Name: Immunoprécipitation de la chromatine test pour lidentification de Arabidopsis interactions protéine-ADN In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Découvrez l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour identifier les interactions protéine-ADN chez Arabidopsis. Cette méthode capture les changements de l'organisation chromatinienne et révèle la régulation génique in vivo.

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Les auteurs tiennent à remercier The Plant Cell d’avoir permis l’utilisation de certaines données publiées dans cette revue pour élaborer les résultats représentatifs décrits ici à la figure 4. Ce travail a été soutenu par le réseau de formation initiale Marie Curie du 7FP de l’UE EpiTRAITS (accord de subvention 316965), et par le Ministerio de Economìa y Compétividad espagnol (subventions BIO2010-15589 et BIO2013-43098-R).

1. réticulation du matériel végétal (1 h) <ol><li> Cultiver les lignées d&#39;Arabidopsis utilisés dans l&#39;expérience (de type sauvage - WT - contre les mutants, et / ou lignées exprimant la version étiqueté de votre protéine d&#39;intérêt par rapport lignées exprimant la balise pas fusionnés à toute protéine) pendant 12-18 jours sur de grandes boîtes de Pétri (150 mm) avec du milieu MS-agar (1 L: sels de Murashige &amp; Skoog 1x, 10 g de saccharose, 0,5 g de MES, pH 5,7 (KOH), 1% de gélose). Alternativement, cultiver des plantes sur des pots contenant 3: 1 mélange de terre et de vermiculite. ATTENTION! Le formaldéhyde est toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion, et doit être manipulé dans une hotte chimique de porter un équipement de protection individuelle approprié. Les étapes 1.2 à 1.6 doit être effectué sous la hotte. </li><li> Faire des petits trous dans le couvercle des tubes de 50 ml avec une aiguille de brûleur chauffe-laboratoire. Ajouter 40 ml de PBS 1x tampon et 1,08 ml de formaldéhyde à une concentration finale de 1% (37% de stock solution). Recueillir 1,5 g de matière végétale dans ces tubes de 50 ml. Gardez les tubes sur la glace lors de la réticulation. </li><li> Fermer les tubes de 50 ml avec le couvercle. Placer les tubes dans un dessiccateur et appliquer le vide. Vide infiltrer le tissu pendant 10 min, puis relâchez attentivement le vide, pour empêcher barattage jusqu&#39;à la solution. Mélanger l&#39;échantillon. Répéter deux fois. Après infiltration, observer le matériel végétal et confirmer qu&#39;il devient légèrement translucide et ont tendance à couler au fond du tube (Figure 2). </li><li> Ajouter 2,5 ml de 2 M de glycine pour obtenir une concentration finale de 0,125 M. Appliquer vide pendant 5 min. La glycine agit comme un inhibiteur compétitif de formaldéhyde réticulation. </li><li> Jeter la solution de formaldéhyde-glycine PBS en inversant le tube fermé de 50 ml, avec des trous dans le couvercle. </li><li> Rincer les plantules deux fois avec PBS 1x et une fois avec de l&#39;eau de jeter la solution de lavage comme décrit dans l&#39;étape 1.5. Séchez-les sur une serviette en papier et geler dans nitroge liquiden. NOTE: Le tissu congelé peut être conservé à -80 ° C pendant plusieurs semaines. </li></ol> 2. Préparation des anticorps (1 jour) NOTE: Pour l&#39;immunoprécipitation, l&#39;utilisation de billes magnétiques conjuguées à des anticorps via une protéine G ou la protéine A de liaison à forte affinité pour le domaine constant de la chaîne lourde d&#39;anticorps est recommandée. Les complexes ADN-protéines peuvent se fixer de manière non spécifique à la surface des conjugués anticorps-perles. Pour cette raison, il est nécessaire d&#39;effectuer des contrôles sans anticorps spécifiques pour quantifier la liaison de fond non spécifique. <ol><li> Pour chaque immunoprécipitation, préparer 15 pi de billes magnétiques dans un tube de 1,5 ml. La quantité de perles dépend de la quantité de la chromatine utilisés pour l&#39;immunoprécipitation et également sur les anticorps. </li><li> Pour laver, ajouter 1 ml de Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) tampon de dilution pour les perles, mélanger par rotation et placez le 1,5 ml microcentrifugeuse tuêtre dans un rack magnétique. Attendez environ 1 min de laisser les perles attachent à l&#39;aimant. Avec les 1,5 ml microtubes encore dans le rack, retirez le surnageant par pipetage. Répéter deux fois. NOTE: Pour chaque ligne de l&#39;usine deux ensembles