Caractérisation métabolique des polarisée M1 et M2 macrophages dérivées de moelle osseuse Utilisation en temps réel Analyse extracellulaire Flux

L’objectif général de cette analyse de flux extracellulaire est d’évaluer les caractéristiques métaboliques de macrophages naïfs dérivés de la moelle osseuse polarisés M1 et M. Cette méthode peut servir de cadre pour étudier comment des cytokines, des composés ou des codes génologiques particuliers affectent le phénotype métabolique des macrophages. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite qu’une petite quantité de macrophages.

De plus, il mesure tous les paramètres pertinents de glycolyse et mitochondriales en un seul essai. Bien que cette méthode donne un aperçu du phénotype métabolique des macrophages dérivés de la moelle osseuse, elle peut également être appliquée à tous les types de macrophages ou de cellules immunitaires. Nous avons eu l’idée de publier cette méthode dans J car nous recevons fréquemment des demandes d’autres scientifiques pour les aider avec leurs tests de flux cellulaire d’accès métabolique Le huitième jour de culture, vérifiez la présence de macrophages matures par inspection visuelle et incubez les macrophages matures dérivés de la moelle osseuse dans 10 millilitres de citrate saline pendant cinq minutes.

A 37 degrés Celsius lorsque les cellules se sont détachées. Lavez la culture avec 10 millilitres de PBS et comptez le nombre de cellules viables. Ensuite, semez cinq fois 10 jusqu’à la quatrième cellule par puits.

Dans une culture cellulaire XFE 96, microplaquez 100 microlitres de milieu de culture par puits, en tenant la pipette à un angle d’environ la moitié du côté de chaque puits. Pour distribuer les cellules, ajoutez du fluide seul dans les puits de correction d’arrière-plan A un, A 12, H un et H 12. Laissez ensuite les cellules se déposer à température ambiante dans une hotte de culture cellulaire pendant une heure.

Après confirmation de l’observance de la culture, les cellules sont placées dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Trois heures après le placage, stimulez entre quatre et six puits de cellules par condition, selon le cas, pendant 24 heures. Pour polariser les macrophages dérivés de la moelle osseuse la veille du test de flux extracellulaire, placez la cartouche du capteur à l’envers à côté de la plaque utilitaire et remplissez bien chaque plaque avec 200 microlitres de solution de crin.

Ensuite, abaissez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire pour immerger les capteurs dans la solution de Cain et vérifiez que le niveau de solution de Cain est suffisamment élevé pour maintenir le capteur immergé. Placez ensuite la cartouche dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, retirez délicatement le surnageant des macrophages polarisés et lavez les cellules avec 100 microlitres de dosage fraîchement préparé.

Moyen par puits. Ajoutez 180 microlitres de milieu de test dans chaque puits et utilisez le microscope pour vérifier que les cellules n’ont pas été emportées. Si les cellules sont toujours attachées, placez la plaque dans l’incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure avant le test pendant que les cellules sont en incubation.

Préparez 10 mélanges de composés d’injection comme indiqué dans le tableau et réchauffez les mélanges à 37 degrés Celsius. Chargez ensuite la cartouche du capteur avec les volumes appropriés de composé et les ports A, B, C et D à l’aide des guides de charge fournis pour caractériser la bioénergie des macrophages polarisés par un test de flux extracellulaire. Utilisez l’assistant de test pour créer un modèle de test avec des temps de mélange de deux minutes et de mesure de trois minutes, ainsi qu’au moins trois boucles de mesure de mélange et de débit avant chacune des quatre injections et après la dernière injection.

Ensuite, commencez le test et suivez les instructions indiquées par l’appareil. Chargement de la plaque de cartouche avec les sondes hydratées pour permettre l’étalonnage par l’appareil et la plaque de cellule. Lorsque vous vous y êtes invité, à la fin de l’essai, jetez soigneusement tout le milieu d’essai et conservez la microplaque de culture cellulaire analysée à moins 20 degrés Celsius jusqu’à la normalisation.

Pour normaliser les cellules à l’aide du kit de test de prolifération cellulaire, décongelez la plaque et incubez les cellules dans 200 microlitres de tampon de lyse cellulaire fraîchement préparé par puits pendant cinq minutes à température ambiante. Enfin, mesurez la fluorescence avec une excitation d’environ 480 nanomètres et des maxima d’émission d’environ 520 nanomètres. Utiliser les mesures de fluorescence acquises pour calculer le rapport dans lequel le nombre moyen de cellules de tous les puits de macrophages naïfs est fixé à un, puis exporter ces rapports dans le logiciel d’analyse des vagues de l’hippocampe.

Pour normaliser les données, un test de flux extracellulaire donnera généralement un taux d’acidification extracellulaire ou ECAR et un taux de consommation d’oxygène, ou des graphiques OCR comme le montre cette figure représentative après l’injection de glucose, l’augmentation observée de l’ECAR représente le taux de glycolyse. L’augmentation supplémentaire observée dans l’ECAR après une inhibition de la TP synthase avec toutes les liga mycine fournit des informations supplémentaires sur la réserve et la capacité glycolytiques. Lors de l’analyse des valeurs OCR, l’injection de CIN facilite le calcul de la consommation d’oxygène utilisée pour la synthèse mitochondriale A TP, le FCCP découple la respiration mitochondriale.

Les mesures OCR correspondantes fournissent des données sur la capacité respiratoire maximale et de réserve connue et l’injection d’antimycine, cependant, bloquent les complexes mitochondriaux un et trois, l’OCR résiduel représentant la consommation d’oxygène non mitochondriale. L’activation des macrophages avec le LPS induit une augmentation du métabolisme glycolytique. Avec les différences entre le LPS et l’IL, quatre macrophages traités deviennent encore plus apparents lorsque les taux de consommation d’oxygène sont observés.

En effet, alors que le métabolisme oxydatif maximal est fortement supprimé dans les macrophages traités au LPS, IL quatre induit une respiration robuste chez les macrophages M deux. Une fois maîtrisé, le test de grippe extracellulaire peut être complété en deux heures s’il est effectué correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’injecter le vétérinaire avec le FCCP pour alimenter une respiration maximale lors du découplage.

Après cette technique, des tests supplémentaires comme Eliza peuvent être effectués pour évaluer l’efficacité de la polarisation des macrophages. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de l’immunologie pour explorer les caractéristiques métaboliques d’un large éventail de cellules immunitaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse des flux extracellulaires pour évaluer le phénotype métabolique des macrophages.