Name: Caractérisation métabolique des polarisée M1 et M2 macrophages dérivées de moelle osseuse Utilisation en temps réel Analyse extracellulaire Flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Découvrez l'analyse de flux extracellulaire pour caractériser le métabolisme des macrophages M1 et M2 dérivés de la moelle osseuse. Cette méthode permet d'évaluer la glycolyse et la fonction mitochondriale en temps réel.

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Jan Van den Bossche a reçu une bourse Junior Postdoc de la Fondation néerlandaise pour le cœur (2013T003) et une bourse VENI de ZonMW (91615052). Menno de Winther est chercheur établi de la Fondation néerlandaise de cardiologie (2007T067), est soutenu par une subvention de la Fondation néerlandaise de cardiologie (2010B022) et détient une bourse AMC. Nous reconnaissons également le soutien de l’Initiative néerlandaise de recherche cardiovasculaire, de la Fédération néerlandaise des centres médicaux universitaires, de l’Organisation néerlandaise pour la recherche et le développement en santé et de l’Académie royale des sciences des Pays-Bas pour le projet GENIUS « Générer les meilleures cibles pharmaceutiques fondées sur des preuves pour l’athérosclérose » (CVON2011-19). Nous remercions Seahorse Bioscience d’avoir rendu possible la publication en libre accès. Les auteurs remercient Riekelt Houtkooper et Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, Pays-Bas) pour toute aide antérieure avec l’analyseur Seahorse.

