Extraction séquentielle de soluble et insoluble alpha-synucléine de Brains parkinsoniens

L’objectif global de cette méthodologie est d’extraire de l’alpha-synucléine soluble et insoluble des cerveaux parkinsoniens post-mortem. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude de la maladie de Parkinson. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une technique relativement simple utilisant des réactifs et des instruments de laboratoire courants.

Après avoir préparé les solutions et les tampons nécessaires, commencez par placer un échantillon de 0,5 gramme de tissu congelé des ganglions de la base sur une petite boîte de Pétri. À l’aide d’une lame de scalpel stérile, émincez rapidement en fragments d’un millimètre carré. Recueillez le tissu haché dans un tube de 15 millilitres et ajoutez 10 volumes de glace froide, 1X TBS dans le tube.

Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur mécanique à 20 000 tr/min pendant 10 secondes. Puis laisser refroidir sur de la glace pendant deux minutes. Répétez l’homogénéisation trois fois, en refroidissant sur de la glace à chaque fois.

Centrifuger l’homogénat à 10 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant d’homogénat brut dans des tubes de centrifugation en polycarbonate et centrifugez à 100 000 g pendant une heure à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans des tubes refroidis sur de la glace et conservez-le sous forme de fraction soluble dans le TBS.

Laver en cinq volumes de tampon 1X TBS et centrifuger à 100 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant. Répétez ensuite le lavage.

Un lavage minutieux des granulés entre les étapes d’ultracentrifugation est essentiel pour le succès de cette procédure. Après avoir laissé les échantillons atteindre une température de 10 degrés Celsius pour éviter les précipitations de SDS, ajoutez cinq volumes de 1X TBS-SDS et remettez en suspension la pastille finale en sonicant pendant 10 secondes à 20 kilohertz à température ambiante. Ultracentrifugeuse à 100 000 g pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius.

Après l’ultracentrifugation, transférez le surnageant dans des tubes refroidis sur de la glace et conservez-le comme fraction soluble SDS. Ajoutez cinq volumes de tampon 1X TBS-SDS à température ambiante à la pastille et centrifugez-la à 100 000 g pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius. Jetez le tampon de lavage et répétez le lavage.

Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 50 microlitres de 1X TBS-SDS-Urea et solubilisez à l’aide d’un sonicateur réglé à 20 kilohertz pendant 10 secondes. Étiquetez cet échantillon comme la fraction soluble dans l’urée. Il est essentiel de s’assurer que toutes les protéines insolubles sont extraites au cours de la procédure.

Diluez les échantillons de TBS-SDS-Urea un à un avec un tampon 1X TBS pour permettre la compatibilité avec les réactifs de dosage des protéines, et analysez chaque fraction pour la teneur totale en protéines à l’aide d’un kit de dosage de protéines commercial conformément au protocole du fabricant. Aliquote échantillonne en aliquotes de 20 microlitres avec 10 % de glycérol pour réduire les futurs cycles de gel-dégel et stocke à moins 80 degrés Celsius. Chargez 10 microlitres d’extraits TBS, TBS-SDS et TBS-SDS-Urea dans un marqueur de poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide Bis-Tris à 10 puits, de quatre à 12 pour cent avec MOPS comme tampon de fonctionnement en utilisant des techniques standard.

Faites fonctionner le gel à 200 volts pendant une heure, ou jusqu’à ce que le colorant bleu du tampon de chargement ait atteint le fond du gel. Mouillez une membrane en nylon dans du méthanol à 100 %, puis trempez-la dans un tampon de transfert contenant 20 % de méthanol. Faites une marque d’identification sur le transfert pour déterminer le côté protéique et l’orientation des marqueurs de taille de poids moléculaire.

Sandwich le gel avec la membrane avec du papier filtre humide. Effectuez le transfert pendant deux heures à 40 volts. Bloquer la solution à 5 % de BSA dans 1X PBS-T pendant 30 minutes en agitant à 70 tr/min pour éviter la liaison non spécifique de l’anticorps primaire à la membrane.

Sondez la protéine blot en l’incubant avec six millilitres de l’anticorps primaire alpha-synucléine Syn-1 dilué un à 750 dans du PBS-T pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez la membrane avec 1X PBS-T trois fois pendant cinq minutes à chaque fois. Ensuite, incubez le transfert avec l’anticorps secondaire conjugué HRP approprié dilué de un à 2 000 dans du PBS-T pendant 30 minutes.

Lavez la membrane comme précédemment avec 1X PBS-T. Immergez les taches dans une solution de chimiluminescence améliorée selon les instructions du fabricant dans une pièce sombre. Couvrez les taches avec un film alimentaire et capturez le signal à l’aide d’une autoradiographie.

Après l’imagerie, incuber le western blot avec six millilitres de tampon de stripping western blot pendant 10 minutes en secouant constamment pour éliminer le signal de l’anticorps alpha-synucléine. Répétez la procédure de transfert Western pour sonder la membrane avec l’anticorps primaire de bêta-actine à une dilution de un à 8 000. Numérisez et convertissez l’image finale en image Tiff et mesurez les densités à l’aide de NIH ImageJ à des fins de quantification.

Les images suivantes sont des immunotransferts représentatifs des niveaux d’alpha-synucléine de la MP et du tissu des ganglions de la base humaine de contrôle. Les fractions solubles dans le TBS, le SDS et l’urée ont été analysées à l’aide de l’immunotransfert occidental. 10 milligrammes de protéines ont été chargés dans chaque voie.

Dans la fraction TBS, les monomères d’alpha-synucléine sont présents dans tous les cas. L’astérisque représente peut-être une forme tronquée C-terminale de l’alpha-synucléine. Dans la fraction SDS, certains oligomères de l’alpha-synucléine sont observés avec des monomères, indiqués par la pointe de flèche solide dans le tissu.

Dans la fraction urée, les monomères, les oligomères et l’alpha-synucléine agrégée sont exprimés de manière variable dans les cas de, reflétant leur charge à corps de Lewy respective. Les échantillons de contrôle neurologiquement normaux ne montrent la présence que de petites quantités d’alpha-synucléine monomère. Une fois maîtrisée, cette technique d’extraction de protéines peut être effectuée dans la journée ouvrable, suivie d’un western immunoblot le lendemain, si elle est correctement effectuée.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du corps de Lewy pour explorer des espèces d’alpha-synucléine insolubles et agrégées dans des tissus humains pathologiques et dans des modèles animaux in vivo. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains non fixés nécessite des mesures de précaution, et que des gants et des blouses de laboratoire doivent être portés tout au long de toutes les procédures de manipulation.