d&#39;immunoprécipitation sont nécessaires: l&#39;un avec des perles et des anticorps (AB) et un second pas d&#39;anticorps (Pas-Ab) de contrôle avec des billes magnétiques seulement. </li><li> Remettre en suspension les billes dans 200 pl de tampon de dilution ChIP. Ajouter la quantité requise de l&#39;Ab spécifique à l&#39;un des deux tubes préparés pour chaque ligne de l&#39;usine (la dilution exacte diffère pour chaque Ab et doit être optimisé expérimentalement ou, dans le cas d&#39;anticorps commerciaux, suivez les instructions du fabricant). Utilisez cet exemple pour l&#39;immunoprécipitation. Ajouter la même quantité de IgG non spécifique à l&#39;autre tube, qui sera utilisé comme contrôle négatif. </li><li> Incuber O / N sur une roue tournant à 4 ° C pour laisser l&#39;anticorps joindre aux billes. </li></ol> 3. Extraction de la chromatine (4 h) </p&gt; <ol><li> Broyer soigneusement le matériel végétal congelé dans l&#39;azote liquide en utilisant un mortier et un pilon jusqu&#39;à ce que la poudre devient verte homogène et de la lumière. Transférer la poudre dans un nouveau tube de 50 ml. </li><li> Pour les étapes 3.2 - 3.6, le travail sous la hotte. Ajouter 30 ml de tampon d&#39;extraction (1 ExB 1), et bien mélanger à tremper la poudre de tissu. De cette étape sur, conserver les échantillons à 4 ° C en tout temps. Le tissu congelé et les restes d&#39;azote liquide pourrait causer le tampon de geler. Assurez-vous de décongeler le tissu congelé complètement en inversant les tubes 4-5 fois toutes les 2 min. </li><li> Décochez la boue en le faisant passer à travers un tissu de filtration avec une taille de pores de 22-25 um dans un nouveau tube de 50 ml et centrifuger à 1000 g pendant 20 min à 4 ° C. NOTE: Dans cette étape, les noyaux et tous les organites se sédimenter. ExB 1 contient suffisamment de saccharose pour fournir une haute densité et empêcher la rupture de la structure des organites. </li><li> Retirer délicatement le surnageant par décantation. A ce stage, observer une pastille verte d&#39;environ 2 ml. </li><li> Reprendre le culot dans 5 ml de ExB 2. La remise en suspension de la pastille sera difficile à ce stade. Centrifugeuse à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C. REMARQUE: ExB 2 contient 1% de Triton X-100 pour aider à éclater les chloroplastes ouverte et enlever la chlorophylle. </li><li> Reprendre le culot dans 300 pi de tampon d&#39;extraction 3 (ExB 3). </li><li> Dans un tube de micro propre, ajouter 600 pi de ExB 3. Prenez le culot remis en suspension de l&#39;étape 3.6 et soigneusement couche sur le dessus de l&#39;ExB propre 3. </li><li> Spin pendant 1 heure à 16 000 g à 4 ° C. NOTE: Cette étape permet d&#39;enlever le détergent de l&#39;échantillon. </li><li> Enlever le surnageant par aspiration avec une pipette. Reprendre le culot nucléaire dans 300 ul de tampon de sonication en pipettant doucement vers le haut et vers le bas pour éviter la formation de bulles, ce qui peut affecter l&#39;efficacité du traitement par ultrasons. Pipetter prudemment toute la suspension sur et le transférer à un tube de 1,5 ml à centrifuger propre. NOTE: Cetampon contient SDS, pour lyser les noyaux et relâchez la chromatine. </li><li> Sonication de la suspension à lyser les noyaux de façon aléatoire et cisailler la chromatine en petits fragments. Utilisez conditions de sonication qui rendent la chromatine enrichie en fragments entre 200-800 pb (20-30 cycles avec les paramètres 30 sec ON / OFF 30 sec à 4 ° C pour le dispositif de sonication disponibles décrit dans la Table des matières / réactifs). Vérifier l&#39;efficacité du traitement par ultrasons par séparation électrophorétique des fragments d&#39;ADN obtenus sur gel d&#39;agarose 13, 2 pi de chargement chromatine traitée par ultrasons (figure 3). ATTENTION! Assurez-vous de porter des équipements de protection auditive lors de l&#39;étape de sonication en cas l&#39;appareil à ultrasons ne sont pas contenues dans une armoire insonorisée. Étape cruciale! La fragmentation de la chromatine dépend en grande partie de l&#39;équipement de traitement par ultrasons. Les conditions de sonication doivent être ajustées pour parvenir à l&#39;enrichissement dans les tailles des ADN appropriés. VoirFigure 3 pour un exemple de la façon d&#39;optimiser la fragmentation de la chromatine. </li><li> Spin la solution une fois à 12000 g pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant