Name: Extraction séquentielle de soluble et insoluble alpha-synucléine de Brains parkinsoniens (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Découvrez l'extraction séquentielle de l'alpha-synucléine soluble et insoluble à partir de cerveaux parkinsoniens post-mortem. Cette méthode utilise l'ultracentrifugation et le western blot pour analyser l'agrégation protéique.

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Je remercie le Dr Adamantios Mamais d’avoir extrait de la α-synucléine de tissus humains et d’avoir effectué des transferts. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention du MRC (MR/L010933/1) et en partie par le prix Joint Call in Neurodegeneration (WT089698) du Wellcome Trust/MRC au UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) dont les membres proviennent de l’Institut de neurologie de l’UCL, de l’Université de Sheffield et de l’unité de phosphorylation des protéines du MRC de l’Université de Dundee. RB a reçu un financement de la fondation MJFox pour ce travail et est également financé par le Reta Lila Weston Trust.

Tissu cérébral post-mortem a été donné à Queen Square Banque de cerveaux pour les troubles neurologiques, University College de Londres, Institut de neurologie en utilisant des protocoles éthique approuvées et stockées pour la recherche en vertu d&#39;une licence délivrée par l&#39;autorité de tissus humains (ETS) au Royaume-Uni (. Pas 12198). Voir la liste des cas utilisés pour ce protocole (tableau 1). 1. Préparation des tampons <ol><li> Préparer 1X TBS (solution saline tamponnée au Tris) tampon: <ol><li> Préparer 10X TBS tant que solution de 500 mM Tris-HCl pH 7,4 et 1 500 mM de NaCl. <ol><li> Peser 60,5 g de Tris-Cl pH 7,6 et 87,6 g de NaCl dans 800 ml d&#39;eau de haute pureté. Ajuster le pH avec HCl 1 M et de faire le stock volume final à 1 L. </li></ol></li><li> Préparer la concentration finale de 1X TBS par dilution de la 10 fois dans de l&#39;eau distillée. </li><li> Ajouter inhibiteurs de la protéase (PI), (1 comprimé par 50 ml de tampon) et Phos-stop comprimés d&#39;inhibiteur de la phosphatase (1 comprimé par 10 ml de tampon) àabroger les effets des actions enzymatiques non spécifiques de protéases et phosphatases. Remarque: Ici, nous avons utilisé l&#39;enzyme inhibiteur de comprimés, mais également Roche autres inhibiteurs disponibles dans le commerce peuvent être utilisés selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Préparer du tampon TBS-SDS en ajoutant 5% p / v de sodium dodécylsulfate (SDS) à 1 X TBS (pH 7,4) tampon. Chauffer la solution à 60 ° C avec agitation constante en utilisant un agitateur magnétique pour solubiliser SDS. </li><li> Préparer du tampon TBS-SDS-urée par addition d&#39;urée à une concentration finale de 8 M p / v de tampon 1X TBS-SDS (pH 7,4). Chauffer la solution à 60 ° C sous agitation constante sur un agitateur magnétique pour dissoudre l&#39;urée. </li></ol> 2. Homogénéisation de l&#39;échantillon et différencié Ultracentrifugation Remarque: La partie suivante de l&#39;œuvre implique la manipulation des tissus cérébraux humains selon les règles de l&#39;ETS au Royaume-Uni. Procédures normalisées d&#39;exploitation locales sont suivies du tout times. Les échantillons de cervelle sont disséqués à partir de blocs de cerveau congelé et du matériel de tissu homogénéisé dans un microcabinet maintenu à pression négative. Les blouses jetables gants, masque pour le visage, plus-chaussures protecteurs et des lunettes de sécurité sont portés tout au long de la procédure. Déchets de tissus humains est jeté après autoclave à 121 ° C pendant 20 min pour une élimination sécuritaire. Sharps (Les lames de scalpel) sont disposées dans un contenant approprié pour le confinement et l&#39;élimination sécuritaire. <ol><li> Prenez un morceau de tissu humain congelé (environ 0,5 g en poids de la région des noyaux gris centraux) et émincer rapidement en petits fragments (environ 1 mm 2) sur la glace à l&#39;aide d&#39;une petite boîte de Pétri et une lame de scalpel stérile. Utilisez une boîte de Petri séparée et lame de bistouri pour chaque échantillon. Recueillir le tissu haché dans un tube de 15 ml et ajouter 10 volumes de tampon glacé 1xTBS au tube. </li><li> Homogénéiser les échantillons en utilisant un homogénéisateur à 20 000 tours par minute mécanique pendant 10 s. Refroidir sur glace pendant 2 min. Répétez cette étape trois foiss. Note: Ceci est fait de sorte que les échantillons ne sont pas chauffés tout en homogénéisant. </li><li> Clarifier par centrifugation à 1 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter pastille de matériau non homogénéisé. </li><li> Prenez surnageant (homogénat brut), ajouter au polycarbonate tubes de centrifugation (taille d&#39;un tube dépend de la taille du rotor) et équilibrer soigneusement. Centrifugeuse à 100.000 g pendant 1 h à 4 ° C. </li><li> Conservez surnageant car cela est la fraction soluble SCT. </li><li> Laver culot deux fois en cinq volumes de tampon 1X SCT et centrifuger chaque fois à 100 000 