits - 4 puits - est recommandé pour chaque condition à tester. </li><li> Placer la plaque into 37 ° C incubateur et laisser reposer pendant 30 min. La culture 3D va polymériser pendant cette période. </li><li> Plonger lentement les cultures 3D dans 1 ml de milieu de culture cellulaire. <ol><li> Assurez-vous que les médias est chaud quand l&#39;ajouter dans les puits afin de promouvoir davantage la polymérisation de gel. </li><li> Étape critique: Ajouter délicatement les médias aux cultures 3D. Pipetage des médias trop vite dans les puits peut conduire au détachement des cultures 3D de la surface de culture de tissus. </li></ol></li></ol> 3. Suivi et analyse de Spheroid Invasion <ol><li> L&#39;invasion de l&#39;image dans les sphéroïdes dans la matrice 3D environnante aux points de contrôle décidées par l&#39;enquêteur. Acquérir des photos en utilisant un microscope inversé avec l&#39;objectif 20x. Remarque: points de temps Idéal diffèrent en fonction de la lignée cellulaire testée. Lignées cellulaires plus invasives vont commencer leur sortie des sphéroïdes peu après placage et, par conséquent, de prendre la photo initiales au sein d&#39;un couple d&#39;heures après placage. Généralement, les photos sont prises à 0 h (après le placage), 24 h et 48 h. Invasion conclut généralement 24 à 48 heures après l&#39;étalement. </li><li> Quantifier la capacité invasive en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image comme J. Image <ol><li> Analyser invasion comme étant la distance de la cellule à partir du bord de la sphéroïde. <ol><li> Utilisez l&#39;outil Dessiner droite pour marquer le rayon et / ou de la distance maximale invasive. </li><li> Cliquez sur &quot;Analyser&quot; dans le menu du haut, puis cliquez sur &quot;mesure&quot; pour afficher la mesure de longueur. </li></ol></li><li> Analyser invasion comme la superficie totale invasive en dehors de la sphéroïde. <ol><li> Utilisez l&#39;outil de dessiner à main levée pour tracer la frontière du sphéroïde et / ou de la zone invasive totale. </li><li> Cliquez sur &quot;Analyser&quot; dans le menu du haut, puis cliquez sur &quot;mesure&quot; pour afficher la mesure de la superficie. </li></ol></li><li> Utilisez un plugin comme Manager Tools ROI pour créer des mesures pour une pile d&#39;images. </li></ol>
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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Cette étude a évalué la performance d&#39;un panel de lignées cellulaires cancéreuses dans un test d&#39;invasion sphéroïde (tableau 1). En règle générale, nous constatons que la formation sphéroïde est renforcée dans les plus lignées de cellules épithéliales prospectifs, où la présence de jonctions cellule-cellule favorise la formation d&#39;une architecture sphéroïde-like. Connus lignes de cellules qui ont subi une transition épithélio-mésenchymateuse, comme MDA-MB-231 cellules ne forment pas des sphé...

