Immunoprécipitation de la chromatine test pour l'identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN In Vivo

L’objectif global de cette procédure est de dévoiler les interactions entre les protéines et l’ADN dans la chromatine des cellules d’arabidopsis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, telles que quels gènes sont régulés par un facteur de transcription donné, ou quelles modifications du système sont associées à un état transcriptionnel des gènes. Le principal avantage de cette technique est que, grâce à l’étape de réticulation, il est possible de fixer et de capturer les changements dans l’organisation de la chromatine qui se produisent au cours du développement de la plante.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’interaction protéique chez Arabidopsis thaliana, elle peut également être appliquée à différents ordres de plantes et adaptée à d’autres espèces végétales. Dorota Komar et Alfonso Mouriz, deux doctorants de notre laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Après avoir cultivé l’arabidopsis selon le protocole textuel, prélevez 1,5 gramme de matière végétale dans des tubes de 50 millilitres et conservez-les sur de la glace pendant la réticulation.

Ensuite, utilisez une aiguille chauffée à un brûleur de laboratoire pour faire de petits trous dans les couvercles des tubes. Ajoutez 40 millilitres de 1x pbs et 1,08 millilitre de formaldéhyde dans les tubes. Vissez les couvercles sur les tubes et placez les tubes dans un dessiccateur.

Infiltrer le vide pendant 10 minutes, puis relâcher soigneusement le vide pour éviter de brasser la solution. Après avoir mélangé l’échantillon, répétez les étapes de vide et de mélange. Lors de l’infiltration, observez la matière végétale et confirmez qu’elle devient légèrement translucide et coule au fond du tube.

Ajoutez 2,5 millilitres de glycine à deux molaires à une concentration finale de 0,125 molaire et appliquez le vide pendant cinq minutes. Après avoir relâché le vide, jetez la solution en inversant les tubes et en la laissant s’égoutter à travers les trous des couvercles. Utilisez pbs pour rincer les plantules deux fois et rincer à l’eau une fois.

Séchez ensuite les plantules sur une serviette en papier avant d’utiliser de l’azote liquide pour congeler. Pour chaque immunoprécipitation, préparez 15 microlitres de billes magnétiques dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez un millilitre d’immunoprécipitation de la chromatine, ou tampon de dilution de la puce, aux billes, mélangez par rotation et placez le tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre dans un support magnétique.

Après avoir laissé les billes se fixer à l’aimant pendant environ une minute, utilisez un pipet pour retirer le surnageant avant de répéter le lavage. Remettre les billes en suspension dans 200 microlitres de tampon de dilution de copeaux. Pour l’immunoprécipitation, ajoutez la quantité requise de l’anticorps spécifique dans l’un des deux tubes préparés pour chaque store de plante.

Un facteur clé de la réussite d’une expérience sur puce est l’anticorps choisi pour l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt. Les anticorps contre le facteur de transcription des plantes peuvent être utiles pour les expériences sur puce, mais le sérum doit être testé de manière approfondie. Par exemple, les anticorps vérifiés uniquement dans l’analyse par transfert Western ne sont pas nécessairement valides pour la puce.

En tant que contrôle négatif, ajoutez la même quantité d’IGG non spécifique dans le deuxième tube. Incuber les tubes à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur une roue rotative pour permettre à l’anticorps de se fixer aux billes. À l’aide d’un mortier et d’un pilon, broyez soigneusement la matière végétale congelée dans de l’azote liquide jusqu’à ce que la poudre devienne homogène et vert clair.

Transférez la poudre dans un nouveau tube de 50 millilitres. Sous une hotte, ajoutez 30 millilitres de tampon d’extraction et mélangez bien pour imbiber la poudre de tissu. À partir de cette étape, maintenez les échantillons à quatre degrés Celsius en tout temps et assurez-vous que le tissu est complètement décongelé avant d’aller de l’avant.

Éliminez la boue en la faisant passer à travers un tissu filtrant avec une taille de pores de 22 à 25 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez à 1 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Décantez doucement le surnageant de la pastille, qui doit avoir un volume d’environ deux millilitres.

Avec cinq millilitres de tampon d’extraction deux, remettez la pastille en suspension. Ensuite, centrifugez à 1 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir transvasé le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 300 microlitres de tampon d’extraction trois.

Dans un tube séparé, ajoutez 600 microlitres de tampon d’extraction, puis superposez soigneusement la pastille remise en suspension sur le tampon propre. Centrifuger le tube pendant une heure à 16 000 fois g à quatre degrés Celsius, suivie d’une aspiration du surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, utilisez 300 microlitres de tampon de sonication pour remettre lentement en suspension la pastille nucléaire, évitant ainsi la formation de bulles, ce qui peut affecter l’efficacité de la sonication.