par pipetage à un tube de 1,5 ml à centrifuger propre. Jeter le culot. Prenez 1/10 du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml, le marquer comme entrée et le gel à -20 ° C. </li><li> Diluer la chromatine 10x avec un tampon de dilution ChIP pour diluer SDS à une concentration finale de 0,1%. Note: Les échantillons peuvent être congelés et conservés à -20 ° C pendant plusieurs semaines. </li></ol> 4. immunoprécipitation de la protéine d&#39;intérêt et de sauvetage de l&#39;ADN (1 jour, 3 heures) <ol><li> Laver les billes revêtues de l&#39;étape 2.4 à partir de Ab trois fois avec 1 ml de tampon de dilution de ChIP pour éliminer l&#39;excès d&#39;anticorps de la manière décrite dans l&#39;étape 2.2. Remettre en suspension dans 200 pi de tampon de dilution ChIP. Ajouter 50 pi de la chromatine isolée. Incuber O / N sur une roue tournant à 4 ° C. NOTE: Consultez les concentrations dsur de la chromatine dans microvolume spectrophotomètre UV-Vis. 50 ul de la chromatine isolée doivent contenir plus de 10 ug d&#39;ADN. </li><li> Pour les étapes des travaux de 4,2-4,5 à 4 ° C. Laver les billes deux fois dans 1 ml de tampon de lavage faible teneur en sel comme décrit dans l&#39;étape 2.2. </li><li> Laver les billes une fois dans 1 ml de tampon de lavage à haute sel. </li><li> Laver les billes une fois dans 1 ml de tampon de lavage LiCl. </li><li> Laver les billes deux fois dans 1 ml de tampon TE. Après le dernier lavage, assurez-vous de supprimer complètement le tampon TE gauche dans le tube par aspiration avec une pipette. </li><li> Sortez les échantillons d&#39;entrée (étape 3.9). Transfert 5 pi de l&#39;entrée dans un nouveau tube de 1,5 ml et continuer comme avec les échantillons de copeaux. Inverse de réticulation par addition de 200 ul de résine de 5% chélatrice échangeuse d&#39;ions, et incuber pendant 10 min à 95 ° C en secouant toutes les 2-3 min. Isoler à 16.000 g pendant 30 sec et transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube par pipetage. REMARQUE: Alors que le traProcédé de réticulation d&#39;inversion conditionnelle comporte un rapport O / N incubation avec du NaCl, l&#39;incubation avec une résine chélatante d&#39;ions à 95 ° C permet de déréticulation et élution de l&#39;ADN dans les 10 min efficace, rendant ainsi le protocole jour une plus courte. </li><li> Ajouter 2 ul de proteinase K (10 mg / ml) et incuber à 37 ° C pendant 30 min à digérer les protéines et de libérer l&#39;ADN. </li><li> Arrêter la réaction par incubation à 95 ° C pendant 10 min. </li><li> Tourner rapidement à 16.000 g pendant 30 sec et transférer le surnageant dans un nouveau tube par pipetage. </li><li> Nettoyez l&#39;ADN isolé en utilisant un kit de purification de fragments d&#39;ADN standard. REMARQUE: Procédez selon les instructions du fabricant. </li><li> Transférer la colonne liaison à l&#39;ADN à partir du kit à un nouveau tube de 1,5 ml à centrifuger. Eluer l&#39;ADN purifié en ajoutant 20 pi d&#39;eau exempte de DNase à l&#39;axe de la colonne et tournant à 16 000 xg pendant 60 sec. Point d&#39;arrêt: Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs semaines. </li></ol&gt; 5. Mesure abondance des sites de liaison à l&#39;ADN immunoprécipitée par qPCR (4 h) REMARQUE: l&#39;ADN isolé de la chromatine précipitée doit être analysé afin de déterminer les fragments d&#39;ADN ont été ChIP-ed de la chromatine totale, en raison de sa liaison à la protéine d&#39;intérêt. <ol><li> Des amorces de conception pour les régions génomiques d&#39;intérêt avec une température de fusion (Tm) de 60 ° C et une teneur en GC de 30% à 80%. Comme la chromatine est fragmenté par sonication, la longueur de la séquence amplifiée ne devrait pas être plus long que les nucleotides 150-200 (tableau 1). REMARQUE: Un outil utile pour la conception d&#39;amorce est Primer 3 programme (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Des lignes directrices supplémentaires pour la conception d&#39;amorce sont disponibles dans les rapports précédents 8, 14,15. </li><li> Utilisez un programme BLAST pour vous assurer que les amorces sont spécifiques (en particulier les promoteurs peuvent partager des séquences de liaison TF similaire) et de tester l&#39;usin d&#39;efficacité primaireg dilutions 1:10 dans de l&#39;eau de l&#39;ADN d&#39;entrée (étape 4.9). Certaines régions du génome seront purifiés mieux que d&#39;autres. Il