1. Les macrophages en culture et de polarisation dérivées de moelle osseuse <ol><li> Jour 0: fémur et le tibia Isoler os de 6-10 semaine souris âgées d&#39;intérêt (C57BL / 6 dans cet essai). </li><li> Retirer le tissu musculaire à partir des os et placez-les dans un os 9 cm boîte de Pétri remplie de PBS glacé. </li><li> Transférer les os dans un plat de 9 cm de Pétri remplie avec 70% d&#39;éthanol et secouez doucement la plaque pendant 30 sec. </li><li> Transférer les os à une nouvelle boîte de Pétri de 9 cm rempli de glace-froid PBS stérile. </li><li> Couper le fémur et le tibia aux deux extrémités avec des ciseaux stériles. </li><li> Rincer les os avec 10 ml glacé PBS stérile en utilisant une seringue de 10 ml et d&#39;une aiguille G 25. Recueillir la moelle osseuse dans un tube de 50 ml. </li><li> Transférer les cellules de la moelle osseuse à un nouveau tube de 50 ml en utilisant une aiguille 23 G. </li><li> Répétez cette étape avec une aiguille 25 G. Remarque: Ces étapes sont nécessaires pour éliminer les amas de cellules et résidus osseux. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le supernatant et remettre en suspension les cellules dans un milieu de 40 ml de cellules de culture (RPMI-1640 plus 2 mM de L-glutamine, 10% de FCS, de la pénicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml) et 15% filtré L-929 cellules ( ATCC, CCL-1) moyen Climatisé contenant M-CSF (ou encore 10 ml de M-CSF ng / recombinant à la place de la L-929 milieu conditionné de cellules). Remarque: La génération de L-929 milieu conditionné de cellules a été détaillé précédemment dans ce journal en 2013. 11 </li><li> Culture des cellules provenant d&#39;une souris à deux 15 cm des boîtes de Pétri (ne pas utiliser des plaques de culture traitée cellulaires depuis macrophages ne se détache pas de cette plastique) dans 20 ml de milieu de culture par plaque dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de culture cellulaire frais au jour 3, sans avoir à retirer les 20 ml de milieu de culture cellulaire âgée. </li><li> Remplacer l&#39;ancien milieu de chaque plaque avec 20 ml fraîche milieu de culture le jour 6. Faire cela, les cellules non-adhérentes seront également supprimés. </li><li> Jour 8: <ol><li> Détacher les cellules en les incubant 5 mdans à 37 ° C dans 10 ml de solution saline de citrate (135 mM de chlorure de potassium ainsi que le citrate de sodium 15 mM dans H 2 O, à l&#39;autoclave) et on lave avec 10 ml de PBS. Comptez macrophages osseuses matures dérivées de la moelle (BMDM) le jour 8 en utilisant un compteur de cellules. </li><li> Vérifiez la formation de maturité (CD11b + F4 / 80 +) BMDM par inspection visuelle ou par cytométrie de flux. Bloc 10 5 cellules avec 1/100 anti-CD16 / CD32 dans du PBS pendant 20 min dans 100 pi de PBS, incuber avec anti-CD11b 1/200-FITC 1/200, plus anti-F4 / 80-APC-Cy7 à la température ambiante, lavage et analyser par cytométrie de flux. Remarque: les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris La culture a été publiée en détail plus tôt dans ce journal par Ying et al 11.. </li></ol></li><li> Seed 50.000 cellules (nombre de cellules optimales doivent être optimisés) par puits dans une microplaque de culture cellulaire dans un milieu de culture de 100 ul. Ne pas ensemencer les cellules dans des puits de correction de fond (A1, A12, H1, H12) et de mettre le milieu seulement (pas de cellules) dans ces puits. Astuce: Maintenez la pipette à un angle uncombat à mi-chemin du côté des puits pour la couche cellulaire la plus homogène. </li><li> Permettre aux cellules de se déposer à la température ambiante dans une hotte de culture cellulaire pendant 1 heure. Cela permettra de promouvoir encore la distribution de cellules et de réduire les effets de bord. Surveiller le respect à l&#39;aide d&#39;un microscope et de la culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Trois heures après l&#39;étalement, stimuler les cellules pendant 24 heures avec 10 ng / ml de LPS, ou 20 ng / ml de souris recombinant IL-4 pour générer macrophages M1 ou M2, respectivement. Inclure non traités macrophages naïfs (M0) comme témoin. Évaluer approprié M1 et M2 des macrophages polarisation en mesurant induite par le LPS sécrétion d&#39;IL-6, IL-12, TNF (ELISA) et d&#39;IL-4 induit arginase-1 l&#39;activité et / ou MMR (CD206) et MGL (CD301) l&#39;expression de surface (cytométrie de flux) comme décrit précédemment 3,11. Remarque: À ce stade, les cellules peuvent être (pré) a traité des composés pharmacologiques avec des intérêts ou des macrophages peut être stimulée avec d&#39;autres facteurs. Depuis, la variation entre les puits distincts pourrait être sous-marinstantial, il est conseillé d&#39;utiliser au moins 4 et, idéalement, 6 puits par condition. </li></ol> 2. Préparation de la Composition extracellulaire Flux <ol><li> Hydrater la cartouche du capteur un jour avant l&#39;exécution de l&#39;essai: <ol><li> Placer la cartouche du capteur à l&#39;envers côté de la plaque de secteur. </li><li> Remplir chaque puits de la plaque d&#39;utilité avec 200 ul de solution d&#39;étalonnage et d&#39;abaisser la cartouche de capteur sur la plaque