Name: Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez la génération efficace de cardiomyocytes induits à partir de fibroblastes cardiaques en utilisant un construit polycistronique rétroviral unique. Cette méthode améliore l'homogénéité cellulaire et facilite les études mécanistiques en biologie cardiovasculaire.

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Nous sommes reconnaissants de l’assistance technique experte de la part de la plateforme de cytométrie en flux de l’UNC et de la plateforme de microscopie de l’UNC. Nous remercions les membres du laboratoire Qian et du laboratoire Liu pour les discussions utiles et les critiques du manuscrit. Cette étude a été financée par la subvention R00 HL109079 du NIH/NHLBI au Dr Liu et la subvention de développement scientifique 13SDG17060010 de l’American Heart Association (AHA) et la subvention de New Scholar AG-NS-1064-13 de l’Ellison Medical Foundation (EMF) au Dr Qian.

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<li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+in+vitro+and+in+vivo+direct+reprogramming+of+cardiac+fibroblasts+to+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.</a> Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).</li>
<li>Muraoka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-133+promotes+cardiac+reprogramming+by+directly+repressing+Snai1+and+silencing+fibroblast+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures.</a> Embo J. 33, 1565-1581 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141, 4267-4278 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiac+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).</li>
<li>Protze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+transcription+factor+screening+for+reprogramming+of+fibroblasts+to+cardiomyocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).</li>
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<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Molecules+Enable+Cardiac+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+with+a+Single+Factor%2C+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4.</a> Cell Rep. , (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+Gata4%2C+Mef2c%2C+and+Tbx5+Influences+the+Efficiency+and+Quality+of+Induced+Cardiac+Myocyte+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming.</a> Circ Res. , (2014).</li>
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<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li>
<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cardiac+cellular+reprogramming+efficacy+is+enhanced+by+angiogenic+preconditioning+of+the+infarcted+myocardium+with+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor.</a> J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).</li>
<li>Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+thymosin+beta4+and+cardiac+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors.</a> Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour réussir une génération iCM lors de l&#39;utilisation de ce protocole, il ya plusieurs facteurs importants qui ont une incidence sur l&#39;efficacité globale. Notamment les conditions de fibroblastes de départ et la qualité de l&#39;encodage de rétrovirus MGT peuvent grandement affecter l&#39;efficacité de reprogrammation. Il est important de générer des fibroblastes aussi frais et sain que possible. Pour la méthode de explant, les fibroblastes peuvent être utilisés avant les sept jours ...

