Name: Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Découvrez l'électroporation ex vivo du cervelet de poulet pour étudier la morphologie des cellules granuleuses. Cette méthode permet d'analyser la migration et la différenciation des progéniteurs neuronaux.

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La méthode présentée dans cet article est née de travaux financés par le BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) et une bourse d&#39;études de doctorat MRC (MH).

Remarque: Toutes les expériences ont été réalisées avec conformément au King College de Londres, Royaume-Uni et les lignes directrices de soins aux animaux UK Home Office. 1. Dissection de e14 Cerebellum <ol><li> Incuber les oeufs bruns de poule fertilisés à 38 ° C à jour embryonnaire 14. </li><li> L&#39;aide de ciseaux d&#39;œufs décapitent embryon de poulet in ovo et retirer la tête d&#39;une boîte de Pétri contenant de la glace froide PBS (figure 1A). </li><li> En utilisant des pinces standard, faire des incisions derrière chaque oeil tout le chemin à travers le tissu, la suppression des yeux et de la mâchoire supérieure. Ajouter un deuxième incision tout le chemin à travers le pharynx enlever la mâchoire inférieure (figure 1B). </li><li> En utilisant des pinces standard, retirer toute la peau de la surface du crâne par éplucher loin (figure 1C) et retirer frontales et pariétales os, révélant cerveau. </li><li> Du point de vue ventrale, retirez pharyngée cartilage et mésenchyme auxiliaire. </li><li> Du point de vue dorsale, attentionLy supprimer mésenchyme dorsale du cerveau postérieur en prenant soin de ne pas endommager Pia, et tout le cerveau séparé (figure 1D). </li><li> Assurez incision tout le chemin à travers le tissu entre mésencéphale et du cerveau postérieur et cerveau postérieur séparé comprenant cervelet (figure 1E). </li><li> En faisant des incisions tout le chemin à travers le tissu à deux jonctions latérales du cervelet et de la plaque alaire du cerveau postérieur, retirez toute cervelet, en prenant soin de maintenir l&#39;intégrité de la pie au long de la dissection (figure 1F). Retirez le plexus choroïde de formation (figure 1G). </li><li> Déplacez le cervelet disséqué dans glacée HBSS. </li></ol> 2. Tranche Culture de e14 Cerebellum <ol><li> Transférer toute cervelet à la plate-forme stérile d&#39;un tissu Chopper aide d&#39;une spatule ou d&#39;un 3 ml pipette Pasteur avec le bout coupé pour élargir l&#39;ouverture. Retirer l&#39;excès de liquide à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Couper toute entière cervelet en til nécessaire orientation à 300 um d&#39;épaisseur en utilisant le broyeur de tissu ensemble avec une vitesse de coupe à 50% du maximum. L&#39;intégrité des tissus est plus facilement conservé dans la section sagittale; Toutefois, l&#39;orientation est également un facteur important pour l&#39;analyse de cellule (dendrites des cellules de Purkinje sont sagittale alignés, tandis que les axones des cellules granulaires courent transversalement, perpendiculairement au plan de dendrites des cellules de Purkinje). </li><li> Utilisation d&#39;un 3 ml pipette Pasteur, couvrir le cervelet en tranches dans la glace HBSS froid. </li><li> Transférer les tranches dans un plat HBSS à 60 mm Petri contenant de la glace froide HBSS frais en utilisant un 3 ml pipette Pasteur avec la pointe de coupe. </li><li> Sous un microscope de dissection éclairé par une source de lumière de fibre optique, assurer la séparation des tranches individuelles aide de pinces horloger. Identifier les tranches à électroporation, en fonction de leur intégrité des tissus et la position médio-latérale. Remarque: Chaque dissection de l&#39;embryon grâce à trancher incubation dans un milieu de culture prend environ 10-20 min selon upon expérience. Effectuer dissections un à la fois pour assurer que cerebella passer un minimum de temps entre la décapitation et la culture ex vivo. </li></ol> 3. L&#39;électroporation de tranches <ol><li> Construction d&#39;une chambre d&#39;électroporation en fixant