est donc important de concevoir des amorces de PCR et de les vérifier sur l&#39;ADN d&#39;entrée diluée. </li><li> Diluer l&#39;ADN purifié à 1:10 avec de l&#39;eau et la pipette 5 pi de l&#39;ADN dilué dans un tube PCR pour chaque réaction. REMARQUE: Diluer seulement la quantité nécessaire, que l&#39;ADN peut fixer aux parois des tubes de 1,5 ml à centrifuger. De multiples cycles de congélation-décongélation d&#39;augmenter le nombre de molécules d&#39;ADN ci-jointes. Pour chaque paire d&#39;amorces, l&#39;amplification dans l&#39;entrée, Ab-puce et non-Ab ChIP doit être analysé. </li><li> Pour compléter le mélange de PCR, ajouter Sybr Green PCR Master Mix à une concentration finale de 1 x, et 0,5 uM de chaque amorce. Remplissez jusqu&#39;à 20 pi avec de l&#39;eau exempte de DNase. </li><li> Effectuer la réaction qPCR en suivant les instructions du fabricant mix master Sybr Green PCR. </li></ol> Analyse des données 6. NOTE: Parmi les exIsting façons d&#39;analyser les données puce, deux sont les plus couramment utilisés. Le premier d&#39;entre eux est la méthode d&#39;enrichissement pli, également appelé comme &#39;enrichissement relatif »,« signal sur fond »ou« par rapport au témoin sans anticorps&#39;. La deuxième méthode est désigné comme &quot;% de l&#39;entrée&quot;. <ol><li> L&#39;analyse des données par la méthode d&#39;enrichissement pli. <ol><li> Créer une feuille de calcul avec des échantillons noms et les valeurs Ct premières qui ont été obtenus après réaction qPCR. </li><li> Pour chaque échantillon, de soustraire sa valeur brute la valeur Ct Ct brut obtenu pour le contrôle Pas-Ab correspondant. NOTE: Après cette opération mathématique, la valeur Ct pour l&#39;échantillon Pas-Ab est égale à 0. </li><li> Calculer l&#39;enrichissement fois en opération d&#39;exponentiation avec base 2 et exposant (puissance) égal au reste négatif obtenu à l&#39;étape 6.1.2 (tableau 2). pliez enrichissement = 2 - (Ct (échantillon) - Ct (Pas-Ab)) NOTE: Dans ce méthod l&#39;abondance d&#39;un fragment d&#39;ADN spécifique dans l&#39;échantillon ChIP-ed est comparée à l&#39;abondance de ce fragment dans le contrôle Pas-Ab. L&#39;hypothèse de cette méthode est que le niveau de signal de fond est reproductible entre les différents jeux d&#39;amorces, des échantillons, et de reproduire des expériences. Cependant, ce niveau de signal&#39;noise&#39; ne varient entre jeux d&#39;amorces, des échantillons et des expériences. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des données par% de méthode d&#39;entrée. <ol><li> Créer une feuille de calcul avec des échantillons noms et les valeurs Ct premières qui ont été obtenus pour eux après la réaction qPCR. </li><li> Ajustez les valeurs de Ct premières pour échantillons d&#39;entrée en soustrayant une valeur de logarithme de base 2 de la fraction de la chromatine total extrait qui a été prise comme une entrée. NOTE: Dans ce protocole, la valeur soustraite est égal 3,32, comme 10% de la chromatine total a été pris comme une entrée dans ce protocole. Connectez-2 (10) est égal à 3,32. </li><li> Calculez% de l&#39;apport en multipliant par 100 la valeur de l&#39;opération d&#39;exponentiation avec base 2 et exposant (puissance) correspondant au reste de valeurs d&#39;entrée ajustés à partir des valeurs de Ct soustraites premières de l&#39;échantillon (tableau 3). % D&#39;entrée = 100 * 2 (entrée ajusté - Ct (échantillon)) NOTE: Avec cette procédure, la relation entre l&#39;abondance d&#39;ADN spécifique dans l&#39;échantillon ChIP-ed à la chromatine isolée (échantillon d&#39;entrée) total est calculé. De plus amples détails sur l&#39;analyse des données de la puce peuvent être trouvés dans Haring et al., 8. </li></ol></li></ol>

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<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3%3A+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole décrit ci-ChIP est une technique reproductible et puissant pour analyser les interactions entre les protéines et les séquences d&#39;ADN spécifiques in vivo dans des plantes Arabidopsis. Une identification réussie des sites de liaison pour les protéines d&#39;intérêt exige une sélection adéquate des organes de la plante ou des stades de développement où les interactions pertinentes ont effectivement lieu. En outre, il est essentiel d&#39;obtenir une fixation appropriée de la matière végétale et un ...