d&#39;utilité submergeant les capteurs dans la solution d&#39;étalonnage. </li><li> Vérifiez le niveau de la solution de calibration est assez élevée pour maintenir les capteurs immergés et les placer dans un non-CO 2 37 ° C incubateur O / N. </li></ol></li><li> Préparer milieu d&#39;essai le jour de l&#39;essai comme suit: <ol><li> Chaud moyen de 50 ml de base XF à 37 ° C. </li><li> Ajouter 500 pl 200 mM de L-glutamine pour obtenir une concentration finale 2 mM. </li><li> Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 1 N et stériliser avec un filtre de 0,2 uM et maintenir le milieu d&#39;essai à 37 ° C. </li></ol></li><li> Retirez délicatement le milieu de culture cellulaire à partir des macrophages polarisés et le stocker à -20 ° C pour une utilisation ultérieure (par exemple ELISA pour examiner la polarisation des macrophages bon). Laver les cellules avec un milieu de dosage de 100 pi, ajouter 180 milieu d&#39;essai par puits et de vérifier sous le microscope que les cellules ne sont pas emportés. Placer la plaque de culture de cellules dans un incubateur à 37 ° C sans CO 2 pendant 1 heure avant la série de tests. </li><li> Préparez 10 x composé d&#39;injection mélanges A jusqu&#39;à D comme décrit dans le tableau 1, chaud à 37 ° C, ajuster le pH à 7,4 et stériliser par filtration. <ol><li> Ajouter tous les composés dans ces mélanges à 10 fois la concentration finale dans les puits de culture cellulaire et d&#39;optimiser ces concentrations pour chaque type de cellule. </li></ol></li><li> Chargez la cartouche du capteur en utilisant les guides de chargement prévues avec des volumes indiqués (tableau 1) de la préparés 10x mélanges de composés d&#39;injection dans les ports A, B, C et D, respectively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Mélange / Injection </td><td> Composés </td><td> Volume ajouté pour obtenir 10x mélange (ul) </td><td> Volume milieu de dosage (ml) </td><td> Volume injecté pendant l&#39;exécution (ul) </td><td> La concentration finale dans l&#39;essai </td></tr><tr><td> UN </td><td> 2,5 M (45%) glucose </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> B </td><td> 5 mM oligomycine A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1,5 pM </td></tr><tr><td> C </td><td> MM FCCP 5 </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1,5 pM </td></tr><tr><td></td><td> Solution 100 mM de pyruvate de sodium </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> ré </td><td> 5 mM antimycine A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 pM </td></tr><tr><td></td><td> MM roténone 5 (Rot) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1,25 uM </td></tr></tbody></table> Tableau 1. mélanges d&#39;injection. 3. Caractérisation de la bioénergétique polarisée M1 et M2 BMDM l&#39;aide d&#39;un analyseur de Flux extracellulaire <ol><li> Créer un modèle de test avec l&#39;assistant de dosage avec 2 minutes et 3 fois MIX minutes de mesurer et (au moins) 3 mix et de taux mesures boucles avant chacun des 4 injections (tableau 1) et après la dernière injection. Note: Ces concentrations sont valables pour les macrophages dérivés de la moelle osseuse et de cellules RAW264.7 macrophages lignes, mais doivent être optimisées pour chaque type de cellule. Ajout de pyruvate dans le mélange FCCP est nécessaire pour alimenter la respiration maximale. </li><li> Démarrez la course en appuyant sur le bas de début et de suivre les instructions de l&#39;appareil. Première charge la voitureplaque cartouche avec les sondes hydratés pour permettre la calibration par l&#39;appareil et la charge prochaine de la plaque de cellule. </li><li> Après l&#39;essai, jeter soigneusement tout milieu de test et mémoriser la culture cellulaire analysé microplaque à -20 ° C pendant avenir normalisation de cellules en utilisant le kit de dosage de la prolifération des cellules comme décrit en détail par le fournisseur. <ol><li> En bref, préparer un tampon de lyse cellulaire par dilution 1x composant B 20 fois dans de l&#39;eau distillée et diluer le composé A 400 fois dans le tampon de lyse cellulaire 1x. Ajouter 200 pi par puits, incuber 5 min à température ambiante et mesurer la fluorescence avec ~ 180 nm excitation et ~ 520 nm des maxima d&#39;émission. Remarque: Lorsque vous travaillez avec des cellules non adhérentes ou si une mauvaise observance est un sujet de préoccupation, le kit de prolifération cellulaire directe peut être utilisé comme une alternative puisque ce protocole ne nécessite pas de se défaire de toute milieu de dosage. Pourtant, ce protocole directe est légèrement moins sensible par rapport au protocole utilisé dans ce laboratoire. </li></ol></li><li> Après la mesure de la fluorescence, de normaliserle nombre de cellules dans chaque puits comme un rapport dans lequel la numération cellulaire moyenne de tous les puits de macrophages naïfs est fixé à 1. Remarque: la quantification des protéines (par exemple en utilisant un dosage BCA) pourrait être utilisé comme une alternative à normaliser comptages de cellules. Cependant, dans nos mains ce dosage était moins sensible par rapport à la trousse de dosage de la prolifération cellulaire. </li></ol>