Il est établi que la motilité des cellules cancéreuses est un facteur prédictif de potentiel métastatique, étant donné qu&#39;un tel comportement facilite invasion à travers la membrane basale et l&#39;entrée dans le système circulatoire 1. La plupart des recherches sur la motilité a mis l&#39;accent sur la façon dont les cellules se comportent dans un (2D) paramètre à deux dimensions, mais il est en plus largement reconnu que le mouvement des cellules dans une matrice tridimensionnelle (3D) est plus représentatif de la façon dont ces mêmes cellules seront effectivement se comporter deux in vivo. Des systèmes de culture 3D de plus en plus utilisées pour étudier les comportements cellulaires qui vont de la morphologie cellulaire, de la cinétique de croissance et la sensibilité aux médicaments 3. Le désir de contrôler l&#39;invasion de cellules cancéreuses dans le cadre d&#39;un milieu 3D a conduit à la synthèse des techniques précédemment établies impliquant la génération d&#39;agrégats de cellules 3D (sphéroïdes) via le procédé de culture de goutte suspendue 4, suivie de l&#39;incorporation de ces sphéroïdes dans un extracellulaire 3D matrice (ECM), composée de collagène et de la membrane basale matériaux 5. Cette méthode vise à améliorer ces techniques précédemment établies en fournissant une approche simplifiée qui peut être facilement utilisé pour comparer l&#39;invasion sous une variété de conditions expérimentales. Plus méthodes traditionnelles pour évaluer la motilité cellulaire in vitro comprennent le dosage d&#39;anti-enroulé et le dosage de 6 Transwell. Le premier essai montre la motilité des cellules dans un milieu en 2D, et est donc indépendante d&#39;une variété de caractéristiques critiques pour l&#39;invasion in vivo, par exemple une activité de protease 7. Le dosage Transwell peut mieux modèle invasion cellulaire lorsque les inserts de puits sont revêtues avec des substrats de ECM, mais, seulement un seul paramètre, à savoir l&#39;apparition de cellules sur la surface opposée de la membrane est mesurée, et de nombreuses nuances de l&#39;invasion des cellules ne sont donc pas facilement observable. Contrairement à ces techniques, le dosage cellulaire de cancer du sphéroïde invasion (figure 1 &lt;/ strong&gt;) permet la surveillance en temps réel de l&#39;invasion des cellules dans un cadre qui est non seulement physiologiquement pertinente, mais permet également des caractéristiques importantes de cellules spécifiques aux lignes à visualiser, tels que la migration de cellule individuelle vs 8 collective. Cette méthode offre également des avantages sur les essais de croissance de la culture 3D standard. La production d&#39;agrégats cellulaires par la méthode de la goutte suspendue contraint initialement le mouvement des cellules, de sorte que les cellules sont incités à envahir après cette contrainte est levée. En outre, une fois que la contrainte est levée, la sortie de la cellule se déroulera dans une direction uniforme qui peuvent ensuite être facilement quantifiée. Les matériaux d&#39;ECM les plus populaires utilisés pour cellulaires de cancer sphéroïdes dosages sont Matrigel et collagène de type I, où chacune de ces composantes a des rôles importants et distincts à influencer le comportement métastatique. Matrigel est un mélange sécrétée de protéines produites par des cellules de sarcome Engelbreth-Holm Swarm souris, et est enrichie en améprotéines membranaires nt comme la laminine, entactine et collagène de type IV 9. Pour cette raison Matrigel est désormais appelé «matériaux de la membrane basale.&quot; Ces matériaux de la membrane basale fournissent ligands essentiels nécessaires pour intégrine adhérence lors de cancer invasion de la cellule 10, en plus de nombreuses autres protéines qui exercent une gamme d&#39;effets sur le comportement de la cellule 11. En comparaison, collagène de type I, couramment préparé à partir de produits de digestion acide de tendons et d&#39;autres structures de collagène dense 12, est un matériau de matrice beaucoup plus simple qui sert en tant qu&#39;élément structurel principal de tissus tissulaires et du stroma de support conjonctifs et organes du corps. Il a été démontré que les caractéristiques physiques du collagène peuvent réguler un certain nombre de caractéristiques de la motilité des cellules; par exemple, l&#39;alignement des fibrilles de collagène à l&#39;interface de la tumeur du stroma permet aux cellules cancéreuses de migrer par la suite le long de ces fibrilles lors de l&#39;invasion dans le stroma 13. Dans l&#39;essai présenté ici, à la fois du collagène de type I et les matériaux de la membrane basale sont utilisés comme outils pour étudier les interactions cellule-cancer du stroma 3D. L&#39;effet de l&#39;inhibition ou la stimulation des voies qui contrôlent l&#39;invasion peut être surveillée après que les cellules ont été noyées dans la matrice 3D. Les cellules peuvent être prétraitées pendant la croissance dans les gouttes de suspension ou lors du transfert de la culture 3D, selon que le traitement de longue durée sera nécessaire pour moduler invasion. Pour les traitements plus courts, il est recommandé que le médicament est mélangé à la suspension de sphéroïde après la collecte, ainsi que le support qui entourent les cultures 3D, afin de faciliter l&#39;exposition au médicament adéquat pour les cellules. Ensuite, les cellules stromales normales ou associés à une tumeur peuvent être mélangés avec le matériau de matrice afin d&#39;évaluer leur rôle dans la modulation de l&#39;invasion des cellules tumorales, ou pour déterminer le comportement des cellules influences de signalisation autocrine et paracrine. Cette idée a été montré dans une étude où la co-culture de colsur le cancer et les cellules endothéliales dans des gouttes suspendues conduit à un réseau vasculaire dans les sphéroïdes 14. Enfin, les constituants de l&#39;ECM peuvent aussi être modifiées, comme l&#39;invasion des cellules cancéreuses est influencée par différents substrats 15. La méthode présentée ci-dessous sera donc de fournir un cadre pour évaluer l&#39;invasion des cellules cancéreuses dans une variété de conditions. En général, il a été trouvé que toutes les lignées de cellules vont créer des sphéroïdes dans les gouttes suspendues et des lignées de cellules epitheliales d&#39;aspect forment typiquement des sphères régulières.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Facteur de croissance réduit</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type I, queue de rat, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Moyen&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin, inactivé à la chaleur</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Plats traités TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24 puits TC Plaques traitées</td><td>NEST Biotechnlologie</td><td>702001</td><td></td></tr><tr>microscope <td></td><td></td><td></td><td>inversé Olympus IX-71</td></tr><tr><td>Les lignées cellulaires ont été maintenues en DMEM + 10 % FBS, avec l’attente de cellules BT-474 et LNCaP, qui ont été maintenues en RPMI + 10 % FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une cellule cancéreuse spheroid test pour évaluer invasion dans un cadre 3d

