Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5

L’objectif général de ce protocole est de démontrer comment générer efficacement des cardiomyocytes induits à partir de fibroblastes cardiaques avec une construction MGT poly cyonique, exprimant un rapport optimal de gata quatre, F deux C et TBX cinq. Cette méthode fournit une plate-forme précieuse pour la recherche sur les cardiomyocytes induits et facilitera les études post-criblage et mécanistes de la programmation des cardiomyocytes induits tout en faisant évoluer le domaine vers des applications cliniques. Le principal avantage de cette technique est qu’en utilisant une seule construction rétrovirale, les fibroblastes cardio peuvent être efficacement convertis en cardiomyocytes.

Nettoyez la souris transgénique néonatale alpha myosine à chaîne lourde GFP avec 75 % de volume à volume. L’éthanol effectue l’euthanasie. Ouvrez ensuite la cavité corporelle en faisant une incision horizontale sous une aisselle à l’autre à l’aide d’une pince stérile, émoussée et pliée.

Disséquez le cœur et placez-le dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant de la glace. Les PBS froids observent l’expression de la GFP dans tout le cœur à l’aide de la microscopie à fluorescence. Placez trois cœurs positifs à 4G FP dans une boîte de culture de 60 millimètres à l’aide de pinces et de ciseaux stériles, coupez les cœurs en petits morceaux de moins d’un millimètre cube.

Transférez les cœurs émincés dans un plat de 10 centimètres et couvrez de deux millilitres de fiberblast ou de milieu FB. Laissez les plaques intactes pendant au moins trois heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajoutez lentement huit millilitres de milieu FB préchauffé dans le plat contenant le tissu cardiaque haché.

Ensuite, incubez le tissu sans être dérangé, sauf pour changer de milieu tous les trois jours. Le septième jour, aspirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du DPBS. Ajoutez trois millilitres d’EDTA à 0,05 % dans chaque assiette et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ajoutez cinq millilitres de milieu FB pour désactiver la trypsine, puis détachez doucement les cellules avec un grattoir cellulaire. Ensuite, collectez les cellules et filtrez-les à travers des passoires de cellules de 40 microns pour éviter la contamination par des fragments de tissu cardiaque. Granulez les cellules par centrifugation à 200 fois G pendant cinq minutes, en commençant par des cœurs de souris néonatales isolés.

Coupez chaque cœur en quatre morceaux qui sont encore faiblement reliés. Transférez les cœurs dans un tube conique de 15 millilitres contenant huit millilitres de trips chauds à 0,05 % dans de l’EDTA et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après l’incubation, jetez les tripsin EDTA et ajoutez cinq millilitres de vortex de collagénase chaude de type deux pendant une minute à vitesse moyenne, puis incubez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.

Puis faites à nouveau tourbillonner le tube pendant une minute. Laissez les morceaux de tissu se déposer et recueillez le surnageant dans un nouveau tube contenant cinq millilitres de milieu FB froid. Ajoutez cinq millilitres de collagénase fraîche de type deux aux morceaux de tissu et répétez les étapes de vortex et d’incubation.

Combinez toutes les cellules contenant des surnageants en les filtrant à travers une crépine de cellules de 40 microns. Centrifugez ces cellules à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. En suivant l’une ou l’autre des méthodes d’isolement des fibroblastes cardiaques.

Lavez la pastille de cellule finale une fois dans 10 millilitres de tri cellulaire activé magnétique ou de tampon maximum. Prélever 10 microlitres pour le comptage des cellules vivantes et centrifuger les cellules restantes à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pendant moins d’une fois 10 à la septième cellule. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec 10 microlitres de cuisse 1,2 microbilles magnétiques conjuguées dans 90 microlitres de tampon maximum réfrigéré et mélangez.

Bien incuber les perles à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour granuler les cellules, ajoutez 10 millilitres de tampon maximum et centrifugez les échantillons à 200 fois G pendant cinq minutes. Lavez une fois avec 10 millilitres de tampon maximum et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un volume total de deux millilitres dans une hotte de culture cellulaire.

Configurez un séparateur max et ajoutez une colonne LS. Équilibrez la colonne avec trois millilitres de tampon maximum. Passez la suspension cellulaire à travers la colonne LS et lavez trois fois avec deux millilitres de tampon maximum.

Retirez ensuite la colonne LS du séparateur et éluez trois fois avec deux millilitres de tampon maximum. Collecte de l’EIT dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez l’EIT à 200 fois G pendant cinq minutes.

Remettre en suspension les fibroblastes isolés dans 10 millilitres de milieu FB et compter les cellules, ensemencer les cellules dans des boîtes de culture tissulaire à des densités appropriées dans une plaque de gélatine précodée à 24 puits pour reprogrammer les fibroblastes cardiaques. Ajoutez 500 microlitres de cardiomyocytes induits ou de milieu ICM contenant du poly cerveau à chaque puits des 24 plaques de puits contenant des cellules. Ajoutez 10 microlitres du rétrovirus dans chaque puits de fibroblastes isolés.

Incuber la plaque avec des particules rétrovirales pendant 24 à 48 heures dans un incubateur de culture cellulaire. Remplacez ensuite le milieu contenant le virus par 500 microlitres de milieu ICM frais, en changeant le milieu tous les deux à trois jours. Commencer la sélection positive des cellules virales transduites en complétant le milieu ICM avec deux microgrammes par millilitre de mycine pure.

Après trois jours de sélection, changez le milieu à une dose d’entretien d’un microgramme par millilitre de mycine pure pour visualiser la conversion des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes. Observez l’expression de la GFP sur des plaques sélectionnées de mycine pure à l’aide d’un microscope inversé. Enfin, 14 jours après le traitement viral, remplacer le milieu ICM par du B 27.

Des loci cellulaires battants spontanés moyens peuvent apparaître trois à quatre semaines après l’expression par transduction virale de marqueurs cardiaques, y compris la troponine cardiaque t et alpha. L’actinine peut être détectée par immunochimie entre les jours 10 à 14. Ici, l’expression de la troponine T cardiaque est observée dans l’I CMS converti à partir de fibroblastes, qui expriment l’expression de la GFP alpha actinine dans les ICM peut être observée ici.

L’analyse par cytométrie en flux montre des augmentations similaires de l’expression de la troponine T cardiaque, en particulier après la sélection de mycine pure des cardiomyocytes induits. La mythologie décrite ici permet la génération efficace de cardiomyocytes induits basés sur l’administration rétrovirale de facteurs de transcription NGT dans une seule construction.