Les maladies cardiovasculaires restent la principale cause de décès dans le monde, avec 17,3 millions de décès par an1. La perte de cardiomyocytes résultant d’un infarctus du myocarde (IM) ou d’une insuffisance cardiaque progressive est une cause majeure de morbidité et de mortalité2. En raison de leur capacité de régénération limitée, les cœurs de mammifères adultes souffrent généralement d’une altération de la fonction de pompe et d’une insuffisance cardiaque à la suited’une blessure 3-6. En tant que tel, la (ré)génération efficace de cardiomyocytes in vivo et in vitro pour le traitement des maladies cardiaques et pour la modélisation des maladies est une question critique qui doit être abordée.
Le développement récent de la reprogrammation directe, qui reprogramme directement les cellules d’un phénotype différencié à un autre sans passer par l’état pluripotent, offre une approche alternative prometteuse pour la médecine régénérative. Le cœur des mammifères contient une abondance de fibroblastes cardiaques (FK), qui représentent environ la moitié des cellules du cœur et prolifèrent massivement lors d’une blessure7-9. Ainsi, le vaste bassin de FC pourrait servir de source endogène de nouveaux MC pour la thérapie régénérative s’ils pouvaient être directement reprogrammés en MC fonctionnels. Il a été démontré qu’une combinaison de facteurs de transcription, tels que Gata4 (G), Mef2c (M) et Tbx5 (T), avec ou sans microARN ou petites molécules, peut reprogrammer les fibroblastes en iCM10-26. Il est important de noter que cette conversion peut également être induite in vivo et entraîne une amélioration de la fonction cardiaque et une réduction de la taille des cicatrices dans un cœur infarctus16,27-29. Ces études indiquent que la reprogrammation cardiaque directe peut être une voie potentielle pour guérir un cœur blessé. Cependant, la faible efficacité de la reprogrammation iCM est devenue un obstacle majeur pour d’autres études mécanistes. De plus, la reproductibilité de la reprogrammation cardiaque est une autre question controversée de cette technologie11,30,31. 
Très récemment, nous avons généré un ensemble complet de constructions polycistroniques codant G,M,T dans tous les ordres d’épissage possibles avec des séquences 2A identiques dans un seul ARNm. Ces constructions polycistroniques ont produit des niveaux d’expression variés des protéines G, M et T, ce qui a conduit à une efficacité de reprogrammation significativement différente25. La construction la plus efficace, nommée MGT, qui a montré une expression relativement élevée de Mef2c et une faible expression de Gata4 et Tbx5, a considérablement amélioré l’efficacité de la reprogrammation et a produit de grandes quantités d’iCM avec l’expression de marqueurs CM, une oscillation calcique robuste et un battement spontané25. De plus, en utilisant la construction polycistronique MGT, notre étude a évité l’utilisation de vecteurs multiples et généré des cellules avec un rapport d’expression homogène de G, M, T, fournissant ainsi une plate-forme améliorée pour la recherche sur la reprogrammation cardiaque. Pour augmenter la reproductibilité expérimentale, nous décrivons ici en détail comment isoler les fibroblastes, produire une cassette MGT porteuse de rétrovirus, générer des iCM et évaluer l’efficacité de la reprogrammation.

<table><tbody><tr><td>anti-troponine cardiaque T</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-PO</td><td>1:200 pour FACS et 1:400 pour ICC</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A11122</td><td>1:500 pour FACS et ICC</td></tr><tr><td>anti-aactinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>1:500 pour FACS et</td></tr><tr><td>ICC anti-Connexin43</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6219</td><td>1:500 pour&nbsp ; ICC</td></tr><tr><td>anit-Mef2c</td><td>Abcam</td><td>ab64644</td><td>1:1 000 pour ICC&nbsp ;</td></tr><tr><td>anti-Gata4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1237</td><td>1:200 pour ICC</td></tr><tr><td>anti-Tbx5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17866</td><td>1:200 pour ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash ; âne conjugué anti-lapin IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-545-152</td><td>1:500 pour FACS et ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&ndash ; âne conjugué anti-souris IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>715-605-150</td><td>1:500 pour FACS et ICC</td></tr><tr><td>Kit Cytofix/Cytoperm pour coloration intracellulaire</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-3 Calcium Imaging Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R10145</td><td></td></tr><tr><td>Thy1.2 microbilles</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-101</td><td></td></tr><tr><td>Solution Vectashield avec DAPI</td><td>Vector labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>Corning</td><td>25-052</td><td></td></tr><tr><td>PRMI1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Sérum réduit Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>medium Life Technologies</td><td>10-060</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée</td><td>Life Technologies</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Life Technologies</td><td>11130-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668500</td><td></td></tr><tr><td>blasticidine</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td></td></tr><tr><td>puromycine</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>polybrène</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Fisher</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Solution de précipitation de rétrovirus</td><td>ALSTEM</td><td>VC-200</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td></td><td>gélatine Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco sans CaCl2 et MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>21022</td><td></td></tr><tr><td>LS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu ; Filtre en acétate de cellulose M</td><td>Thermo Scientific</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 24 puits</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Boîtes de culture tissulaire&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>172958</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture à puits central de 60 mm&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylène Deep Well Plate</td><td>Denville Scientific</td><td>P9639</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polystyrène à fond rond avec capuchon de filtre de cellules&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer MINI</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Cell Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiSéparateur MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle rond en verre</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72195-15</td><td></td></tr></tbody></table>

génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques exprimant rapport optimal de gata4, mef2c et tbx5