g pendant 15 min à 4 ° C. Jeter les surnageants. <ol><li> Reprendre le culot final en soniquant le culot pendant 10 sec à 20 KHz à environ 5 volumes de 1X TBS-SDS à RT. Note: Avant l&#39;addition des échantillons contenant de tampon SDS devrait être portée à 10 ° C pour éviter la précipitation SDS. </li><li> Ultracentrifugation à 100.000 g pendant 30 min à 25 ° C. </li></ol></li><li> Conservez surnageant comme cela est ee SDS fraction soluble. <ol><li> Laver culot deux fois dans 5 volumes de tampon 1X TBS-SDS à température ambiante. Centrifugeuse à chaque fois à 100.000 g pendant 15 min à 25 ° C. </li><li> Solubiliser le culot final dans 50 pi de tampon 1X TBS-SDS-urée en utilisant un appareil à ultrasons fixé à 20 KHz pour 10 secondes pour atteindre solubilisation complète; cette est appelée la fraction soluble de l&#39;urée. </li></ol></li><li> Doser chaque fraction de teneur en protéines totales en utilisant un kit de dosage de protéine du commerce, selon le protocole du fabricant. Diluer les échantillons TBS-SDS-urée de 1: 1 avec du tampon TBS 1X pour permettre la compatibilité avec les réactifs de dosage des protéines. Des échantillons de gel de petites aliquotes (20 pi) à -80 ° C afin de réduire les cycles de gel-dégel. Remarque: l&#39;ajout de 10% de glycérol à des échantillons est recommandé pour le stockage à long terme à -80 ° C. </li></ol> 3. Immunoblotting des échantillons et Analyse des résultats <ol><li> Exécuter des échantillons du SCT, TBS-SDS et extraits TBS-SDS-urée sur 10 et 4-12% de gel Bis-Tris polyacrylamideavec MOPS comme tampon en utilisant des techniques standard. Voir Gallagher et Chakravarti (2008) 29 pour un protocole de western blot détaillée. </li><li> Charge: 10 ug de protéine de chaque échantillon sur chaque piste et aussi d&#39;un marqueur de poids moléculaire pour SDS et TBS et des fractions urée. </li><li> Exécuter gel à 200 V pendant 1 heure ou jusqu&#39;à ce que le colorant bleu de tampon de charge a atteint le fond du gel. </li><li> Transfert des protéines à partir de gels électrophorèse sur des membranes de nylon 28, pré-humidifié la première fois en 100% de méthanol, puis dans le tampon de transfert contenant 20% de méthanol. Fournir une marque d&#39;identification sur le transfert pour déterminer le côté de la protéine et l&#39;orientation des poids moléculaire des marqueurs de taille. <ol><li> Sandwich du gel avec la membrane aux côtés de papier filtre humide. Le placement correct de la membrane est cruciale avec la membrane entre le gel et l&#39;anode. Effectuer le transfert pendant 2 h à 40 V. </li><li> Maquillage 1X PBS-Tween (PBS 1X-T) tampon: dissoudre une tablette de PBS dans 200 mleau pour donner 0,01 M tampon phosphate, 0,0027 M de chlorure de potassium et 0,137 M de chlorure de sodium, pH 7,4. </li><li> Bloquer la membrane dans une solution de BSA à 5% dans du PBS-T 1X pendant 30 min sous agitation à 70 tours par minute. Ceci permet d&#39;éviter la liaison non spécifique de l&#39;anticorps primaire à la membrane. </li></ol></li><li> Sonder le buvardage des protéines avec 6 ml d&#39;α-syn anticorps primaire Syn-1 (BD Biosciences; anticorps monoclonal de souris) à 1: 750 dilution (O / N à 4 ° C), suivie par une série de lavages avec du PBS 1X-T ( 3 x 5 min à chaque fois) 28. </li><li> Incuber la tache avec le HRP appropriée conjugué anticorps secondaire au 1: 2000 dilution pour 30 min. Effectuer une série de lavages (3 x 5 min à chaque fois) avec 1X PBS-T. <ol><li> Plongez taches en solution de chimioluminescence amplifiée pendant 15 secondes dans une pièce sombre. Taches de couvrir avec un film alimentaire et placer des films d&#39;autoradiographie contre la tache avec de la protéine côté jusqu&#39;à dans une cassette étanche à la lumière pour capter les signaux appropriés (bandes de taille appropriée). </li><li> Développer des films d&#39;autoradiographie dans un révélateur automatisé. Remarque: Les transferts peut également être développé manuellement à l&#39;aide révélateur et le fixateur d&#39;une source commerciale dans le cas d&#39;une machine automatisée de développeur ne sont pas disponibles. </li></ol></li><li> Incuber le western blot avec 6 ml de western blot tampon de décapage pendant 10 min avec agitation constante pour dépouiller les blot des anticorps signaux α-syn. Suivez les étapes jusqu&#39;à 3,43 3.6.2 en utilisant un anticorps primaire bêta-actine (monoclonal de souris) à 1: 8000 dilution. </li><li> Numérisation et conversion de l&#39;image finale en une image et mesurer les densités Tiff utilisant NIH ImageJ à des fins de quantification (un logiciel téléchargeable gratuitement). Remarque: Le logiciel permet la lecture des densités de surface relative d&#39;intérêt (les bandes de taille appropriée) et les données peut être exprimée soit comme un rapport de α-syn densité / β-actine (gène de la maison de maintien) en unités arbitraires ou sur sa propre maison quand un gène de conservation est non valide (comme dans le cas des échantillons d&#39;urée-soluble). </li&gt; </ol>