l&#39;anode d&#39;un électroporateur à la base d&#39;une boîte de Petri de 60 mm avec du ruban isolant. Ajouter environ 1 ml de HBSS pour couvrir l&#39;électrode. </li><li> Placer un insert de 0,4 um de la culture au-dessus de l&#39;électrode couvert dans du HBSS. Permettre à l&#39;insert de culture de se reposer sur l&#39;électrode en vous assurant qu&#39;il est toujours un contact entre l&#39;insert et l&#39;électrode. Remarque: Dans cette configuration, l&#39;insert de culture avec les tranches reposera sur la surface de la solution, le maintien du circuit, mais permettant un ciblage spatial de la cathode. </li><li> Tranches de transfert identifiés (jusqu&#39;à cinq par insert de culture) sur insert de culture en utilisant 3 ml pipette Pasteur avec la pointe de coupe. Indépendante et laisser reposer sur insert de culture dans un sagittorientation al. </li><li> En utilisant une pipette, éliminer l&#39;excès de HBSS sorte que les tranches ne sont plus baignés dans une solution. </li><li> En utilisant une pointe de pipette P10, de l&#39;ADN de pipette (à une concentration de 1 ug / ul), dilué avec 20% de vert rapide sur la surface de la région cible d&#39;une tranche. 20% de vert rapide assure solution d&#39;ADN visqueux et empêche prohibitif grande dispersion de l&#39;ADN. Ajouter la solution verte d&#39;environ 5 ul d&#39;ADN / rapide à chaque tranche (figure 2B). </li><li> Placez la cathode sur tissu ciblé souhaité et l&#39;électroporation avec 3 x 10 V, 10 impulsions de msec. Eviter le contact direct de la cathode avec le tissu. Au lieu de cela, profiter de la tension de surface du liquide pour maintenir la conductance (placer la cathode au plus près du tissu que possible sans le toucher du tissu). </li><li> Répétez la livraison de l&#39;ADN et l&#39;électroporation à plusieurs régions de EGL sur chaque tranche cérébelleuse individu comme souhaité. </li><li> À la fin de l&#39;électroporation, la culture de transfert Insert à 30 mm boîte de Petri. </li><li> Pour chaque culture, ajouter 1 ml de milieu de culture préchauffé (Basal Medium aigle, 0,5% (p / v) D - (+) - glucose, supplément de B27 1%, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine) en dessous de l&#39;insert de culture de telle sorte que l&#39;insert de culture est en contact avec le milieu, mais des tranches ne sont pas baigné en elle. </li><li> Incuber les cultures à 37 ° C / 6% de CO2 pendant jusqu&#39;à 3 jours. Remplacez tout le milieu de culture tous les 24 heures avec un milieu préchauffé frais. </li><li> Après la culture, de fixer des tranches sur la culture insère pendant 1 h à 4% de paraformaldéhyde (ou O / N à 4 ° C) dans un plat frais de 30 mm sans les milieux de culture. </li></ol> 4. Imagerie de cervelet tranches <ol><li> Après la fixation, laver tranches 3 fois pendant 5 min dans du PBS. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, disséquer chaque tranche cérébelleuse électroporation et cultivée de l&#39;insert de culture en coupant autour de la tranche et en supprimant la tranche et la région de l&#39;insert, il est respecté. Fairepas tenter de retirer une tranche de la surface de l&#39;insert de la culture. </li><li> Tranches de montage dans environ 1 ml de milieu de montage contenant DAPI (si désiré) sous une lamelle en prenant soin de ne pas introduire de bulles, et de l&#39;image en utilisant le laser-microscopie confocale à balayage. Remarque: des paramètres d&#39;images peuvent être modifiées selon les constructions électroporation, et à la discrétion de l&#39;utilisateur individuel. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour disséquer, électroporation et la culture tranches de jour embryonnaire 14 cervelet du poussin. Ce protocole permet le ciblage de l&#39;électroporation aux petites régions focales de l&#39;EGL, y compris le ciblage isolé de lobes cérébelleux individuels. Il permet l&#39;analyse génétique et de l&#39;imagerie à haute résolution et de commodité, et à un faible coût par rapport à des techniques établies chez les rongeurs 43-47. Cette analyse est actuellement pas p...