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

La nature invasive des lignées cellulaires cancéreuses est censée être corrélée à leur potentiel métastatique. Cependant, la plupart des tests traditionnels n’examinent pas ces caractéristiques invasives dans un environnement tridimensionnel et les données qui en résultent souffrent d’une applicabilité biologique réduite. Ici, une approche est présentée pour visualiser la capacité invasive des lignées cellulaires dans un cadre physiologiquement pertinent. Le test d’invasion de sphéroïdes de cellules cancéreuses utilise d’abord la gravité pour générer des sphéroïdes dans des gouttes de milieu suspendues au couvercle d’une boîte de culture cellulaire. Ensuite, ces sphéroïdes sont intégrés dans une matrice 3D composée d’un mélange de matériaux de membrane basale et de collagène de type I. La sortie des cellules cancéreuses des sphéroïdes vers la matrice environnante est ensuite surveillée au fil du temps. La méthode décrite ici peut être modifiée pour examiner l’invasion après coculture de différents types de cellules, l’inclusion de médicaments/inhibiteurs ou l’altération des constituants de la matrice extracellulaire (MEC).

En utilisant le dosage d&#39;invasion sphéroïde (figure 1), un panel de lignées cellulaires du cancer a été testé pour leur aptitude à former des sphéroïdes, ainsi que pour la quantité de sortie de la cellule exposée après l&#39;implantation dans une matrice 3D constitué de matériaux de membrane de sous-sol et de collagène de type I (Tableau 1). Ces résultats démontrent que chaque lignée cellulaire de cancer va créer sphéroïdes bien formés, où les lignes de cellules possédant une morpho...

Cette méthode évalue l’invasion des cellules cancéreuses des sphéroïdes dans une matrice 3D environnante. Les sphéroïdes sont générés par la méthode de culture de gouttes suspendues, puis intégrés dans une matrice composée de matériaux de membrane basale et de collagène de type I. L’invasion des sphéroïdes est ensuite surveillée.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