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<li>Lee, B. R., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+immunodetection+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved immunodetection of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 6, e23939(2011).</li>
<li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).</li>
</ol>

L&#39;auteur n&#39;a rien à révéler.

Cet article décrit un protocole biochimique pour l&#39;extraction et l&#39;examen des propriétés de solubilité différentielle de monomères, oligomères et agrégées α-syn de cerveaux malades et en utilisant des conditions de dénaturation du gel de fonctionnement. Ceci est une technique bien établie pour étudier agrégé α-syn 17, 18, ​​20, 21 une protéine qui est normalement soluble dans sa forme native mais le gain propriétés d&#39;agrégation amyloïdogéniques ou augmentée, avec la progression de la maladie ou présentant des mutations génétiques. Néanmoins, certains groupes ont utilisé de légères variations de concentrations de SDS dans leurs tampons (8% ou 10% au lieu de 5%) 21,22, 30. Le SDS est un détergent anionique et solubilise α-syn oligomères qui peuvent inclure membranaires formes de α-syn, alors que l&#39;urée, un réactif chaotropique dénature les formes agrégées et fibrillaires ou amyloïdogéniques insolubles de α-syn 20. À cet égard, une étude systématique par Paleologou et al 31 a examiné la stabilitédes oligomères et des fibrilles avec des concentrations variables de l&#39;urée a-syn (6,5 - 8 M) ou du SDS (0,25-2%) et rapporté que les oligomères stables à des concentrations de SDS, mais non avec des concentrations élevées d&#39;urée. Leur FILA-1 anticorps, spécifique pour les oligomères et les fibrilles alpha-syn détecté des concentrations plus élevées de fibrilles à 6,5 M concentrations d&#39;urée dans des conditions non-dénaturant. Les concentrations de tampon utilisés dans ce protocole reflète fidèlement ce qui a été décrit dans Culvenor et al. (1999) 32. Les régions cérébrales anatomiques pour l&#39;extraction biochimique de insoluble α-syn doivent être soigneusement sélectionnés et doivent refléter ce LB et LN charge α-syn fonction de progression de la maladie 33,34. Les cas utilisés ici sont des échantillons de ganglions de la base de sous-types néocortex et limbiques du PD reflétant les stades tardifs et intermédiaires de la progression du PD selon McKeith ctriteria 34. À la Banque Queen Square cerveau, la moitié du cerveau estrégulièrement fixé dans le formol pour une analyse histochimique et l&#39;autre moitié est soigneusement disséquée dans différentes régions anatomiques et flash congelé et stocké à -80 o C congélateurs pour d&#39;autres études biochimiques et ADN / d&#39;analyse de l&#39;ARN. Après la fixation du formol des cerveaux et la dissection par neuropathologistes, immunohistochimie est réalisée en utilisant un anticorps α-syn et les résultats archivé. Toujours dans un mode opératoire usuel, le pH du tissu de cerveau est mesurée à l&#39;arrivée en tant que mesure de l&#39;état agonique du tissu cérébral. Cela constitue une base solide pour la qualité de la conservation des tissus pour l&#39;analyse biochimique. Nos données ici montre qu&#39;il ya plus de SDS soluble monomère α-syn dans les cas de PD par rapport aux témoins; en particulier les cas de PD néocortex n&#39;a plus la charge α-syn par rapport à la variété de PD limbique. Les cas néocorticales représentent une plus grande progression de PD α-syn pathologie dans les régions du néocortex comme les frontales et pariétales corTices 33,34. Les cas de PD limbiques ont des scores plus élevés LB dans les zones du cerveau antérieur basal / régions limbiques telles que l&#39;amygdale, transentorhinal et les régions cingulaire. Pour obtenir des données significatives et l&#39;analyse statistique, il faut courir au moins 4 cas de chaque cohorte. De même, nous avons pas tenté analyse statistique des données présentées ici blot. Il faut aussi noter que les anticorps différents peuvent reconnaître différentes formes / composition d&#39;ordre supérieur alpha-syn oligomères et chacun peut avoir sa propre sensibilité relative et la préférence. Cela est évident à partir des résultats de Tong et al. 29 où ils montrent que 4 anticorps