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<li>Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+metabolism+and+macrophage+functional+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22International+reviews+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular metabolism and macrophage functional polarization.</a> International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).</li>
</ol>

Accès gratuit à cet article est sponsorisé par Seahorse Bioscience.

Le but de notre laboratoire est de comprendre comment la polarisation et la fonction des macrophages peuvent être influencés dans le but ultime d&#39;améliorer le résultat de l&#39;athérosclérose et d&#39;autres états inflammatoires 12. Pour évaluer macrophages polarisation, on mesure habituellement le LPS (+ IFNy) induites et d&#39;IL-4 induit l&#39;expression du gène de M1 et des gènes marqueurs M2 (qPCR), détermine l&#39;IL-6, IL-12, TNF et NO sécrétion (par ELISA et réaction de Griess) examine et IL-4 induite par CD71, CD206, CD273 et CD301 expression de surface (par cytométrie de flux) et activité arginase 3,13. En outre, des dosages d&#39;apoptose (par l&#39;annexine-V / PI coloration), des tests de phagocytose (avec des billes fluorescentes de latex et / ou pHrodo E. coli) et des dosages de formation de cellules spumeuses (par Dil-oxLDL absorption, LipidTOX neutre coloration des lipides) peuvent être effectuées à évaluer la fonctionnalité des macrophages 14. En outre, l&#39;analyse de flux extracellulaire peut être effectuée pour mesurer la bioénergétique profils de mac polariséerophages comme une nouvelle solution de rechange et de lecture fonctionnelle. Ce manuscrit montre que la polarisation des macrophages induit reprogrammation métabolique avec des macrophages induite par LPS de commutation à l&#39;augmentation de la glycolyse comme leur source d&#39;énergie. Inversement, les macrophages M2 IL-4 induit la phosphorylation oxydative mitochondriale utilisent comme source principale de l&#39;ATP. Surtout, métabolique reprogrammation non seulement fournit de l&#39;énergie pour les besoins particuliers de M1 et M2 macrophages polarisées. En effet, des changements métaboliques effet sur ​​les concentrations de metabolites qui sont des régulateurs directs du phénotype de macrophage 10,15,16. Par conséquent, le métabolisme des macrophages est non seulement une caractéristique (comme montré ici dans la figure 2), mais aussi un pilote d&#39;états de polarisation macrophages distinctes et ces nouvelles connaissances soutenu la croissance rapide de la zone de recherche de immunometabolism cours des deux dernières années. Cependant, les mesures robustes de profils métaboliques dans macrophages resté difficile et avaient leurs limites. Dans cette étude, un analyseur de flux extracellulaire est appliquée pour mesurer robuste glycolyse, Réserve de la glycolyse, la capacité glycolytique maximale, l&#39;acidification non-glycolytique, basale et la respiration maximale, la production d&#39;ATP, la capacité respiratoire de secours, fuite de protons et de la respiration non mitochondrial en temps réel dans une quantité minimale de macrophages. Par conséquent, nous avons modifié et amélioré les protocoles du fabricant comme suit. Le test de stress Mito standard (# 103015 à 100) suggère en utilisant le milieu avec du glucose et du pyruvate et un protocole avec 3 injections (OM, FCCP, AA / rot). Nous optons pour démarrer le test avec / milieu sans pyruvate-glucose, ajouter le glucose comme une première injection dans l&#39;orifice A (comme dans la glycolyse Stress Test # 103020 à 100) et ajouter pyruvate avec le découplant FCCP au port C. De cette façon, , tous les paramètres de la glycolyse en question proviennent de mesures ECAR 1-9 et tous les renseignements pertinents au sujet mitochondrial fonction à partir de mesures OCR 4-15. Notez qu&#39;il est essentiel d&#39;injecter pyruvate avec FCCP pour alimenter la respiration maximale sur le découplage. Avant d&#39;utiliser ce protocole combiné, il faut également vérifier que le 2-désoxy-D-glucose (2-DG) abaisse le taux de ECAR après l&#39;essai aux valeurs de base (1-3) et que les taux d&#39;ECAR enregistrées 4-6 sont en effet en raison de la glycolyse. En outre, il faut comprendre que les concentrations de composé et le nombre de cellules utilisées dans ce manuscrit sont valables pour les macrophages dérivés de la moelle osseuse et de cellules RAW264.7 macrophages lignes et doivent être optimisées pour d&#39;autres types de cellules. En outre, il faut noter que le M-CSF, qui est utilisé pour générer des macrophages dérivés de la moelle osseuse favorise un phénotype anti-inflammatoire semblable à M2. Les résultats présentés à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse peuvent donc pas entièrement comparable à des mesures avec les macrophages résidents de tissu primaire ou des lignées de cellules macrophages qui ne nécessitent pas de M-CSF pendant Culturi cellulaireng. Par rapport aux méthodes existantes, ce protocole exige des quantités minimes de macrophages et fournit rapidement la quasi-totalité des caractéristiques fondamentales métaboliques cellulaires. Il en résulte dans les cellules excédentaires suffisantes pour effectuer d&#39;autres tests immunologiques et même les cellules utilisées pour la bioénergétique profilage pourrait encore être utilisés pour d&#39;autres résolu après le dosage. En outre, le format de la plaque notamment 96 puits permet d&#39;évaluer plusieurs conditions en temps réel dans le même temps. Cependant, la variation entre les puits individuels peut être considérable et donc l&#39;utilisation d&#39;au moins 4 puits par condition est souvent souhaitable. Prise en compte cette limitation, l&#39;analyse des flux extracellulaire décrit permet toujours d&#39;exécuter plus de 10 conditions expérimentales (n = 6) à la fois, ce qui est beaucoup plus que les techniques traditionnelles. Dans l&#39;ensemble, cet article propose une analyse fonctionnelle facile et reproductible qui permet de mesurer toute la glycolyse pertinente et param mitochondrialparamè- en sous-ensembles de macrophages polarisée. Cette technique peut servir une demande future pour évaluer la fonction des macrophages et d&#39;évaluer l&#39;effet des manipulations distinctes (par exemple gène abattre, de nouveaux produits pharmaceutiques, etc.) sur (métabolique) le phénotype de macrophage. En tant que tel, les données de flux extracellulaires peuvent être utilisés en conjonction avec d&#39;autres analyses pour permettre la caractérisation approfondie de l&#39;état d&#39;activation des macrophages.