L'objectif général de cet essai d'invasion de cellules cancéreuses par stéroïdes est de permettre la surveillance de l'invasion des cellules cancéreuses hors d'un bolus cellulaire et dans une matrice tridimensionnelle environnante. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du cancer, telles que l'identification des conditions favorisant ou inhibant l'invasion cellulaire. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les diverses subtilités du mode d'invasion des cellules peuvent être évaluées dans un contexte in vitro plus proche des conditions physiologiques.Pour commencer, retirez une boîte de culture contenant des cellules cancéreuses adhérentes de l’incubateur. Lavez les cellules une fois avec du PBS et ajoutez 1,5 millilitre de trypsine-EDTA à 0,05 %. Incubez ensuite les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.Une fois que les cellules se sont détachées, faire passer les cellules trypséisées à travers une pipette de cinq millilitres afin d'obtenir une suspension monocellulaire, puis ajouter 8,5 millilitres de milieu de culture cellulaire au flacon. Compter la suspension cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules. Dilu

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Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Cette vidéo présente une méthode permettant d’établir une co-culture tridimensionnelle de sphéroïdes tumoraux et de lymphocytes T. Un moulage à l’agarose avec des micropuits contenant des sphéroïdes tumoraux est préparé, suivi de l’ajout de lymphocytes T. Après l’incubation, cette configuration permet d’étudier l’interaction des lymphocytes T avec les sphéroïdes tumoraux dans un environnement tridimensionnel contrôlé.

Un modèle de co-culture tridimensionnelle de lymphocytes T infiltrants dans des sphéroïdes tumoraux

Source : Guyon, J., et al. Un modèle sphéroïde 3D pour le glioblastome. J. Vis. Exp. (2020)La vidéo démontre la génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel de l’invasion des cellules tumorales. Les sphéroïdes sont formés à partir de cellules tumorales du cerveau humain et intégrés dans une matrice de collagène. Les cellules tumorales à la périphérie des sphéroïdes adoptent un phénotype invasif, sécrétant des protéases pour dégrader le collagène et progressant pour envahir la matrice...

Génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel d’invasion de cellules tumorales

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance du cancer et de l’invasion. Pour imiter la progression du carcinome, une matrice humaine biologiquement pertinente est nécessaire. Ce protocole introduit une amélioration pour le test in vitro d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions en appliquant une matrice humaine à base de leiomyoma. Le protocole introduit également une analyse d’invasion cellulaire basée sur ordinateur.

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

L’approche présentée évalue simultanément l’invasion de cellules cancéreuses dans les essais sphéroïdes 3D et la cytotoxicité de cellule T. Les sphéroïdes sont générés dans un jet de multi-microwell sans échafaudage. La co-culture et l’intégration dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans le même dispositif qui permet de surveiller l’invasion des cellules cancéreuses et la cytotoxicité médiée par cellules T.

Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde. Ce dispositif permet l’imagerie dynamique ou longitudinale de fluorescence des sphéroïdes de cellules cancéreuses. Le protocole offre également une procédure simple de traitement d’image pour l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses.

Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

L’invasion est un phénomène biologique majeur dans le développement et la progression du cancer. Ce processus est influencé par les cellules non néoplasiques et les composants du microenvironnement tumoral. Le but de cette étude est de décrire une méthode alternative pour analyser l’invasion des cellules tumorales in vitro à l’aide de cultures tridimensionnelles (3D).

Stratégie alternative pour analyser l’invasion cellulaire in vitro de cultures 3D

Ici, nous présentons un protocole pour étudier l’interaction des macrophages primaires dérivés de monocytes humains avec un sphéroïde tumoral dans une matrice tridimensionnelle (3D) de collagène I, avec la possibilité de comparer l’impact des propriétés solubles et physiques du microenvironnement sur l’invasion cellulaire.

Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

Il existe un besoin critique de modèles de cancer 3D qui capturent la diaphonie hétérocellulaire pour étudier les métastases cancéreuses. Notre étude présente la génération d’épithélium stromal hétéromulticellulaire dans un environnement sans échafaudage qui peut être utilisé pour étudier l’invasion et les distributions spatiales cellulaires.

Cellules stromales hétéromulticellulaires dans des cultures 3D sans échafaudage de cellules cancéreuses épithéliales pour stimuler l’invasion

Découvrez un test d'invasion de sphéroïdes cancéreux utilisant une matrice 3D de membrane basale et de collagène de type I. Cette méthode permet d'évaluer la dynamique d'invasion cellulaire dans un environnement physiologiquement pertinent in vitro.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

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