alpha-syn différents (SYN-1, SS, Onco et LB509) donnent des résultats variables au moins pour les alpha-syn oligomères / agrégats. Les monomères α-syn été reconnu à des degrés similaires de tous les 4 anticorps bien que ceux-ci peuvent avoir variation selon que l&#39;épitope α-syn anticorps est située soit dans le N-terminal ou C-terminal 29. De même, des anticorps spécifiques pour phospho-alpha-synucléine déterminer le poids moléculaire élevé distincte espèces 20,21 α-synucléine. Dans le protocole décrit ici, l&#39;anticorps hautement caractérisé Syn-1 a été utilisé 19 à 21. Cependant, il est important de considérer la validation de tout nouvel anticorps sur des transferts de Western par des expériences de pré-absorption d&#39;anticorps et également la surexpression et knock-down de la protéine dans les cellules. Il est important de considérer d&#39;autres variations qui ont été appliquées par les chercheurs pour déterminer petits fragments de formes alpha-syn et ou instables tétramériques alpha-syn. Cela pourrait inclure légère fixation des membranes avec 0,4% de PFA dans PBS à conserver des formes tronquées de α-syn 35 ou le traitement des homogénats d&#39;échantillons avec agents de réticulation pour stabiliser tétramères 36. L&#39;évaluation biochimique exacte de protéines en utilisant des post-mortem tissu nécessite la minimisation de la dégradation de la protéine enzymatique et la modification. Il est donc conseillé d&#39;utiliser des tissus avec les plus brefs délais post-mortem et / ou de sélectionner des échantillons appariés dans les cohortes de cas. L&#39;immunohistochimie en utilisant des anticorps pour la α-syn immunohistochimie doit être effectuée avant de commencer le protocole d&#39;isolement. L&#39;étendue des α-syn pathologie est très variable et peut varier selon l&#39;une des régions sélectionnées. Il est conseillé de sélectionner des régions présentant une pathologie abondante comme un contrôle positif pour un rendement optimal avec chaque course. L&#39;utilisation des inhibiteurs de la protéase et inhibiteurs de phosphatase si nécessaire pour empêcher la dégradation enzymatique indésirable après la libération de protéases ou phosphatases intracellulaires survenant pendant la lyse des cellules et le maintien des échantillons à 4 ° C est cruciale. Il est important que tous les échantillons dans le lot d&#39;expériences sont traitées de façon égale et uniforme pour éviter des variations intra-utilisateur; fre multiplescycles Eze-dégel devraient être évitées car cela pourrait potentiellement retirer modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation. Un point essentiel à garder à l&#39;esprit lors de l&#39;examen d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons est que les données de immunoblots devraient être normalisées à un échantillon, qui devrait fonctionner en parallèle à tous les autres échantillons sur les gels, et toutes les données référencées à cet échantillon. Ceci est fait pour assurer la normalisation des données d&#39;immunotransfert entre plusieurs blots. Ceci est la méthode adoptée dans notre étude récente 22. Il convient de noter que dans le but de garder la ECL de fond faible, les taches ne doivent pas être autorisés à se dessécher à tout moment pendant le protocole de transfert de western. En outre, de très longues expositions (&gt; 10 min) sur des films d&#39;autoradiographie devraient être évitées car cela va conduire à une saturation des signaux ECL et mènera à la quantification inexacte. Ce protocole ci-dessus est une technique relativement simple en utilisant des réactifs de laboratoire communes et eninstruments et peuvent être un outil précieux pour étudier la physiopathologie de la protéine α-syn dans la recherche de PD. Cette méthodologie peut non seulement être étendu avec les modifications appropriées à l&#39;étude de l&#39;α-syn la biologie des animaux transgéniques alpha-syn mais aussi à d&#39;autres maladies neurodégénératives comportant des dépôts anormaux de protéines agrégées telles que AD, MSA, DLB, HD et frontotemporaldementias. Cependant, les données de western blot décrites ici peuvent également être validées en utilisant des dosages immuno-enzymatiques en utilisant des anticorps de formes spécifiques de α-syn 31.