Alors que les macrophages jouent un rôle central dans pratiquement toutes les maladies, les mécanismes moléculaires qui régulent leur phénotype ne sont pas encore entièrement démêlé. Les macrophages présentent une forte hétérogénéité et en réponse à la micro-environnement 1 adoptent différents phénotypes. LPS (+ IFN-y) induite par les macrophages activés classique M1 ou M (LPS) favorisent l&#39;inflammation et protègent l&#39;hôte contre différents types de menaces microbiennes 2. D&#39;autres utilisent IFNy seul ou en combinaison avec le TNF comme stimuli pour provoquer une polarisation M1. IL-4 et / ou IL-13 induit l&#39;activation des macrophages et ces alternatif M2 ou M (IL-4) sont des cellules suppresseurs et les contrôleurs de réponses immunitaires en cours 3 puissants. Macrophages polarisées affichent un règlement distinct du métabolisme cellulaire avec les macrophages M1 LPS-activés subir un commutateur métabolique à l&#39;amélioration de la glycolyse 4-6. Oxydation Inversement, amélioré l&#39;acide gras (FAO) et oxidativ mitochondriale phosphorylation (OXPHOS) fournit de l&#39;énergie durable dans les macrophages M2 IL-4-induites 7-9. Ainsi, une modification du métabolisme est non seulement une caractéristique de sous-ensembles macrophages polarisés, il est également une condition préalable pour la polarisation appropriée et la réglementation inflammatoire. Surtout, l&#39;inhibition de la glycolyse ou OXPHOS / FAO a été démontré à porter atteinte à l&#39;activation M1 ou M2, respectivement 8,10. En tant que tel, l&#39;identification des changements métaboliques dans les macrophages pourraient être appliquées comme un outil pour évaluer leur état de polarisation et le potentiel inflammatoire. Un essai qui mesure conforme métabolisme des macrophages pourrait donc être utilisée pour prédire si un médicament, gène abattre ou d&#39;un autre traitement affecte la polarisation et de la fonction des macrophages. Dans cette vidéo, un analyseur de flux extracellulaire est utilisé pour caractériser les profils de bioénergétiques, les macrophages M1 et M2 naïfs. Ce manuscrit détaille un protocole optimisé qui permet la mesurede tous les paramètres pertinents de la glycolyse (de la glycolyse, la glycolyse maximale et de réserve de la glycolyse) et les caractéristiques de la fonction mitochondriale (de la respiration totale, la respiration mitochondriale basale, la production d&#39;ATP, fuite de protons, respiration maximale et la capacité respiratoire de secours) en un seul essai. L&#39;utilisation de ce dispositif expérimental, bioénergétique peuvent être comparées entre le contrôle et «altéré» (par exemple gène abattre, la surexpression transgénique ou traitement pharmacologique) cellules.

<table><tbody><tr><td>Aiguilles 23G et 25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>#300800 et #300600</td><td>Pour rincer la moelle osseuse</td></tr><tr><td>Seringues de 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>#307736</td><td>Pour rincer la moelle osseuse</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Greiner</td><td>#639161</td><td>Pour cultiver des cellules de moelle osseuse</td></tr><tr><td>CyQUANT Kit de dosage de la prolifération cellulaire&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires</td> <td>#C7026</td><td>Pour la quantification cellulaire à un moment ultérieur (ne fonctionne que pour les cellules adhérentes)</td></tr><tr><td>Kit de test de prolifération cellulaire directe CyQUANT&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires</td><td>#35011</td><td>Pour la quantification cellulaire immédiatement après le test (cellules non adhérentes)</td></tr><tr><td>XFe96 microplaque de culture cellulaire</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#101085-004</td><td>Plaque à 96 puits dans laquelle les cellules sont cultivées et dans laquelle le test est effectué</td></tr><tr><td>interleukine-4 de souris recombinante (IL-4)</td><td>Peprotech</td><td>#214-14-B</td><td>Utilisé pour induire l’activation</td></tr> <tr><td>alternative des macrophageslipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma</td><td>#L2637</td> Cartouche de capteur de <td>stimulus pro-inflammatoire</td></tr><tr><td>Seahorse&nbsp ;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102416-100</td><td>Contient les sondes pour la mesure du pH et de l’O2</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant&nbsp ;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#100840-000</td><td>Nécessaire pour hydrater les sondes pendant la nuit.</td></tr><tr><td>XF base moyenne&nbsp ;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102353-100</td><td>Milieu sans tampon qui permet une mesure efficace des changements de pH</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>#G8769</td><td>Alimente la glycolyse une fois ajoutée aux cellules</td></tr><tr><td>oligomycine A</td><td>Sigma</td><td>#75351</td><td>Inhibe l’ATP synthase mitochondriale</td></tr><tr><td>FCCP ( Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone)</td><td>Sigma</td><td>#C2920</td><td>Découple la respiration mitochondriale</td></tr><tr><td>100 mM Solution de pyruvate de sodium</td><td>Lonza</td><td>#BE13-115E</td><td>Permet une respiration mitochondriale maximale sans avoir besoin de glycolyse</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674</td><td>Inhibe le complexe III des mitochondries</td></tr><tr><td>Roténone</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674R8875</td><td>Inhibe le complexe I de la mitochondries</td></tr><tr><td>Casy Cell Counter</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#05 651 697 001</td><td>Instrument pour compter les cellules</td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>#14-0161</td><td>Cytométrie en flux par bloc de récepteur Fc</td></tr><tr><td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>#47-4801</td><td>Anticorps contre les macrophages</td></tr><tr><td>anti-CD11b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>#11-0112</td><td>Anticorps pour colorer les macrophages</td></tr></tbody></table>