Au cours des dernières années, un large éventail d&#39;outils génétiques, moléculaires et génomiques ont été développés dans le espèce modèle Arabidopsis thaliana. Cette technologie a facilité énormément le progrès dans la compréhension comment le développement de la plante est réglementé. Parmi les processus développementaux étudiés en utilisant Arabidopsis comme un modèle, le contrôle génétique de la période de floraison a été largement analysé. Ces études ont montré que les plantes modulent très précisément le moment de la floraison, en réponse à des signaux endogènes tels que les hormones et l&#39;âge de la plante, et également à des signaux environnementaux tels que la photopériode et la température qui synchronisent floraison avec le cycle naturel des saisons 1, 2. L&#39;isolement et la caractérisation de mutants d&#39;Arabidopsis avec des altérations dans le temps de la floraison a été déterminant pour dévoiler un réseau complexe de gènes qui régulent la période de floraison, en réponse à des facteurs endogènes et environnementaux. Ces circuits sont génétiquesintégré au niveau de quelques gènes maîtres qui agissent comme des interrupteurs de la floraison, et le moment exact de l&#39;initiation florale dépend de l&#39;équilibre de la floraison et de la promotion de réprimer les activités qui travaillent en amont des gènes intégrateurs floraux 1,3. La caractérisation fonctionnelle des gènes identifiés pour leur rôle dans le contrôle de la floraison initiation, aidé par l&#39;utilisation récente des approches génomiques, ont révélé le rôle central de la régulation transcriptionnelle dans la modulation du temps de la floraison. En fait, la plupart des gènes maîtres de floraison encodage facteurs de transcription 4. En outre, un certain nombre de complexes de protéines de remodelage de la chromatine influence l&#39;expression des gènes de base de la floraison. Un certain nombre de mutants d&#39;Arabidopsis isolés pour leur temps de floraison altérée avéré porteurs de mutations dans les gènes codant pour une variété de modificateurs de la chromatine. Rénovateurs de la chromatine différents qui introduisent modifications post-traductionnelles dans histone queues, repositionner nucléosomes par rapport à l&#39;ADN ou des histones canoniques échangent par des variantes des histones sont nécessaires à la bonne régulation de la floraison chez Arabidopsis 5,6. Certaines de ces activités de remodelage de la chromatine catalyser le dépôt ou le retrait des modifications covalentes telles que l&#39;acétylation ou méthylation des histones dans les résidus spécifiques. Ces marques des histones sont spécifiquement reconnus par des effecteurs spécialisées qui recrutent d&#39;autres complexes de remodelage de la chromatine, des facteurs de transcription ou des composants de la machinerie transcriptionnelle de réguler l&#39;activité transcriptionnelle des gènes de floraison. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) permet l&#39;identification de l&#39;ADN in vivo sites de liaison pour des protéines d&#39;intérêt (Figure 1). Cette procédure tire parti de la capacité de certains produits chimiques pour réticuler les protéines à l&#39;ADN. Les complexes de protéines-ADN résultants peuvent être ensuite immunoprécipitées en utilisant des anticorps spécifiques against facteurs de transcription, des protéines de liaison à la chromatine, ou des modifications particulières et des epitopes hétérologues (communément appelés &quot;tags&quot;) fixés à la protéine de choix. L&#39;ADN purifié à partir de ces immunoprécipités peut être utilisé comme un modèle dans quantitatives réactions PCR (qPCR) pour évaluer l&#39;enrichissement des séquences particulières d&#39;intérêt. De cette manière, les sites de liaison de facteurs de transcription ou la distribution des marques d&#39;histone dans des gènes particuliers peuvent être établis 7,8. En outre, combiné avec Next Generation Sequencing (NGS) qui permet le séquençage massivement parallèle, la technologie des puces a rendu possible l&#39;identification du génome entier des sites de liaison de facteurs de transcription ainsi que des paysages épigénomiques dévoilement de modifications des histones. En outre, l&#39;analyse simultanée de l&#39;expression génique permet de surveiller la façon dont la liaison des régulateurs de transcription ou le dépôt de marques particulières des histones en corrélation avec la transcription activity 9 de gènes. L&#39;utilisation de protocoles de puce dans Arabidopsis a permis d&#39;évaluer l&#39;impact d&#39;une variété de régulateurs de transcription sur l&#39;organisation de la chromatine des gènes maîtres de la floraison et de la façon dont ces changements structurels influent sur ​​l&#39;expression des gènes 5,6. Résultats précédents ont montré que le locus Arabidopsis BOLTING TOT EN JOURS COURTS (EBS) agit comme un répresseur de la floraison et les mutants dans ce spectacle de gène d&#39;une accélération de la floraison et la régulation positive du gène maître de la floraison FT. En outre, les mutations de perte de fonction dans FT suppriment complètement la floraison phénotype précoce des plantes ebs de mutants, indiquant que FT est nécessaire pour la floraison prématurée des mutants ebs et que EBS est nécessaire à la répression de ce gène maître de la floraison 10 , 11. EBS code