Le cervelet se trouve à l&#39;extrémité antérieure du cerveau postérieur et est responsable de l&#39;intégration du traitement sensoriel et moteur dans le cerveau mature ainsi que la régulation des processus cognitifs supérieurs 1. Chez les mammifères et les oiseaux, il possède une morphologie complexe et est fortement feuilleté, un produit de grande amplification des progéniteurs de transit au cours du développement, qui produit plus de la moitié des neurones dans le cerveau adulte. Le cervelet a été un sujet d&#39;étude pour les neurobiologistes pour des siècles et dans l&#39;ère moléculaire a également reçu beaucoup d&#39;attention. Cela concerne non seulement à sa biologie intrinsèquement intéressante, mais aussi au fait qu&#39;il est fortement impliqué dans les maladies humaines, y compris les troubles génétiques de développement tels que les troubles du spectre autistique 2 et plus en évidence le cancer du cervelet, médulloblastome 3, qui est le cerveau pédiatrique la plus répandue tumeur. Surtout, il est un excellent système de modèle au sein de which pour étudier la répartition de sort et la neurogenèse au cours du développement du cerveau 4. Au cours des dernières années, il a également été établi comme un système modèle pour l&#39;étude comparative du développement du cerveau, en raison de la grande diversité des formes cérébelleux vu à travers la phylogénie des vertébrés 5-10. Le cervelet se développe à partir de la moitié dorsale de rhombomère 1 dans le cerveau postérieur et de développement 11 est constitué de deux populations de cellules progénitrices primaires, la lèvre rhombique et la zone ventriculaire. La lèvre rhombique étend autour de la région dorsale de la neuroépithélium du cerveau postérieur à la frontière avec la plaque de toit. Il est le lieu de naissance des neurones excitateurs glutamatergiques du cervelet 12-14. La zone ventriculaire donne lieu à des neurones inhibiteurs GABAergiques cérébelleux, le plus en évidence les grands neurones de Purkinje 14,15. Plus tard dans le développement (d&#39;environ jour embryonnaire 13,5 chez la souris; e6 en poussin 16), glutamatergique Progenvisi- migrer tangentiellement à partir de la lèvre rhombique et forment une couche piale progéniteurs: une zone de progéniteur secondaire appelée la couche de granulés externe (EGL). Il est de cette couche qui subit l&#39;amplification très étendue de transit qui conduit à le grand nombre de neurones granulaires présents dans le cerveau mature. Prolifération dans le EGL a longtemps été associé à l&#39;emplacement du sous-pial qui résulte de la migration tangentielle à partir de la lèvre rhombique 17, avec le commutateur de sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale de progéniteurs étant associée à leur sortie de la couche EGL extérieur dans le milieu EGL 18. La migration tangentielle étendue de cellules granulaires post-mitotiques dans l&#39;axe médio-latérale se produit dans la moyenne et interne EGL 19, avant la migration radiale finale dans la couche intérieure de granules du cortex cérébelleux mature. Migration de cellules de la lèvre rhombique sur la surface du cervelet dépend signalisation CXCL12 de la pie-20-22 </sup&gt; Cellules granulaires et expriment le récepteur CXCR4 CXCL12. Leur migration tangentielle est donc sans rappeler celui de la migration des populations tangentiellement néocortex des interneurones inhibiteurs 23-25. Curieusement, études au microscope électronique 17 ont suggéré que les cellules EGL avec une morphologie proliférative maintenir le contact pial, reliant le comportement des cellules avec une capacité de prolifération d&#39;une manière qui rappelle les progéniteurs basales du cortex des mammifères 26. Ceci se reflète dans la stratification précitée de la EGL en trois sous-couches qui sont définies par des environnements extracellulaires distinctes et où granulés précurseurs ont l&#39;expression du gène 18 signatures distinctes. Prolifération des progéniteurs dans la oEGL se produit avec une distribution normale des tailles de clones de sorte que lorsque les progéniteurs sont génétiquement marquées individuellement à la fin du développement embryonnaire chez la souris, ils donnent lieu à une moyenne médiane de 250 à 500 g postmitotiqueneurones ranule 27,28. Prolifération dépend de signalisation SHH mitogénique sous-jacents neurones de Purkinje 29-32. La capacité à répondre à SHH a été montré pour être entièrement dépendant de cellule autonome expression du facteur de transcription Atoh1, à la fois in vitro et in vivo 33 34,35. De même, la sortie du cycle cellulaire et de la différenciation a été démontré que l&#39;expression dépendant du facteur de transcription en aval NeuroD1 36, ce qui est probablement un répresseur directe de Atoh1 37. Malgré ces progrès, et le progrès considérable à déchiffrer la base biologique de la cellule de sortie du cycle cellulaire 38-42, le mécanisme moléculaire fondamentale (s) qui sous-tendent la décision de quitter le cycle cellulaire et la transition d&#39;un ancêtre à un neurone de différenciation, et la la migration tangentielle postmitotique associé dans le EGL intérieure ainsi que l&#39;interrupteur tardà la migration radiale, restent mal compris. Ceci est dans une large mesure en raison de l&#39;intransigeance de l&#39;EGL expérimentale: il est tard en développement et difficiles à cibler génétiquement puisque bon nombre des mêmes molécules neurogènes sont également cruciales tôt dans la vie des précurseurs de granulés à la lèvre rhombique. Pour surmonter ce problème, de nombreux auteurs ont développé in vivo et ex vivo électroporation comme une méthode pour cibler le cervelet postnatale chez les rongeurs 43-48. Ici, nous Pioneer l&#39;utilisation des ex vivo électroporation dans poussin pour étudier le EGL, ce qui représente des avantages considérables en termes de coût et de commodité. Notre méthode d&#39;électroporation et ex vivo tranche culture de tissu cérébelleux poussin utilise le tissu disséqué jour embryonnaire 14 poussins au sommet de EGL prolifération. Cette méthode permet le ciblage génétique de l&#39;EGL indépendamment de la lèvre rhombique et préparera le terrain pour la dissection génétique de la transition de granuleprogéniteur de neurone post-mitotiques granule dans le cervelet.