L&#39;une des caractéristiques pathologiques principales communes parmi plusieurs maladies neurodégénératives est la formation d&#39;agrégats de protéines anormales qui se produit dans une protéine / maladie de manière spécifique une. Ainsi, il ya les extraneuronales plaques bêta-amyloïdes caractéristiques et les dépôts de la protéine tau dans les neurones hyperphosphorylées agrégées dans la maladie d&#39;Alzheimer (MA); les dépôts d&#39;alpha-syn agrégées à corps de Lewy (LBS) qui sont des inclusions intraneuronales, et également au sein des processus dystrophique neuronale appelés neurites de Lewy (LNS) à PD, PD et la démence à corps de Lewy (de DLBs) 2-4. Dépôts alpha-syn anormales sont également observées dans les lésions Poinçon de inclusions cytoplasmiques gliales dans MSA 5. Dans la maladie de Huntington, il ya les dépôts Poly-Q caractéristiques et liaison à l&#39;ADN Tar anormale de protéine-43 et fusionné dans les protéines de sarcome (FUS) sont déposés dans les démences fronto-temporales. Il est important pour les PD, les mutations du gène α-syn ont été trouvés à cauSE autosomique dominante PD 6-11. En outre, α-syn gène triplication 12 et 13 duplication provoque également PD familiale reliant ainsi l&#39;expression accrue α-syn les mécanismes pathologiques de la PD. Notamment, les cas de PD fois sporadique et familiale abritent des dépôts anormaux de α-syn pathologie 14. Traitements actuellement disponibles pour PD ne sont palliatifs et n&#39;a aucun effet sur l&#39;arrêt ou retarder la progression de la maladie inexorable. α-syn est abondamment exprimé dans le cerveau humain et représente environ 1% de la protéine totale du cerveau. Il est présent plus spécifiquement dans les neurones, mais peut exister mais dans des quantités plus faibles dans les cellules gliales. Un point litigieux est la structure native de α-syn qui peut exister en tant que monomère aléatoire 15 ou comme un tétramère 16 plié. Au cours de la maladie, α-syn change de conformation qui lui permet d&#39;obtenir mal repliées et ce procédé est considéré comme étant la cause de la maladie de pathogenesis. Malgré plusieurs années de recherches sur les aspects physiopathologiques de α-syn et les maladies, les causes exactes de la maladie ont des mécanismes resté inaccessible 14. Les études utilisant l&#39;analyse post-mortem de cerveaux parkinsoniens ont jusqu&#39;ici donné des indices importants concernant la biologie normale et anormale de α-syn tant en PD sporadique et aussi PD associée à des mutations dans le gène LRRK2 17-22. Ici, un protocole d&#39;extraction biochimique (voir schéma présenté dans la figure 1) pour les dépôts d&#39;alpha-syn plus en plus insolubles de tissus post-mortem PD du cerveau humain qui abritent des agrégats α-syn à des degrés divers a été décrite. Cette technique peut également être adapté avec des modifications dans les compositions de tampons pour étudier les protéines agrégées d&#39;autres maladies neurodégénératives 23,24 et également à partir de tissu animal transgénique cerveau 25-27. La principale considération les adaptations sont les différences dans solubilité et le montant total des protéines respectives dont certains sont principalement nucléaire et peuvent avoir besoin de tampons riches en sel pour l&#39;extraction optimale comme le montre par FUS 28.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>comprimés inhibiteurs de protéase&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la phosphatase comprimés</td><td>Roche ;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS tampon de fonctionnement</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de transfert NuPAGE</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P membrane&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM papier filtre</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris gels 4-12 %&nbsp ;</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td></td><td></td>NP0322BOX</tr><tr><td>Substrat chimiluminescent Supersignal West Pico</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines Bio-RAD DC&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polycarbonate Beckman à paroi épaisse</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de décapage Western blot</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire Syn-1 (monoclonal de souris)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>anticorps primaire de bêta-actine (monoclonal de souris&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP chèvre conjuguée anticorps secondaire anti-souris</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor/ modèle no&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse de paillasse Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr>Systèmes <td>de chauffage</td> par<td>sonicateur</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td><td>Jenke et Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction séquentielle de soluble et insoluble alpha-synucléine de brains parkinsoniens

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

L&#39;alpha-synucléine (α-syn) protéine est abondamment exprimé principalement dans les neurones, et existe dans un certain nombre de différentes formes monomères, - des tétramères, des oligomères et des fibrilles. Au cours de la maladie, α-syn subit des changements conformationnels pour former des oligomères et des agrégats de haut poids moléculaire qui tendent à rendre la protéine plus insoluble. Anormalement agrégé α-syn est une caractéristique neuropathologique de la maladie de Parkinson (PD), la démence à corps de Lewy (DCL) et l&#39;atrophie de systèmes multiples (MSA). La caractérisation et l&#39;analyse des insolubles tampons d&#39;alpha-syn utilisant avec augmentation de la force de détergent et ultracentrifugation haut débit biochimique fournit un outil puissant pour déterminer le développement de la pathologie α-syn associée à la progression de la maladie. Ce protocole décrit l&#39;isolement de / agrégée α-syn plus en plus insoluble de tissus post-mortem du cerveau humain. Cette méthode peut être adaptée à des études avec des modifications de α normal et anormal-syn biologie dans les modèles animaux transgéniques portant des mutations différentes de a-syn, ainsi que dans d&#39;autres maladies neurodégénératives qui présentent des dépôts fibrillaires aberrantes de protéines liées à leurs pathologies respectives.