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

La conversion directe des fibroblastes cardiaques (SCF) en cardiomyocytes induites (ICMS) détient un grand potentiel pour la médecine régénérative en offrant des stratégies alternatives pour le traitement de la maladie de coeur. Cette conversion a été obtenue par expression forcée de facteurs tels que définis Gata4 (G), MEF2C (M) et Tbx5 (T). Traditionnellement, ICMS sont générés par un cocktail de virus exprimant ces facteurs individuels. Cependant, la reprogrammation efficacité est relativement faible et la plupart de l&#39;in vitro G, M, T-fibroblastes transduits ne deviennent pas entièrement reprogrammés, ce qui rend difficile l&#39;étude des mécanismes de reprogrammation. Nous avons récemment montré que la stoechiométrie de G, M, T est cruciale pour l&#39;efficacité de reprogrammation ICM. Une stoechiométrie optimale de G, M, T avec relativement haut niveau de M et de faibles niveaux de G et T obtenus à l&#39;aide de notre vecteur de MGT polycistronique (ci-après dénommé MGT) a augmenté de manière significative l&#39;efficacité de la reprogrammation et amélioration de la qualité iCM in vitro. Ici nous fournissons une description détaillée de la méthodologie utilisée pour générer ICMS avec MGT construction à partir de fibroblastes cardiaques. Isolement des fibroblastes cardiaques, la génération du virus pour la reprogrammation et l&#39;évaluation du processus de reprogrammation sont également inclus afin de fournir une plate-forme pour la production efficace et reproductible du SGCI.

Les étapes de reprogrammation sont résumés par schématique sur la figure 1. Après MGT transduction, l&#39;expression de GFP dans la reprogrammation des cellules peuvent être détectés dès le jour 3. sélection puromycine de cellules transduites commence au jour 3 et est mis à jour pendant les deux premières semaines si PMX-puro -MGT construction est utilisée. Le jour 10 au jour 14, l&#39;expression des marqueurs cardiaques comme cTnT et αActinin pu être détecté à la fois par la CCI <stron...

Nous décrivons ici un protocole pour la génération d’iCM en utilisant l’administration médiée par rétrovirus de Gata4, Tbx5 et Mef2c dans une construction polycistronique. Ce protocole produit une population relativement homogène de cellules reprogrammées avec une efficacité et une qualité améliorées et est précieux pour les études futures de reprogrammation iCM.

Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

L'objectif général de ce protocole est de montrer comment générer efficacement des cardiomyocytes induits à partir de fibroblastes cardiaques à l'aide d'un construct poly cyonique MGT, exprimant un ratio optimal de GATA4, F2C et TBX5. Cette méthode fournit une plateforme précieuse pour la recherche sur les cardiomyocytes induits et facilitera les criblages à haut débit ainsi que les études mécanistiques du reprogrammation en cardiomyocytes induits, tout en faisant progresser le domaine vers des applications cliniques. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'à l'aide d'un seul construct rétroviral, les fibroblastes cardiaques peuvent être convertis efficacement en cardiomyocytes.Nettoyer la souris transgénique néonatale exprimant la chaîne lourde de la myosine alpha avec du GFP à l’aide d’éthanol à 75 % volume/volume. Procéder à l’euthanasie. Ensuite, ouvrir la cavité corporelle en effectuant une incision horizontale allant sous une aisselle à l’autre à l’aide d’une pince stérile, émoussée et recourbée.Dissez le cœur et placez-le dans un puits d'une plaque 24 puits contenant de la glace. Du PBS froid, observez l'expression de la GFP dans tout le cœur à l'aide d'une microscopie à fluorescence. Placez trois à quatre cœurs positifs pour la GFP dans une boîte de culture de 60 millimètres à l’aide de pinces et de ciseaux stériles, puis hachez les cœurs en petits morceaux de moins d’un millimètre cube.Transférez les cœurs hachés dans une boîte de culture de 10 centimètres et recouvrez-les de deux millilitres de milieu fiberblast ou milieu FB. Laissez les boîtes en incubation sans les perturber pendant au moins trois heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, ajoutez lentement huit millilitres de milieu FB préchauffé à la boîte contenant les tissus cardiaques hachés.Ensuite, incuber le tissu sans perturbation, sauf pour changer le milieu tous les trois jours. Au septième jour, aspirer le milieu de culture et laver les cellules avec du DPBS. Ajouter trois millilitres de trips à 0,05 % dans du EDTA à chaque plaque et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Ajoutez cinq millilitres de milieu FB pour désactiver la trypsine, puis détachez délicatement les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules. Ensuite, récupérez les cellules et filtrez-les à travers des tamis cellulaires de 40 microns afin d’éviter toute contamination par des fragments de tissu cardiaque. Faites tomber les cellules en culot par centrifugation à 200 × g pendant cinq minutes, en partant de cœurs de souris néonatales isolés.Couper chaque cœur en quatre morceaux encore faiblement connectés. Transférer les cœurs dans un tube conique de 15 millilitres contenant huit millilitres de trypsine EDTA à 0,05 % tiède et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après l'incubation, éliminer la trypsine EDTA et ajouter cinq millilitres de collagénase de type II tiède ; vortexer pendant une minute à vitesse moyenne, puis incuber le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.Ensuite, vortexer le tube pendant une minute. Laisser les morceaux de tissu se déposer et recueillir le surnageant dans un nouveau tube contenant cinq millilitres de milieu FB froid. Ajouter cinq millilitres de collagénase de type deux fraîche aux morceaux de tissu et répéter les étapes de vortex et d'incubation.Combiner tous les surnageants contenant des cellules en les filtrant à travers un tamis cellulaire de 40 microns. Centrifuger ces cellules à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Suite à l'une des deux méthodes d'isolement des fibroblastes cardiaques.Lavez le culot cellulaire final une fois avec 10 millilitres de tampon de tri magnétique activé par cellules ou de tampon max. Prélevez 10 microlitres pour le décompte des cellules viables et centrifugez les cellules restantes à 200 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour moins de 1 × 10⁷ cellules. Resuspendez le culot cellulaire avec 10 microlitres de microbilles magnétiques conjuguées à thigh 1.2 dans 90 microlitres de tampon max refroidi et mélangez.Incuber correctement les billes à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour faire tomber les cellules en culot, ajouter 10 millilitres de tampon max et centrifuger les échantillons à 200 ×g pendant cinq minutes. Laver une fois avec 10 millilitres de tampon max et resuspendre le culot cellulaire dans un volume total de deux millilitres dans une hotte de culture cellulaire.Installez un séparateur max et ajoutez une colonne LS. Équilibrez la colonne avec trois millilitres de tampon max. Faites passer la suspension cellulaire à travers la colonne LS et rincez trois fois avec deux millilitres de tampon max.Ensuite, retirez la colonne LS du séparateur et éluerez trois fois avec deux millilitres de tampon max. Ramassez l'EIT dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez l'EIT à 200 × g pendant cinq minutes.Ré-suspendez les fibroblastes isolés dans 10 millilitres de milieu FB et comptez les cellules ; ensemencez les cellules dans des boîtes de culture tissulaire à des densités appropriées dans une plaque 24 puits pré-enduite de gélatine pour reprogrammer les fibroblastes cardiaques. Ajoutez 500 microlitres de milieu de cardiomyocyte induit ou milieu ICM contenant du poly cerveau dans chaque puits de la plaque 24 puits contenant les cellules. Ajoutez 10 microlitres du rétrovirus dans chaque puits contenant les fibroblastes isolés.Incuber la plaque avec les particules rétrovirales pendant 24 à 48 heures dans une étuve à culture cellulaire. Remplacer ensuite le milieu contenant le virus par 500 microlitres de milieu ICM frais, en changeant le milieu tous les deux à trois jours. Commencer la sélection positive des cellules transduites par le virus en complétant le milieu ICM avec deux microgrammes par millilitre de purémycine.Après trois jours de sélection, changer le milieu pour une dose d'entretien d'un microgramme par millilitre de pur mycine afin de visualiser la conversion des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes. Observer les plaques sélectionnées avec la pur mycine pour l'expression de la GFP en utilisant un microscope inversé. Enfin, 14 jours après le traitement viral, remplacer le milieu ICM par le milieu B 27.Des foyers cellulaires présentant un battement spontané modéré peuvent apparaître entre trois et quatre semaines après la transduction virale, avec l'expression de marqueurs cardiaques, notamment la troponine T cardiaque et l'alpha-actinine. Cette dernière peut être détectée par immunochimie entre le 10ᵉ et le 14ᵉ jour. Ici, l'expression de la troponine T cardiaque est observée dans les CMIs obtenus à partir de fibroblastes exprimant la GFP. L'expression de l'alpha-actinine dans les CMIs est visible ici.L'analyse par cytométrie en flux montre des augmentations similaires de l'expression de la troponine T cardiaque, en particulier après la sélection par la puromycine des cardiomyocytes induits. La méthodologie décrite ici permet une génération efficace de cardiomyocytes induits basée sur la livraison rétrovirale de facteurs de transcription NGT au sein d'un seul construct.