caractérisation métabolique des polarisée m1 et m2 macrophages dérivées de moelle osseuse utilisation en temps réel analyse extracellulaire flux

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Les voies métaboliques spécifiques sont de plus en plus reconnues comme des caractéristiques critiques des sous-ensembles de macrophages. Alors que les macrophages M1 ou M(LPS) activés classiquement induits par le LPS sont pro-inflammatoires, l’IL-4 induit une activation alternative des macrophages et ces soi-disant M2 ou M(IL-4) favorisent la résolution de l’inflammation et la cicatrisation des plaies. Des preuves récentes montrent le rôle crucial de la reprogrammation métabolique dans la régulation de la polarisation des macrophages M1 et M2. 
Dans ce manuscrit, un analyseur de flux extracellulaire est utilisé pour évaluer les caractéristiques métaboliques de macrophages naïfs, polarisés M1 et M2 dérivés de la moelle osseuse de souris. Cet instrument utilise des sondes de pH et d’oxygène pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR), qui peuvent être liés au métabolisme oxydatif glycolytique et mitochondrial. Ainsi, la glycolyse et le métabolisme oxydatif mitochondrial peuvent être mesurés en temps réel en un seul essai.
En utilisant cette technique, nous démontrons ici que les macrophages inflammatoires M1 présentent un métabolisme glycolytique amélioré et une activité mitochondriale réduite. À l’inverse, les macrophages M2 anti-inflammatoires présentent une phosphorylation oxydative mitochondriale élevée (OXPHOS) et sont caractérisés par une capacité respiratoire de réserve (SRC) améliorée. 
Le test fonctionnel présenté sert de cadre pour étudier comment des cytokines particulières, des composés pharmacologiques, des knock-outs de gènes ou d’autres interventions affectent le phénotype métabolique et l’état inflammatoire du macrophage.