TBS, SDS et urée soluble protéines extraites à partir de ganglions de la base selon le protocole illustré à la figure 1 ont été passés sur des gels et un immunotransfert avec l&#39;anticorps monoclonal de souris Syn-1 α-syn anticorps primaire. Les fractions solubles SCT affichent la présence de monomère α-syn (~ 14 espèces kDa) dans les cas de PD et de contrôle examinées (figure 2A). Les fractions solubles SDS ont également montré abondante monomère α-syn dans les trois sous-types de cas étudiés comme affiché dans le bas blot d&#39;exposition (figure 2C). Les cas de PD ont également montré poids moléculaire (MW) espèces supérieures de alpha-syn comme on le voit sur ​​le transfert de forte exposition, qui sont susceptibles d&#39;être des oligomères (figure 2C). Les fractions solubles dans l&#39;urée provenant de cas de PP ont montré des quantités élevées de monomères a-syn, des oligomères et des espèces agrégées cas par rapport au témoin. Les cas de MP idiopathique néocorticales démontrent montants plus élevés de AGGREG<html> espèces ATED α-syn, tandis que les cas limbiques montrent des niveaux intermédiaires de insoluble α-syn. Les deux fractions du SDS et d&#39;urée de cas de MP idiopathique montrent des niveaux variables de produits d&#39;alpha-syn tronquées à 12 kDa et 6 kDa comme décrit 20. En revanche, les cas de contrôle n&#39;a pas montré de α-syn insoluble ou agrégée (figure 2E). Mesures semi-quantitatives densité reflètent la quantité de charge LB comme categoriesd utilisant α-syn immunohistochimie démontrant le caractère insoluble de agrégée α-syn (figure 2B, 2D, 2F) dans les cas de PD néocortex et limbiques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma d&#39;insolubles α procédure d&#39;extraction -syn.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Figure 2. immunoblots représentatifs de niveaux -syn alpha de PD et contrôler les tissus humains. SCT, SDD et les fractions solubles dans l&#39;urée à partir de ganglions de la base (une région qui abrite α-syn pathologie dans les cas de DP) des cas de MP idiopathique et neurologique normale (témoin) cerveaux ont été analysés pour la présence de α-syn immunoblot en utilisant de l&#39;Ouest. 10 ug de protéine ont été chargés sur chaque ligne. Dans SCT fractions (A), principalement monomères α-syn sont présents dans tous les cas. En SDS des fractions (C), des oligomères d&#39;α-syn sont considérés en même temps que les monomères principalement dans le tissu PD. Dans fractions d&#39;urée (C), les monomères, oligomères et agrégée α-syn sont variablement exprimé dans le cas de PD réflectineg de leur charge respective LB. Les échantillons témoins normaux sur le plan neurologique montrent la présence de seulement de petites quantités de monomère α-syn. S&#39;il vous plaît noter produits de dégradation possibles de α-syn sont observés dans certains des cas avec une charge élevée LB. La tête de flèche pleine représente la forme monomère de α-syn. Le * représente peut-être une forme de C-terminale tronquée de α-syn comme décrit précédemment 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Cas </td><td> Sexe </td><td> à l&#39;âge de ans </td><td> délai post-mortem (heures) </td><td> pH de tissu </td></tr><tr><td> Néocorticale 1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Néocorticale 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35,3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Limbique 1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28,5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Limbique 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36,5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Contrôle 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Contrôle 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32,5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. démographie limitée des cas utilisés

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement de l’alpha-synucléine (α-syn) de plus en plus insoluble/agrégée à partir de tissu cérébral humain post-mortem. Grâce à l’utilisation de tampons à la résistance détergente croissante et à des techniques d’ultracentrifugation à grande vitesse, les propriétés variables de l’agrégation α-syn dans les tissus malades et non malades peuvent être examinées.

Extraction séquentielle de soluble et insoluble alpha-synucléine de Brains parkinsoniens