<table><tbody><tr><td>Hachoir à mouchoirs McIlwain</td><td>Mickle Laboratory Engineering Ltd</td><td></td><td>Coupe à 300 &mu ; m pour les meilleurs résultats.</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (Gibco)</td><td>Life Technologies</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &mu ; insert de culture m</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>TSS20 Ovodyne électroporateur&nbsp ;</td><td>Intracel</td><td>01-916-02</td><td>Utilisez 3 impulsions de 10 V, 10 ms pour l’électroporation.</td></tr></tbody></table>

culture ex vivo de chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

La couche externe de granules cérébelleux (EGL) est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement, et un excellent modèle pour l&#39;étude de la prolifération et de la différenciation neuronale. En outre, les modifications évolutives de sa capacité proliférative ont été responsables de l&#39;expansion spectaculaire de la taille du cervelet dans les amniotes, rendant le cervelet un excellent modèle pour les études évo-dévo du cerveau des vertébrés. Les cellules constitutives de l&#39;EGL, progéniteurs granulaires du cervelet, représentent également une cellule d&#39;origine significatif pour le médulloblastome, la tumeur pédiatrique neuronale la plus répandue. Après un transit amplification, précurseurs granules migrent radialement dans la couche granulaire interne du cervelet où ils représentent la plus grande population de neurones dans le cerveau des mammifères mature. En poussin, le pic d&#39;EGL prolifération se produit vers la fin de la deuxième semaine de gestation. Afin de cibler la modification génétique de cette couche aule pic de la prolifération, nous avons développé une méthode de manipulation génétique par électroporation ex vivo de tranches de cervelet de jour embryonnaire 14 embryons de poulet. Ce procédé reprend plusieurs aspects importants de granule développement in vivo de neurones et sera utile pour générer une compréhension approfondie de la prolifération des cellules du cervelet de granulés et de la différenciation, et donc du développement de cervelet, l&#39;évolution et la maladie.

