Caractérisation métabolique des polarisée M1 et M2 macrophages dérivées de moelle osseuse Utilisation en temps réel Analyse extracellulaire Flux

L'objectif général de cette analyse de flux extracellulaire est d'évaluer les caractéristiques métaboliques des macrophages dérivés de la moelle osseuse polarisés M1 naïfs et M2. Cette méthode peut servir de cadre pour étudier l'impact de cytokines, de composés ou de gènes spécifiques sur le phénotype métabolique des macrophages. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle nécessite uniquement une faible quantité de macrophages.

En outre, il permet de mesurer tous les paramètres pertinents de la glycolyse et mitochondriaux dans un seul et même test. Bien que cette méthode offre un aperçu du phénotype métabolique des macrophages dérivés de la moelle osseuse, elle peut également être appliquée à tous les types de macrophages ou de cellules immunitaires. Nous avons eu l'idée de publier cette méthode dans J, car nous recevons fréquemment des demandes d'autres scientifiques qui nous sollicitent pour les aider dans leurs dosages métaboliques de flux cellulaires. Au huitième jour de culture, vérifiez la présence de macrophages matures par inspection visuelle et incubez les macrophages matures dérivés de la moelle osseuse dans 10 millilitres de solution saline citratée pendant cinq minutes.

À 37 degrés Celsius, lorsque les cellules se sont détachées. Laver la culture avec 10 millilitres de PBS et dénombrer le nombre de cellules viables. Ensuite, ensemencer cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par puits.

Dans une plaque de culture cellulaire XFE 96, ajouter 100 microlitres de milieu de culture par puits, en tenant la pipette inclinée à environ mi-hauteur sur la paroi de chaque puits. Pour distribuer les cellules, ajouter uniquement du milieu dans les puits de correction du fondamental A 1, A 12, H 1 et H 12. Laisser ensuite les cellules se déposer pendant une heure à température ambiante dans une hotte de culture cellulaire.

Après avoir confirmé l'adhérence cellulaire, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Trois heures après le semis, stimuler quatre à six puits de cellules par condition, selon les besoins, pendant 24 heures. Pour polariser les macrophages dérivés de la moelle osseuse la veille du test de flux extracellulaire, placer la cartouche capteur à l'envers à côté de la plaque d'alimentation et remplir chaque puits de la plaque avec 200 microlitres de solution crin.

Ensuite, abaissez la cartouche du capteur sur la plaque d'appoint pour immerger les capteurs dans la solution de Cain et vérifiez que le niveau de la solution de Cain est suffisamment élevé pour maintenir le capteur immergé. Puis placez la cartouche dans un incubateur à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant toute la nuit. Le lendemain, retirez délicatement le surnageant des macrophages polarisés et lavez les cellules avec 100 microlitres de milieu fraîchement préparé pour le dosage.

Millilitres de milieu par puits. Ajouter 180 microlitres de milieu d'essai dans chaque puits, puis utiliser le microscope pour vérifier que les cellules n'ont pas été détachées. Si les cellules sont toujours fixées, placer la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant une heure avant l'exécution de l'essai, pendant que les cellules poursuivent leur incubation.

Préparez 10 mélanges composés d'injection comme indiqué dans le tableau et chauffez les mélanges à 37 degrés Celsius. Ensuite, chargez la cartouche capteur avec les volumes appropriés de composé et des ports A, B, C et D en utilisant les guides de chargement fournis afin de caractériser la bioénergie des macrophages polarisés par dosage du flux extracellulaire. Utilisez l'assistant de dosage pour créer un modèle de dosage avec des temps de mélange de deux minutes et de mesure de trois minutes, ainsi qu'au moins trois cycles de mélange et de mesure du taux avant chacune des quatre injections et après la dernière injection.

Commencez ensuite le test et suivez les instructions indiquées par l'appareil. Chargez la plaque de cartouche avec les sondes hydratées afin de permettre l'étalonnage par l'appareil et la plaque de cellules. Lorsque cela est indiqué, à la fin du test, éliminez soigneusement tout le milieu de dosage et conservez la microplaque de culture cellulaire analysée à moins 20 degrés Celsius jusqu'à la normalisation.

Pour normaliser les cellules à l'aide du kit de dosage de la prolifération cellulaire, décongeler la plaque et incuber les cellules dans 200 microlitres de tampon de lyse cellulaire fraîchement préparé par puits pendant cinq minutes à température ambiante. Enfin, mesurer la fluorescence avec une excitation d'environ 480 nanomètres et un maximum d'émission d'environ 520 nanomètres. Utiliser les mesures de fluorescence obtenues pour calculer le rapport dans lequel le nombre moyen de cellules de tous les puits de macrophages naïfs est fixé à un, puis exporter ces rapports vers le logiciel d'analyse Seahorse Wave.

Pour normaliser les données, un dosage de flux extracellulaire fournit généralement des courbes de taux de modification extracellulaire (ECAR) ou de taux de consommation d'oxygène (OCR), comme illustré sur cette figure représentative après l'injection de glucose ; l'augmentation observée de l'ECAR représente le taux de glycolyse. L'augmentation supplémentaire observée de l'ECAR après une inhibition de la synthèse d'ATP par l'antimycine A fournit des informations complémentaires sur la réserve et la capacité glycolytiques. Lors de l'analyse des valeurs d'OCR, l'injection de CIN permet de calculer la consommation d'oxygène utilisée pour la synthèse mitochondriale d'ATP, tandis que le FCCP découple la respiration mitochondriale.

Les mesures OCR correspondantes fournissent des données sur la capacité respiratoire maximale et la capacité respiratoire de réserve. La rotenone et l'injection d'antimycine A bloquent toutefois respectivement les complexes mitochondriaux I et III, la consommation résiduelle d'oxygène représentant alors la consommation d'oxygène non mitochondriale. L'activation des macrophages par le LPS induit un métabolisme glycolytique accru. Les différences entre les macrophages traités au LPS et à l'IL-4 deviennent encore plus marquées lorsqu'on observe les taux de consommation d'oxygène.

En effet, alors que le métabolisme oxydatif maximal est fortement inhibé dans les macrophages traités par le LPS, l'IL-4 induit une respiration robuste dans les macrophages de type M2. Une fois maîtrisé, le test de flux extracellulaire peut être réalisé en deux heures s'il est effectué correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'injecter le vet en même temps que le FCCP afin de stimuler la respiration maximale après découplage.

Après cette technique, des tests supplémentaires comme ELISA peuvent être réalisés afin d'évaluer une polarisation efficace des macrophages. Cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de l'immunologie pour explorer les caractéristiques métaboliques d'un large éventail de cellules immunitaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une analyse du flux extracellulaire afin d'évaluer le phénotype métabolique des macrophages.