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

L'objectif général de cette méthodologie est d'extraire l'alpha-synucléine soluble et insoluble à partir de cerveaux post-mortem de patients parkinsoniens. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude de la maladie de Parkinson. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est relativement simple et repose sur l'utilisation de réactifs et d'instruments de laboratoire courants.Après avoir préparé les solutions et tampons nécessaires, commencez par placer un échantillon de 0,5 gramme de tissu de ganglions de la base congelé dans une petite boîte de Pétri. Utilisez une lame de scalpel stérile pour hacher rapidement le tissu en fragments carrés d'un millimètre. Rassemblez le tissu haché dans un tube de 15 millilitres et ajoutez 10 volumes de TBS 1X glacé au tube.Homogénéisez les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur mécanique à 20 000 tr/min pendant 10 secondes. Ensuite, refroidissez sur de la glace pendant deux minutes. Répétez l’homogénéisation trois fois, en refroidissant chaque fois sur de la glace.Centrifuger l'homogénat à 10 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant brut de l'homogénat dans des tubes à centrifuger en polycarbonate et centrifuger à 100 000 g pendant une heure à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans des tubes refroidis placés sur de la glace, et conserver cette fraction comme la fraction soluble dans le tampon TBS.Laver avec cinq volumes de tampon TBS 1X et centrifuger à 100 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer et jeter le surnageant. Répéter ensuite le lavage.Le lavage minutieux des culots entre les étapes d'ultracentrifugation est essentiel pour la réussite de cette procédure. Après avoir laissé les échantillons atteindre une température de 10 degrés Celsius afin d'éviter la précipitation du SDS, ajouter cinq volumes de TBS-SDS 1X et resuspendre le culot final par sonication pendant 10 secondes à 20 kilohertz à température ambiante. Effectuer une ultracentrifugation à 100 000 g pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius.Après ultracentrifugation, transférez le surnageant dans des tubes refroidis sur de la glace, et conservez-le comme la fraction soluble dans le SDS. Ajoutez cinq volumes de tampon TBS-SDS 1X à température ambiante au culot, puis centrifugez à 100 000 g pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius. Jetez le tampon de lavage et répétez l'opération de lavage.Après avoir éliminé le surnageant, ajouter 50 microlitres de TBS-SDS-Urée 1X et solubiliser à l’aide d’un sonicateur réglé à 20 kilohertz pendant 10 secondes. Étiqueter cet échantillon comme la fraction soluble dans l’urée. Il est essentiel de s’assurer soigneusement que toutes les protéines insolubles sont extraites au cours de la procédure.Diluer les échantillons TBS-SDS-Urée au TBS 1X à parts égales afin de les rendre compatibles avec les réactifs de dosage protéique, puis doser la teneur totale en protéines de chaque fraction à l’aide d’un kit commercial de dosage protéique, selon le protocole du fabricant. Répartir les échantillons en aliquots de 20 microlitres contenant 10 % de glycérol afin de réduire le nombre ultérieur de cycles de congélation-décongélation, et les conserver à −80 degrés Celsius. Charger 10 microlitres des extraits TBS, TBS-SDS et TBS-SDS-Urée ainsi qu’un marqueur de poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide Bis-Tris 4 à 12 % à 10 puits, en utilisant comme tampon de migration le MOPS et des techniques standard.Faites migrer le gel à 200 volts pendant une heure, ou jusqu'à ce que le colorant bleu du tampon de charge atteigne le bas du gel. Humidifiez une membrane de nylon dans du méthanol à 100 %, puis immergez-la dans du tampon de transfert contenant 20 % de méthanol. Effectuez une marque d'identification sur le blot pour déterminer le côté des protéines et l'orientation des marqueurs de poids moléculaire.Placer le gel entre la membrane et du papier filtre humide. Effectuer le transfert pendant deux heures à 40 volts. Bloquer la membrane dans une solution de BSA à 5 % dans du PBS-T 1X pendant 30 minutes sous agitation à 70 tr/min pour éviter la liaison non spécifique de l'anticorps primaire à la membrane.Détectez le transfert de protéines en incubant avec six millilitres de l'anticorps primaire anti-alpha-synucléine Syn-1, dilué au 1/750 dans du PBS-T, toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, lavez la membrane trois fois avec du PBS-T 1X, cinq minutes à chaque fois. Incubez ensuite le transfert avec l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase approprié, dilué au 1/2 000 dans du PBS-T, pendant 30 minutes.Lavez la membrane comme précédemment avec du PBS-T 1X. Immergez les transferts dans une solution d'immunodétection chimiluminescente améliorée selon les instructions du fabricant, dans une pièce sombre. Recouvrez les transferts avec un film transparent et révélez le signal par autoradiographie.Après l'acquisition des images, incubez le transfert Western avec six millilitres de tampon de décapage pour transfert Western pendant 10 minutes sous agitation constante afin d'éliminer le signal de l'anticorps anti-alpha-synucléine. Répétez la procédure de transfert Western pour sonder la membrane avec un anticorps primaire anti-bêta-actine dilué au 1/8 000. Numérisez et convertissez l'image finale en format Tiff, puis mesurez les densités à l'aide du logiciel NIH ImageJ pour la quantification.Les images suivantes sont des immunotransferts représentatifs des niveaux d'alpha-synucléine provenant de tissus du ganglion basal humain de patients atteints de la maladie de Parkinson et de sujets témoins. Les fractions solubles dans le TBS, le SDS et l'urée ont été analysées pour la présence d'alpha-synucléine par immunotransfert western. Dix milligrammes de protéines ont été chargés dans chaque piste.Dans la fraction TBS, les monomères de l'alpha-synucléine sont présents dans tous les cas. L'astérisque représente probablement une forme tronquée au niveau de l'extrémité C de l'alpha-synucléine. Dans la fraction SDS, certains oligomères de l'alpha-synucléine sont observés en plus des monomères, indiqués par la flèche pleine dans le tissu de la maladie de Parkinson.Dans la fraction urée, les monomères, oligomères et formes agrégées de l'alpha-synucléine sont exprimés de manière variable chez les cas de MP, reflétant leur charge respective en corps de Lewy. Les échantillons témoins neurologiquement normaux montrent la présence de faibles quantités seulement de l'alpha-synucléine monomérique. Une fois maîtrisée, cette technique d'extraction des protéines peut être réalisée en une journée de travail, suivie d'un immunoblot western le jour suivant, si elle est effectuée correctement.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des corps de Lewy pour explorer les espèces d'alpha-synucléine insolubles et agrégées dans les tissus humains pathologiques et dans des modèles animaux in vivo. N'oubliez pas que le travail avec des tissus humains non fixés exige des mesures de précaution, et que des gants ainsi que des blouses de laboratoire doivent être portés tout au long de toutes les manipulations.