Cette section présente des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant tranche électroporation et la culture du cervelet jour embryonnaire 14 poussin. La dissection du cervelet est illustré sur la Figure 1 et la chambre d&#39;électroporation mis en place est représenté sur la Figure 2. On montre qu&#39;il est possible pour l&#39;électroporation et avec succès la culture des tranches de cervelet, qui conservent leur structure et morphologi...

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

L'objectif général de cette procédure est de cibler une modification génétique à la couche germinative externe du cervelet de poulet afin d'observer, d'examiner et de modifier la morphologie et le comportement des cellules granulaires dans un environnement ex vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie du développement, telles que la manière dont les progéniteurs neuronaux migrent, se multiplient et se différencient. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre des bénéfices considérables en termes de coût et de commodité associés aux études.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le développement des granules chez le poulet, elle peut également être appliquée à d'autres organismes modèles tels que les reptiles et les mammifères. Pour commencer, placez des œufs de poule bruns fécondés dans une incubatrice à 38 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade embryonnaire. Au jour 14 du développement embryonnaire, faites une ouverture dans l'œuf afin d'exposer l'embryon, puis décapitez l'embryon de poulet in ovo.Placer la tête dans une boîte de Pétri contenant du PBS glacé sous microscope stéréo. Utiliser des pinces standard pour pratiquer une incision derrière chaque œil, traversant complètement le tissu, et retirer les yeux ainsi que la mâchoire supérieure. Ensuite, pratiquer une seconde incision traversant complètement le pharynx afin de retirer la mâchoire inférieure.Ensuite, utilisez des pinces standard pour retirer la peau de la surface du crâne en la décollant. Puis retirez les os frontaux et pariétaux afin de découvrir le cerveau depuis une vue ventrale. Retirez le cartilage pharyngien et le mésenchyme accessoire.Ensuite, placer le cerveau avec la face dorsale vers le haut et retirer soigneusement le mésenchyme situé au-dessus du cervelet, en prenant soin de ne pas endommager le p. Puis, pratiquer une incision complètement à travers le tissu entre le mésencéphale et le cervelet afin de détacher le cervelet, y compris le cervelet. Effectuer des incisions complètes à travers le tissu au niveau des deux jonctions latérales entre le cervelet et la plaque alaire du cervelet.Retirer entièrement le cervelet en prenant soin de préserver l'intégrité de l'arachnoïde tout au long de la dissection. Enfin, retirer le plexus choroïde en formation et transférer le cervelet disséqué dans du HBSS glacé. Transférer le cervelet entier sur la plateforme stérile d’un coupe-tissu à l’aide d’une spatule ou d’une pipette Pasteur de trois millilitres dont l’extrémité a été émoussée.Pour élargir l'ouverture, retirez tout liquide excédentaire à l'aide d'une pipette. Réglez la vitesse de coupe du hacheur de tissus à 50 % de sa valeur maximale. Ensuite, coupez le cervelet dans l'orientation requise avec une épaisseur de 300 micromètres à l'aide d'une pipette Pasteur de trois millilitres.Couvrir le cervelet tranché avec du HBSS froid. Ensuite, transférer le HBSS et les tranches vers une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant 20 millilitres de HBSS glacé à l’aide d’une pipette Pasteur de trois litres à embout coupé, puis placer la boîte de Pétri sous un microscope stéréoscopique éclairé par une source lumineuse à fibre optique. Utiliser ensuite une pince de bijoutier pour séparer les tranches individuelles de tissu cérébral et identifier les tranches à électroporer en fonction de leur intégrité tissulaire et de leur position médio-latérale.Construire une chambre d'électroporation en fixant l'anode d'un électro à la base d'une boîte de Pétri de 60 millimètres. À l'aide de ruban isolant, ajouter environ un millilitre de HBSS pour recouvrir l'électrode. Placer ensuite une culture de 0,4 micromètre.Placer au-dessus de l'électrode recouverte de HBSS. Utiliser une pipette Pasteur de trois millilitres à embout coupé pour transférer les tranches identifiées, jusqu'à