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Research

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous avons établi un protocole pour l'induction de cardioblasts direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs cardiaques humaines et fonctionnel pour les cardiomyocytes cardiovasculaires réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

La génération de tissu myocardique alignés est une exigence essentielle pour adapter les progrès récents de la biologie des cellules souches à des fins utiles en clinique. Ici nous décrivons une approche impression par microcontact pour le contrôle précis de la forme et la fonction cellulaire. Utilisation populations hautement purifiées de cellules souches embryonnaires dérivées progéniteurs cardiaques, nous avons ensuite générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde.

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Ce protocole décrit comment produire fonctionnel sinus nodal tissu de cellules souches pluripotentes (PSC) murins. T-Box3 (TBX3), plus la surexpression cardiaque myosine-chaîne lourde (MYH6) sélection par antibiotique promoteur conduit à des agrégats de cellules de stimulateur de haute pureté. Ces "induit-sino-auriculaire-organismes" ("iSABs») contiennent plus de 80% de cellules de stimulateur cardiaque, montrent des taux de battement très augmenté et sont capables d'arpenter myocarde ex vivo.

Génération de stimulateur cardiaque murin agrégats de cellules fondées sur la ES-Cell-programmation en combinaison avec MYH6-promoteur-sélection

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Nous présentons ici une méthode robuste pour reprogrammer les fibroblastes embryonnaires primaires dans les cardiomyocytes fonctionnelles par le biais de la surexpression de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 et miR-133 (GHMT2m) aux côtés de l’inhibition de la signalisation TGF-β. Notre protocole génère des cardiomyocytes raclée dès transduction après 7 jours avec jusqu'à 60 % efficacité.

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Nous présentons ici un protocole pour la formation d’une population de cellules à l’aide de stimuli électriques et mécaniques, émulant la physiologie cardiaque. Cette stimulation électromécanique améliore le potentiel de cardiomyogénique des cellules traitées et est une stratégie prometteuse pour autre thérapie cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues.

Stimulation électrique et mécanique simultanée pour promouvoir le potentiel de cellules Cardiomyogénique

Le but de cette méthode est de générer des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque in vitro afin d'étudier la spécification des cellules progénitrices et les propriétés fonctionnelles, et de générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques.

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Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3

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Découvrez la génération efficace de cardiomyocytes induits à partir de fibroblastes cardiaques en utilisant un construit polycistronique rétroviral unique. Cette méthode améliore l'homogénéité cellulaire et facilite les études mécanistiques en biologie cardiovasculaire.

Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5 (Vidéo) | JoVE Journal

Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5

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