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Cette vidéo présente un test d’immunofluorescence pour détecter les agrégats d’alpha-synucléine spécifiques aux maladies neurodégénératives sur des coupes de biopsie cutanée. L’immunocoloration flottante est utilisée pour marquer par fluorescence l’hydrolase carboxyl-terminale et les agrégats d’alpha-synucléine dans les neurones dermiques. Au microscope confocal, les cellules présentant la fluorescence des deux anticorps indiquent la présence d’agrégats d’alpha-synucléine dans les neurones...

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Étude de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires primaires de souris

Source : Bétemps, D.,  et al.,  Détection de la α-synucléine associée à la maladie par ELISA amélioré dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant la α-synucléine humaine mutée A53T. J. Vis. Exp. (2015). Cette vidéo montre la procédure de détection de la protéine α-synucléine associée aux maladies neurodégénératives dans le tissu cérébral de souris transgéniques à l’aide d’ELISA. Les étapes comprennent l’homogénéisation des tissus, la centrifugation et la détection ELISA de la protéine...

Détection de la protéine α-synucléine associée à une maladie neurodégénérative à l’aide d’un ELISA

En utilisant la microscopie à force atomique en combinaison avec la technologie de biopanning, nous avons créé un système de biopanning négatif et positif pour acquérir des anticorps contre les variantes de protéines spécifiques à la maladie présentes dans n’importe quel matériel biologique, même à de faibles concentrations.  Nous avons réussi à obtenir des anticorps dirigés contre des variantes de la protéine TDP-43 impliquées dans la sclérose latérale amyotrophique.

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Un ELISA offrant une nouvelle approche quantitative est décrit. Il détecte spécifiquement l'α-synucléine associée à la maladie (αSD) dans un modèle de souris transgénique (M83) de synucléinopathie en utilisant plusieurs anticorps contre la forme αS phosphorylée sur la Ser129 ou la partie C-terminale de la protéine.

Détection de α-synucléine maladie associée par ELISA renforcée dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant A53T humaine mutée α-synucléine

Le but du présent protocole est de fournir un système de base de cellules qui réplique la formation d’alpha-synucléine aggregates in vivo. Des inclusions intracellulaires alpha-synucléine sont ensemencées dans des neurones primaires par l’internalisation et propagation d’exogène administrée natif associées aux microsomes alpha-synucléine agrégats isolés de souris transgénique alpha-synucléine malades.

Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

Ici, nous présentons un protocole pour un test d'immunofluorescence indirecte flottant sur les sections de biopsie de peau qui permet l'identification des variantes spécifiques de conformation de la maladie de la synuclein alpha impliquée dans la maladie de Parkinson et les protéines multiples du système nerveux périphérique.

Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

L’objectif de cet article est de décrire les étapes requises pour la génération de fibrilles à partir de l’alpha-synucléine monomère, le contrôle de qualité ultérieur, et l’utilisation des fibrilles préformées in vivo.

Génération de fibrilles préformées alpha-synucléine à partir de monomères et utilisation in vivo

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour étudier l’accumulation neuronale de α-synucléine dans les neurones primaires de dopamine de souris. Les agrégats α-synucléine phosphorylés dans les neurones sont induits avec des fibrilles préformées d’α-synucléine. L’imagerie automatisée des cellules immunofluorères et l’analyse impartiale de l’image rendent ce protocole robuste adapté au dépistage moyen à élevé des médicaments qui inhibent l’accumulation de synucléine.

Étude de l’accumulation préforme induite d’α-synucléine par fibrile dans les neurones dopaminergiques de la souris embryonnaire primaire

Ce travail analyse la dose vectorielle et le temps d’exposition nécessaires pour induire la neuroinflammation, la neurodégénérescence et la déficience motrice dans ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson. Ces vecteurs codant pour la α-synucléine humaine sont introduits dans la substantia nigra pour récapituler la pathologie de la synucléine associée à la maladie de Parkinson.

Analyse du modèle murin de la maladie de Parkinson induit par des vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine humaine

Le présent protocole décrit une méthode d’administration intranasale d’agrégats de α-synucléine. Cette méthode permet de mieux comprendre la propagation de la α-synucléine de la muqueuse olfactive au bulbe olfactif dans la maladie de Parkinson.

Technique d’administration intranasale d’agrégats de α-synucléine

Découvrez l'extraction séquentielle de l'alpha-synucléine soluble et insoluble à partir de cerveaux parkinsoniens post-mortem. Cette méthode utilise l'ultracentrifugation et le western blot pour analyser l'agrégation protéique.

Extraction séquentielle de soluble et insoluble alpha-synucléine de Brains parkinsoniens

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