pour une protéine contenant PHD qui peuvent se lier spécifiquement histone H3 di- et triméthylée en the lysine 4 résidus (H3K4me2 / 3), ce qui suggère un rôle pour EBS dans la répression de la chromatine médiée par FT 12. L&#39;utilisation de l&#39;approche de ChIP démontré que l&#39;Arabidopsis contenant PHD-protéine EBS 10,11 lie régions régulatrices du gène FT intégrateur floral pour réprimer son expression 12. Des données supplémentaires obtenues grâce à l&#39;utilisation de la technologie à puce ont montré que cette protéine est nécessaire pour maintenir de faibles niveaux de l&#39;acétylation des histones, une caractéristique de la transcription active, dans la chromatine de ce gène maître de la floraison au cours des étapes initiales du développement d&#39;Arabidopsis. Ces observations, ainsi que des données d&#39;expression génétique et le gène, démontrer que cette PHD-contenant des protéines d&#39;Arabidopsis a un rôle central dans le réglage fin de la période de floraison en modulant l&#39;expression du gène de l&#39;intégrateur floral FT 12. Le travail présenté ici fournit un procédé optimisé utile non seulement pour l&#39;analyse des histones, mais aussi pour d&#39;autreschromatine des protéines associées, et avec une efficacité accrue et une réduction du temps expérimental. En outre, ce rapport illustre comment l&#39;utilisation de protocoles de puce a fourni de nouvelles informations sur la relation entre les changements de modifications de la chromatine et les états de la transcription de gènes de plantes, et comment ces mécanismes de l&#39;impact du contrôle de l&#39;expression du gène de la chromatine médiation sur le début de la floraison chez Arabidopsis.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (mélange de sels de base Murashige et Skoog)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde 37 %&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>Utilisation sous la hotte Mélange d’inhibiteurs</td></tr> de <tr><td>protéase cOmplete ULTRA Tablets, Mini, sans EDTA, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Dispositif de sonication standard</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Billes magnétiques Dynabeads couplées à la protéine A ou à la protéine G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>Vérifier le fabricant' s manuel pour l’affinité d’anticorps</td></tr><tr><td>Miracloth Merck</td><td>Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps Détergent Solution</td><td>Life Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr> <tr><td>(souris, rat, lapin &hellip ;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Rack magnétique - DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac Anticorps polyclonal - Premium&nbsp ;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Résine</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc Tag Anticorps, clone 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de arabidopsis interactions protéine-adn<em&gt; in vivo</em

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Des réseaux complexes de régulation des gènes orchestrent les processus biologiques et les transitions de développement chez les plantes. L’activation transcriptionnelle sélective et le silençage des gènes médient la réponse des plantes aux signaux environnementaux et aux signaux de développement. Par conséquent, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes des plantes pour mieux comprendre comment les processus biologiques sont régulés chez les plantes. La technique d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) décrite ici est une procédure permettant d’identifier les sites de liaison à l’ADN des protéines dans les gènes ou les régions génomiques de l’espèce modèle Arabidopsis thaliana. Les interactions avec l’ADN de protéines d’intérêt telles que les facteurs de transcription, les protéines de la chromatine ou les versions modifiées post-traductionnellement des histones peuvent être analysées efficacement avec le protocole ChIP. Cette méthode est basée sur la fixation des interactions protéine-ADN in vivo, la fragmentation aléatoire de la chromatine, l’immunoprécipitation de complexes protéine-ADN avec des anticorps spécifiques, et la quantification de l’ADN associé à la protéine d’intérêt par des techniques de PCR. L’utilisation de cette méthodologie chez Arabidopsis a contribué de manière significative à dévoiler des mécanismes de régulation transcriptionnelle qui contrôlent une variété de processus biologiques végétaux. Cette approche a permis d’identifier les sites de liaison de la protéine chromatineuse EBS d’Arabidopsis aux régions régulatrices du gène maître de la floraison FT. L’impact de cette protéine dans l’accumulation de marques d’histones particulières dans la région génomique de la FT a également été révélé par l’analyse ChIP.

Huit principales étapes peuvent être distinguées dans ce protocole de puce pour l&#39;identification d&#39;interactions in vivo protéine-ADN, y compris culture et la récolte de la matière végétale, la réticulation de la chromatine, l&#39;isolement de la chromatine, la fragmentation de la chromatine, isolement sélectif des complexes entre l&#39;ADN et la protéine d&#39;intérêt par immunoprécipitation, la digestion des protéines, purification de l&#39;ADN, et l&#39;analyse qPCR (figure 1). Une ét...

Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante pour l&#39;identification des sites d&#39;ADN d&#39;Arabidopsis protéines de liaison in vivo. Cette procédure comprend la réticulation de la chromatine et la fragmentation, une immunoprécipitation avec des anticorps sélectifs contre la protéine d&#39;intérêt, et l&#39;analyse qPCR de l&#39;ADN lié. Nous décrivons un test simple de ChIP optimisé pour les plantes d&#39;Arabidopsis.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

L'objectif général de cette procédure est de révéler les interactions entre les protéines et l'ADN dans la chromatine des cellules d'arabidopsis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, telles que quels gènes sont régulés par un facteur de transcription donné, ou quelles modifications du système sont associées à un état transcriptionnel des gènes. Le principal avantage de cette technique est que, grâce à l'étape de réticulation, il est possible de fixer et de capturer les changements dans l'organisation de la chromatine survenant au cours du développement végétal.Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des interactions protéiques chez Arabidopsis thaliana, elle peut également être appliquée à différents ordres de plantes et adaptée à d'autres espèces végétales. La démonstration de cette procédure sera assurée par Dorota Komar et Alfonso Mouriz, deux étudiants en doctorat dans notre laboratoire. Après avoir cultivé Arabidopsis selon le protocole décrit, récoltez 1,5 gramme de matériel végétal dans des tubes de 50 millilitres et maintenez-les sur glace pendant la réticulation.Ensuite, utiliser une aiguille chauffée au bec Bunsen pour faire de petits trous dans les bouchons des tubes. Ajouter 40 millilitres de PBS 1x et 1,08 millilitre de formaldéhyde dans les tubes. Visser les bouchons sur les tubes et placer les tubes dans un dessiccateur.Infiltrer sous vide pendant 10 minutes, puis relâcher soigneusement le vide afin d'éviter d'agiter la solution. Après avoir mélangé l'échantillon, répéter les étapes d'application du vide et de mélange. Une fois l'infiltration terminée, observer le matériel végétal et vérifier qu'il devient légèrement translucide et coule au fond du tube.Ajoutez 2,5 millilitres de glycine deux molaire pour obtenir une concentration finale de 0,125 molaire et appliquez le vide pendant cinq minutes. Après avoir relâché le vide, jetez la solution en retournant les tubes et en laissant s'écouler le liquide à travers les trous des couvercles. Rincez les plantules deux fois avec du PBS, puis rincez-les une fois à l'eau.Ensuite, séchez les plantules sur du papier absorbant avant de les congeler à l'aide d'azote liquide. Pour chaque immunoprécipitation, préparez 15 microlitres de billes magnétiques dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez un millilitre de tampon de dilution pour l'immunoprécipitation de chromatine, ou tampon de dilution chip, aux billes, mélangez par rotation et placez le tube microcentrifuge de 1,5 millilitre sur un support magnétique.Après avoir laissé les billes s'attacher à l'aimant pendant environ une minute, utilisez un pipetman pour éliminer le surnageant avant de répéter le lavage. Remettez les billes en suspension dans 200 microlitres de tampon de dilution chip. Pour l'immunoprécipitation, ajoutez la quantité requise d'anticorps spécifique à l'un des deux tubes préparés pour chaque plante en aveugle.Un facteur clé pour la réussite d'une expérience de puces est l'anticorps choisi pour l'immunoprécipitation de la protéine d'intérêt. Les anticorps dirigés contre des facteurs de transcription végétaux peuvent être utiles pour les expériences de puces, mais il est nécessaire de tester soigneusement le sérum. Par exemple, des anticorps vérifiés uniquement par analyse en Western blot ne sont pas nécessairement valables pour les puces.En tant que témoin négatif, ajoutez la même quantité d’IgG non spécifique dans le deuxième tube. Incubez les tubes à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur une roue rotative afin de permettre à l'anticorps de se fixer sur les billes. À l’aide d’un mortier et d’un pilon, broyez soigneusement le matériel végétal congelé dans de l’azote liquide jusqu’à ce que la poudre devienne homogène et de couleur vert clair.Transférez la poudre dans un nouveau tube de 50 millilitres. Sous une hotte aspirante, ajoutez 30 millilitres de tampon d'extraction un et mélangez soigneusement pour bien imbiber la poudre de tissu. À partir de cette étape, conservez les échantillons à quatre degrés Celsius en tout temps, et assurez-vous que le tissu soit complètement décongelé avant de poursuivre.Clarifiez la suspension en la faisant passer à travers un tissu de filtration d'une taille de pore de 22 à 25 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez à 1 000 × g et à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes. Versez délicatement le surnageant hors du culot, dont le volume devrait être d'environ deux millilitres.Avec cinq millilitres de tampon d'extraction deux, reprendre le culot. Puis centrifuger à 1 000 ×g et à 4 °C pendant 10 minutes. Après avoir décanté le surnageant, reprendre le culot dans 300 microlitres de tampon d'extraction trois.Dans un tube séparé, ajouter 600 microlitres de tampon d'extraction trois, puis recouvrir délicatement le culot re-suspendu au-dessus du tampon propre. Centrifuger le tube pendant une heure à 16 000 ×g à quatre degrés Celsius, puis aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, utiliser 300 microlitres de tampon de sonication pour re-suspendre lentement le culot nucléaire, en évitant la formation de bulles, qui pourrait nuire à l'efficacité de la sonication.Transférez soigneusement la suspension dans un tube propre de 1,5 millilitre. Soniquez la suspension afin de lyser les noyaux et fragmenter aléatoirement la chromatine en fragments de 200 à 600 paires de bases. Vérifiez la taille des fragments d'ADN sur un gel d'agarose, puis centrifugez la solution à 12 000 ×g et à 4 °C pendant 10 minutes.Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et jetez le culot. Aliquotez un dixième du surnageant dans un tube neuf, étiquetez-le comme « input » avant de le congeler à moins 20 degrés Celsius. Enfin, préparez une dilution au dixième du chromatine dans le tampon de dilution pour immunoprécipitation chromatinienne afin d'obtenir une concentration finale en SDS de 0,1 pour cent.Les échantillons peuvent ensuite être congelés et conservés à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs semaines. Après avoir incubé les billes avec les anticorps toute la nuit, utiliser un millilitre de tampon de dilution pour puce afin de laver les billes trois fois, puis redisperser les billes dans un millilitre de chromatine diluée, et incuber le tube toute la nuit sur une roue rotative à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, placer les billes sur le support magnétique à quatre degrés Celsius, puis, après avoir éliminé la solution, utiliser un millilitre de tampon de lavage à faible concentration saline pour laver les billes deux fois, puis utiliser le tampon de lavage à forte concentration saline pour laver les billes une fois.Après avoir utilisé un millilitre de tampon de lavage au chlorure de lithium pour laver les billes une fois, utilisez un millilitre de tampon TE pour laver les billes deux fois. Aspirez pour éliminer complètement le tampon de lavage TE. Une fois les échantillons d'entrée décongelés, transférez cinq microlitres de chacun dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre, puis traitez-les de manière similaire aux échantillons de puce.Inverser la réticulation en ajoutant 200 microlitres de résine échangeuse d'ions chélatante à cinq pour cent et incuber à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, en agitant toutes les deux à trois minutes. Centrifuger à 16 000 fois g pendant 30 secondes, puis transférer soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes microfuge. Ajouter deux microlitres de protéinase K à 10 milligrammes par millilitre, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de digérer les protéines et libérer l'ADN.Pour arrêter la réaction, incuber à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, centrifuger rapidement à 16 000 ×g pendant 30 secondes, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube. Après purification de l'ADN selon le protocole indiqué dans le texte, diluer de un à dix avec de l'eau et utiliser 5 µL par réaction pour mesurer l'abondance des sites de fixation par qPCR. Analyser les données selon le protocole indiqué dans le texte.Les feuilles d’Arabidopsis sont recouvertes de couches de cire et de trichomes favorisant la formation de bulles d’air, ce qui rend difficile la pénétration des réactifs de réticulation dans les tissus végétaux. On observe ici des échantillons de jeunes plants réticulés sous vide afin d’augmenter l’efficacité de la fixation. Cette figure montre que l’augmentation progressive du nombre de cycles de sonication réduit la taille moyenne de l’ADN dans les échantillons de puces, atteignant un enrichissement optimal dans la plage de 200 à 600 paires de bases après 20 à 30 cycles, comme illustré ici.Comme on le voit sur cette figure, quatre régions importantes pour la régulation transcriptionnelle du locus FT, un gène maître de la floraison, ont été choisies pour l'analyse. Les résultats de la PCR après immunoprécipitation de la chromatine montrent que la protéine EBS se lie à l'une des quatre régions testées, une séquence régulatrice située près du site de démarrage de la transcription de FT. Enfin, les tests d'immunoprécipitation de la chromatine réalisés à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'histone H3 acétylée sur les lysines 9 et 14, marqueur associé à une chromatine transcriptionnellement active, ont révélé une abondance plus élevée de H3K9/14ac chez les plantes mutantes DBS par rapport aux plantes de type sauvage, dans les quatre fragments génomiques de FT analysés, ce qui est compatible avec la surexpression observée de ce gène maître de la floraison dans ce mutant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement.En suivant cette procédure, ainsi que d'autres mesures telles que l'analyse de l'expression génique, on peut contribuer à répondre à d'autres questions, telles que : Quel est le rôle biologique de la liaison de la protéine à l'ADN ? S'agit-il d'une activation ou d'une répression transcriptionnelle ? Et quelles modifications des histones sont associées ?Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'épigénétique végétale pour explorer les états de la chromatine dans nos cellules réductrices. Et cela peut être étendu à d'autres espèces végétales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser la liaison de votre protéine d'intérêt d'arabidopsis à l'ADN in vivo.N'oubliez pas que manipuler du 2-méthoxyéthanol, du formaldéhyde ou des réactifs de sonicateur, des agents pathogènes et des mutations de gènes peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de vêtements de protection, de gants ou de protections auditives doivent toujours être prises lors de l'utilisation de ce protocole.

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L'imprinting est un phénomène dans l'usine et la reproduction des mammifères. Méthylation de l'ADN joue un rôle important dans les mécanismes de l'empreinte. Isoler l'endosperme et la détermination du statut de méthylation de gènes soumis à empreinte dans...

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Ce protocole se concentre sur la préparation de la chromatine à partir de tissus congelés et convient à l’immunoprécipitation de la chromatine par réticulation (X-ChIP) suivie d’une analyse PCR quantitative (X-ChIP-qPCR) ou d’approches de séquençage de nouvelle génération (X-ChIP-seq).

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