cinq par insert, sur l'insert de culture. Ensuite, séparer les tranches et les laisser se déposer sur la culture.Insérez en orientation sagittale. À l’aide d’une pipette, retirez le milieu excédentaire des tranches de cerveau. Laissez l’insert reposer sur l’électrode afin qu’il y ait un contact entre l’insert et l’électrode.Dans ce dispositif, l'insert de culture portant les tranches repose à la surface du milieu, préservant ainsi le circuit, tout en permettant un ciblage spatial de la cathode. À l’aide d’une pipette P 10, déposez cinq microlitres d’ADN dilué dans 20 % de bleu rapide sur la surface d’une région ciblée de chaque tranche.L'ajout de vert rapide garantit que la solution d'ADN est suffisamment visqueuse pour empêcher une large dispersion de l'ADN. Ensuite, placez l'électrode négative sur le tissu cible souhaité et ajoutez l'électrolyte aux échantillons. Évitez tout contact direct entre l'électrode négative et le tissu en plaçant celle-ci aussi près que possible du tissu sans toutefois le toucher.Répétez l'électroporation dans plusieurs régions de la couche granulaire externe sur chaque tranche cérébelleuse individuelle selon les besoins. Une fois terminé, transférez l'insert de culture dans une boîte de Pétri de 30 millimètres. Ajoutez un millilitre de milieu de culture préchauffé sous chaque insert de culture.Veillez à ce que l'insert ne flotte pas dans le milieu. L'insert de culture doit être en contact avec le milieu, mais les tranches ne doivent pas y être immergées. Incubez les cultures jusqu'à trois jours en renouvelant intégralement le milieu de culture.Changer le milieu toutes les 24 heures par du milieu frais préchauffé après la mise en culture. Transférer les tranches sur les inserts de culture dans une boîte de 30 millimètres contenant du paraformaldéhyde à 4 % pendant une heure. Veiller à ajouter le paraformaldéhyde par-dessus la culture.Insérer une fois fixé. Laver les tranches trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune. Ensuite, utiliser des ciseaux ophtalmiques pour disséquer chacune des tranches cérébelleuses électroporées et cultivées à partir de la culture.Insérez en découpant autour de chaque section et en la retirant avec la région associée du fragment d'insertion. N'essayez pas de retirer la section de la surface de l'insertion. Montez les sections dans environ un millilitre d'un milieu de montage choisi sous une lamelle, en prenant soin de ne pas introduire de bulles.Une fois les lames sèches, récupérez les lames et réalisez leur imagerie à l’aide d’un balayage laser. Microscopie confocale calbindine. La coloration d’un tissu cérébelleux E14 est montrée ici en rouge après électroporation avec un plasmide GFP contrôle à un, deux et trois jours en culture.La coloration constante de la calbindine montre que l'intégrité du tissu est préservée en culture pendant au moins trois jours in vitro. Voici des images à faible grossissement de plasmides codant pour RFP et GFP qui ont été électroporés avec succès dans la couche granuleuse externe à divers emplacements. Le plasmide GFP a été ciblé vers une seule fum, comme indiqué par l'astérisque.Un exemple est montré ici où un construit codant pour la GFP sous la commande d'un amplificateur 8 0 1 a été électroporé dans la couche granulaire externe. L'expression du 8 0 1 délimite les précurseurs des cellules granulaires au sein de la couche granulaire externe. Diverses morphologies cellulaires sont clairement visibles trois jours après la culture in vitro, et le comportement cellulaire peut être surveillé.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment électroporer individuellement des tranches cérébelleuses à l’aide d’une variété d’outils génétiques afin d’observer et de manipuler le développement des cellules granulaires. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'intégrité structurelle du tissu et la localisation relative de différents types cellulaires, tels que les cellules de Pourkinje ou les cellules gliales de Bergmann. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures pour une douzaine d'embryons de poulet, si elle est effectuée correctement.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous présentons ici une méthode pour isoler et cultiver des cellules granulaires du cervelet et les neurones neurones progénitrices granulaires du cervelet de souris postnatale.