Après avoir terminé l&#39;essai et la cellule de flux quantification extracellulaire, les données peuvent être normalisées par le nombre de cellules et analysés. Cela donne habituellement ECAR OCR parcelles et comme représenté sur la figure 1A et la figure 1B. Après l&#39;injection de glucose (A), l&#39;augmentation de la ECAR représente le taux de glycolyse. L&#39;augmentation supplémentaire ECAR après inhibition de l&#39;ATP synthase avec oligomycine (B) fournit des informations sur la réserve et de la capacité (figure 1A) de la glycolyse. Lorsque l&#39;on analyse les valeurs ROC, oligomycine injection (B) permet le calcul de la consommation d&#39;oxygène utilisé pour la synthèse d&#39;ATP mitochondrial. FCCP (C) découple respiration mitochondriale et les mesures correspondantes OCR fournissent des données sur le maximale et la capacité respiratoire de secours. Enfin, l&#39;injection de la roténone (Rot) et antimycine A (AA) bloquent mitochondrial complexes I et III et l&#39;OCR résiduelle représente les inconvénients non-mitochondriales oxygèneumption (figure 1B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Figure 1: paramètres métaboliques issus d&#39;un test de flux XF extracellulaire. (A) À la suite des paramètres de la glycolyse cellulaire sont calculés à partir des valeurs ECAR (en mph / min): la glycolyse, la capacité maximale de la glycolyse et réserve de la glycolyse. Mesures (B) OCR (en pmoles / min) sont utilisés pour calculer les prochaines paramètres fondamentaux de la fonction mitochondriale: respiration basale, la production d&#39;ATP, fuite de protons, respiration maximale et la capacité respiratoire de secours. Gluc = glucose; OM = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4- (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; AA = antimycine A; Rot = roténone <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Après la course, l&#39;ECAR et OCR mesures 1 till 15 pour chaque puits peut être exporté vers Excel et les paramètres de la glycolyse suivantes peut être calculée à partir des mesures de ECAR comme suit: Acidification non-glycolytique = avg. ECAR (1,2,3) Glycolyse = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3) La capacité maximale de la glycolyse = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3) Réserve glycolytique = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6) De les taux de ROC, les prochaines caractéristiques métaboliques peuvent être déterminées: La respiration mitochondriale non = avg. OCR (13,14,15) Respiration basale = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15) La production d&#39;ATP = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9) Fuite de protons =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15) Respiration maximale = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15) La capacité respiratoire de secours (SRC) = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4,5,6) <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Figure 2:. Caractéristiques métaboliques de naïve (M0), LPS (M1) et IL-4- (M2) des macrophages polarisés Pour chaque mesure, la moyenne et l&#39;écart type de la moyenne (SEM) de 8 puits individuels est présenté. (A) les taux d&#39;acidification extracellulaire (ECAR, en MPH / min) et (b) les taux de consommation d&#39;oxygène (OCR, en pmoles / min) sont mesurées pour différentielle polarisée (M1 et M2) et les macrophages naïfs (M0). Toutes les mesures ont été normalisées pour le nombre de cellules (telle que mesurée avec CyQUANT) et la numération cellulaire moyenne des macrophages naïfs a été fixée à 1. Dansinjection A = glucose; B = oligomycine; C = FCCP; D = A + antimycine roténone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Comme le montre la Figure 2A, l&#39;activation des macrophages par le LPS induit une augmentation du métabolisme glycolytique. Les différences entre les macrophages LPS et IL-4-traitées sont encore plus évident quand on regarde les taux de consommation d&#39;oxygène (OCR) dans la figure 2B. En effet, alors que le métabolisme oxydatif maximale est fortement réprimée dans M (LPS), la IL-4 induit la respiration basale et maximale en particulier dans les macrophages M2. Il faut noter que l&#39;augmentation de la glycolyse est assez unique à M (LPS) et de macrophages est pas nécessairement une caractéristique des macrophages M1 puisque M (IFN-y) macrophages ne présentent pas d&#39;améliorer la glycolyse. Dans l&#39;ensemble, cette analyse démontre flux extracellulaire that IL-4 induit les macrophages M2 sont caractérisés par un métabolisme oxydatif améliorée et surtout une capacité respiratoire de secours haute (SRC), tandis que l&#39;affichage LPS-macrophages activés amélioré le métabolisme glycolytique et ne possèdent aucune capacité respiratoire de secours.

La reprogrammation métabolique est une caractéristique et une condition préalable à la polarisation des macrophages M1 et M2. Ce manuscrit décrit un test pour la mesure des paramètres fondamentaux de la glycolyse et de la fonction mitochondriale dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris. Cet outil peut être utilisé pour étudier comment des facteurs particuliers affectent le métabolisme et le phénotype du macrophage.

Caractérisation métabolique des polarisée M1 et M2 macrophages dérivées de moelle osseuse Utilisation en temps réel Analyse extracellulaire Flux