Transférez soigneusement la suspension dans un tube propre de 1,5 millilitre. Soniquez la suspension pour lyser les noyaux et partagez aléatoirement la chromatine en 200 à 600 fragments de paires de bases. Vérifiez la taille des fragments d’ADN sur un gel d’agarose, puis faites tourner la solution à 12 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Transférez le surnageant dans un tube frais de 1,5 millilitre et jetez la pastille. Aliquote un dixième du surnageant dans un nouveau tube et étiquete-le comme entrée' avant de geler à moins 20 degrés Celsius. Enfin, diluez dix fois la chromatine dans le tampon de dilution de la puce pour obtenir une concentration finale de SDS de 0,1 %.

Les échantillons peuvent ensuite être congelés et conservés à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs semaines. Après avoir incubé les billes avec des anticorps pendant la nuit, utilisez un millilitre de tampon de dilution de copeaux pour laver les billes trois fois, puis remettez les billes en suspension dans un millilitre de chromatine diluée et incubez le tube pendant la nuit sur une roue rotative à quatre degrés Celsius. Le lendemain, placez les billes sur la grille magnétique à quatre degrés Celsius et, après avoir retiré la solution, utilisez un millilitre de tampon de lavage à faible teneur en sel pour laver les perles deux fois, puis utilisez un tampon de lavage à haute teneur en sel pour laver les perles une fois.

Après avoir utilisé un millilitre de tampon de lavage au chlorure de lithium pour laver les billes une fois, utilisez un millilitre de tampon TE pour laver les billes deux fois. Aspirez pour éliminer complètement le tampon de lavage TE. Une fois les échantillons d’entrée décongelés, transférez cinq microlitres de chacun dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et, à l’avenir, traitez de la même manière les échantillons de copeaux.

Inversez la réticulation en ajoutant 200 microlitres de résine échangeuse d’ions chélatante à cinq pour cent et incubez à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, en secouant toutes les deux à trois minutes. Faites tourner à 16 000 fois g pendant 30 secondes et transférez soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes de microfuge. Ajoutez deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre de protonase K et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour digérer les protéines et libérer l’ADN.

Pour arrêter la réaction, incubez à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, tournez rapidement à 16 000 fois g pendant 30 secondes et transférez le surnageant dans un nouveau tube. Après avoir nettoyé l’ADN selon le protocole textuel, diluez un à dix avec de l’eau et utilisez cinq microlitres par réaction pour mesurer l’abondance des sites de liaison par qPCR. Analysez les données selon le protocole texte.

Les feuilles d’Aribidopsis sont recouvertes de couches de cire et les trichomes favorisent la formation de bulles d’air, ce qui rend difficile la pénétration des réactifs de réticulation dans les tissus végétaux. On voit ici des échantillons de semis réticulés qui ont été réticulés sous vide pour augmenter l’efficacité de la fixation. Cette figure démontre qu’un nombre accru de cycles de sonication réduit progressivement la taille moyenne de l’ADN dans les échantillons de puces, atteignant l’enrichissement optimal de l’ordre de 200 à 600 paires de bases après 20 à 30 cycles, comme démontré ici.

Comme le montre cette figure, quatre régions importantes pour la régulation transcriptionnelle du locus FT, un gène maître de la floraison, ont été choisies pour l’analyse. Les résultats de la puce démontrent que la protéine EBS combinait l’une des quatre régions testées, une séquence régulatrice proche du site de départ transcriptionnel de FT. Enfin, des tests de puce effectués à l’aide d’un anticorps dirigé contre l’histone h3 acétylée dans les lysines neuf et 14, qui est corrélé avec la chromatine transcriptionnellement active, ont révélé une abondance plus élevée de H3K9/14ac dans la DBS mutante par rapport aux plantes de type sauvage dans les quatre fragments génomiques de FT testés, ce qui correspond à la régulation positive observée de ce gène maître de la floraison chez ce mutant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée.

Le suivi de cette procédure, associé à d’autres mesures telles que l’analyse de l’expression des gènes, peut contribuer à répondre à d’autres questions, telles que :Quel est le rôle biologique de la liaison de la protéine à l’ADN ? Est-ce à l’activation transcriptionnelle ou à la répression ? Et quelles modifications d’histones sont associées ?

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique végétale pour explorer les états de la chromatine dans nos cellules réductrices. Et cela peut être étendu à d’autres espèces végétales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser la liaison de votre protéine aribidopsis d’intérêt à l’ADN in vivo.

N’oubliez pas que travailler avec du 2-méthoxyéthanol, du formaldéhyde ou des réactifs sonicateurs, des agents pathogènes et des mutations souches peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que des vêtements de protection, des gants ou une protection auditive doivent toujours être prises lors de l’utilisation de cette procédure.