Isolement et culture de la Post-Natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices Neuron et les neurones

Dans cette vidéo, nous effectuons l’électroporation de tranches de cervelet d’embryons de poulet avec des plasmides de gènes rapporteurs. La technique facilite la visualisation du développement et de la migration des précurseurs de cellules granulaires pour former une couche granulaire.

Électroporation ex vivo de tranches cérébelleuses d’embryons de poulet : une méthode d’introduction d’ADN plasmidique codant pour une protéine fluorescente verte pour visualiser le développement cellulaire granulaire

La vidéo montre la préparation des tranches de cervelet. Il montre une procédure détaillée pour isoler le cervelet d’un embryon de poulet. Les tranches sont ensuite préparées à partir du cervelet disséqué à l’aide d’un hachoir à tissus pour une analyse expérimentale plus approfondie.

Obtention de tranches de cervelet à partir d’un cerveau de poussin embryonnaire

Source : Chan, U., et al., Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones granulaires cérébelleux et le développement des synapses. J. Vis. Exp. (2021).Cette vidéo démontre l’analyse du développement des neurones granulaires cérébelleux en imageant des tranches de tissu cérébral préfixées de souris marquées avec une protéine fluorescente, Capturer des images haute résolution de la pile Z avec un microscope confocal et mesurer les paramètres...

Visualisation de la synaptogenèse des neurones granulaires cérébelleux à différents stades de développement

Source : Bénard, M., et al. Ex Vivo Imagerie de la migration cellulaire granulaire cérébelleuse postnatale à l’aide de la macroscopie confocale. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo présente une méthode macroscopique confocale pour suivre la migration ex vivo des cellules granulaires dans des tranches cérébelleuses à partir de cerveaux de rats postnatals.

Imagerie ex vivo de la migration postnatale des cellules granulaires cérébelleuses à l’aide de la macroscopie confocale

Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l'évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Au cours du développement postnatal du cervelet, les cellules granulaires immatures provenant de la zone germinale présentent des modalités de migration distinctes pour atteindre leur destination finale et établir des réseaux neuronaux. Ce protocole décrit la préparation des coupes cérébelleuses et l’approche macroscopique confocale utilisée pour étudier les facteurs qui régulent la migration neuronale.

Ex Vivo Imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale Macroscopie

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Études classiques de perte de la fonction des gènes à l’aide d’animaux knock-out ont souvent été coûteux et long. Axée sur l’électroporation de mutagenèse induite par CRISPR somatique est un outil puissant pour comprendre les fonctions de gènes in vivo. Nous rapportons ici une méthode pour analyser les phénotypes d’élimination directe dans les cellules en prolifération du cervelet.

CRISPR induite par la perte de fonction dans cervelet granules des cellules utilisant In Utero électroporation basée sur un transfert de gènes

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser la synaptogenèse des neurones granulaires dans le cervelet de la souris au cours du développement cérébral postnatal lorsque ces cellules affinent leurs structures synaptiques et forment des synapses pour s’intégrer dans le circuit cérébral global.

Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses

Nous présentons ici un protocole d’électroporation in vitro reproductible pour la manipulation génétique des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires (GCP) qui est rentable, efficace et viable. De plus, ce protocole démontre également une méthode simple pour l’étude moléculaire des voies de signalisation primaires du hérisson dépendantes du cilium dans les cellules GCP primaires.

Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires

Découvrez l'électroporation ex vivo du cervelet de poulet pour étudier la morphologie des cellules granuleuses. Cette méthode permet d'analyser la migration et la différenciation des progéniteurs neuronaux.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

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