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

L'objectif général de cette analyse de flux extracellulaire est d'évaluer les caractéristiques métaboliques des macrophages dérivés de la moelle osseuse polarisés M1 naïfs et M2. Cette méthode peut servir de cadre pour étudier l'impact de cytokines, de composés ou de gènes spécifiques sur le phénotype métabolique des macrophages. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle nécessite uniquement une faible quantité de macrophages.En outre, il permet de mesurer tous les paramètres pertinents de la glycolyse et mitochondriaux dans un seul et même test. Bien que cette méthode offre un aperçu du phénotype métabolique des macrophages dérivés de la moelle osseuse, elle peut également être appliquée à tous les types de macrophages ou de cellules immunitaires. Nous avons eu l'idée de publier cette méthode dans J, car nous recevons fréquemment des demandes d'autres scientifiques qui nous sollicitent pour les aider dans leurs dosages métaboliques de flux cellulaires. Au huitième jour de culture, vérifiez la présence de macrophages matures par inspection visuelle et incubez les macrophages matures dérivés de la moelle osseuse dans 10 millilitres de solution saline citratée pendant cinq minutes.À 37 degrés Celsius, lorsque les cellules se sont détachées. Laver la culture avec 10 millilitres de PBS et dénombrer le nombre de cellules viables. Ensuite, ensemencer cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par puits.Dans une plaque de culture cellulaire XFE 96, ajouter 100 microlitres de milieu de culture par puits, en tenant la pipette inclinée à environ mi-hauteur sur la paroi de chaque puits. Pour distribuer les cellules, ajouter uniquement du milieu dans les puits de correction du fondamental A 1, A 12, H 1 et H 12. Laisser ensuite les cellules se déposer pendant une heure à température ambiante dans une hotte de culture cellulaire.Après avoir confirmé l'adhérence cellulaire, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Trois heures après le semis, stimuler quatre à six puits de cellules par condition, selon les besoins, pendant 24 heures. Pour polariser les macrophages dérivés de la moelle osseuse la veille du test de flux extracellulaire, placer la cartouche capteur à l'envers à côté de la plaque d'alimentation et remplir chaque puits de la plaque avec 200 microlitres de solution crin.Ensuite, abaissez la cartouche du capteur sur la plaque d'appoint pour immerger les capteurs dans la solution de Cain et vérifiez que le niveau de la solution de Cain est suffisamment élevé pour maintenir le capteur immergé. Puis placez la cartouche dans un incubateur à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant toute la nuit. Le lendemain, retirez délicatement le surnageant des macrophages polarisés et lavez les cellules avec 100 microlitres de milieu fraîchement préparé pour le dosage.Millilitres de milieu par puits. Ajouter 180 microlitres de milieu d'essai dans chaque puits, puis utiliser le microscope pour vérifier que les cellules n'ont pas été détachées. Si les cellules sont toujours fixées, placer la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant une heure avant l'exécution de l'essai, pendant que les cellules poursuivent leur incubation.Préparez 10&nbsp;mélanges composés d'injection comme indiqué dans le tableau et chauffez les mélanges à 37&nbsp;degrés Celsius. Ensuite, chargez la cartouche capteur avec les volumes appropriés de composé et des ports A, B, C et D en utilisant les guides de chargement fournis afin de caractériser la bioénergie des macrophages polarisés par dosage du flux extracellulaire. Utilisez l'assistant de dosage pour créer un modèle de dosage avec des temps de mélange de deux minutes et de mesure de trois minutes, ainsi qu'au moins trois cycles de mélange et de mesure du taux avant chacune des quatre injections et après la dernière injection.Commencez ensuite le test et suivez les instructions indiquées par l'appareil. Chargez la plaque de cartouche avec les sondes hydratées afin de permettre l'étalonnage par l'appareil et la plaque de cellules. Lorsque cela est indiqué, à la fin du test, éliminez soigneusement tout le milieu de dosage et conservez la microplaque de culture cellulaire analysée à moins 20 degrés Celsius jusqu'à la normalisation.Pour normaliser les cellules à l'aide du kit de dosage de la prolifération cellulaire, décongeler la plaque et incuber les cellules dans 200 microlitres de tampon de lyse cellulaire fraîchement préparé par puits pendant cinq minutes à température ambiante. Enfin, mesurer la fluorescence avec une excitation d'environ 480 nanomètres et un maximum d'émission d'environ 520 nanomètres. Utiliser les mesures de fluorescence obtenues pour calculer le rapport dans lequel le nombre moyen de cellules de tous les puits de macrophages naïfs est fixé à un, puis exporter ces rapports vers le logiciel d'analyse Seahorse Wave.Pour normaliser les données, un dosage de flux extracellulaire fournit généralement des courbes de taux de modification extracellulaire (ECAR) ou de taux de consommation d'oxygène (OCR), comme illustré sur cette figure représentative après l'injection de glucose ; l'augmentation observée de l'ECAR représente le taux de glycolyse. L'augmentation supplémentaire observée de l'ECAR après une inhibition de la synthèse d'ATP par l'antimycine A fournit des informations complémentaires sur la réserve et la capacité glycolytiques. Lors de l'analyse des valeurs d'OCR, l'injection de CIN permet de calculer la consommation d'oxygène utilisée pour la synthèse mitochondriale d'ATP, tandis que le FCCP découple la respiration mitochondriale.Les mesures OCR correspondantes fournissent des données sur la capacité respiratoire maximale et la capacité respiratoire de réserve. La rotenone et l'injection d'antimycine A bloquent toutefois respectivement les complexes mitochondriaux I et III, la consommation résiduelle d'oxygène représentant alors la consommation d'oxygène non mitochondriale. L'activation des macrophages par le LPS induit un métabolisme glycolytique accru. Les différences entre les macrophages traités au LPS et à l'IL-4 deviennent encore plus marquées lorsqu'on observe les taux de consommation d'oxygène.En effet, alors que le métabolisme oxydatif maximal est fortement inhibé dans les macrophages traités par le LPS, l'IL-4 induit une respiration robuste dans les macrophages de type M2. Une fois maîtrisé, le test de flux extracellulaire peut être réalisé en deux heures s'il est effectué correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'injecter le vet en même temps que le FCCP afin de stimuler la respiration maximale après découplage.Après cette technique, des tests supplémentaires comme ELISA peuvent être réalisés afin d'évaluer une polarisation efficace des macrophages. Cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de l'immunologie pour explorer les caractéristiques métaboliques d'un large éventail de cellules immunitaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une analyse du flux extracellulaire afin d'évaluer le phénotype métabolique des macrophages.

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