Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5

L'objectif général de ce protocole est de montrer comment générer efficacement des cardiomyocytes induits à partir de fibroblastes cardiaques à l'aide d'un construct poly cyonique MGT, exprimant un ratio optimal de GATA4, F2C et TBX5. Cette méthode fournit une plateforme précieuse pour la recherche sur les cardiomyocytes induits et facilitera les criblages à haut débit ainsi que les études mécanistiques du reprogrammation en cardiomyocytes induits, tout en faisant progresser le domaine vers des applications cliniques. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'à l'aide d'un seul construct rétroviral, les fibroblastes cardiaques peuvent être convertis efficacement en cardiomyocytes.

Nettoyer la souris transgénique néonatale exprimant la chaîne lourde de la myosine alpha avec du GFP à l’aide d’éthanol à 75 % volume/volume. Procéder à l’euthanasie. Ensuite, ouvrir la cavité corporelle en effectuant une incision horizontale allant sous une aisselle à l’autre à l’aide d’une pince stérile, émoussée et recourbée.

Dissez le cœur et placez-le dans un puits d'une plaque 24 puits contenant de la glace. Du PBS froid, observez l'expression de la GFP dans tout le cœur à l'aide d'une microscopie à fluorescence. Placez trois à quatre cœurs positifs pour la GFP dans une boîte de culture de 60 millimètres à l’aide de pinces et de ciseaux stériles, puis hachez les cœurs en petits morceaux de moins d’un millimètre cube.

Transférez les cœurs hachés dans une boîte de culture de 10 centimètres et recouvrez-les de deux millilitres de milieu fiberblast ou milieu FB. Laissez les boîtes en incubation sans les perturber pendant au moins trois heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, ajoutez lentement huit millilitres de milieu FB préchauffé à la boîte contenant les tissus cardiaques hachés.

Ensuite, incuber le tissu sans perturbation, sauf pour changer le milieu tous les trois jours. Au septième jour, aspirer le milieu de culture et laver les cellules avec du DPBS. Ajouter trois millilitres de trips à 0,05 % dans du EDTA à chaque plaque et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ajoutez cinq millilitres de milieu FB pour désactiver la trypsine, puis détachez délicatement les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules. Ensuite, récupérez les cellules et filtrez-les à travers des tamis cellulaires de 40 microns afin d’éviter toute contamination par des fragments de tissu cardiaque. Faites tomber les cellules en culot par centrifugation à 200 × g pendant cinq minutes, en partant de cœurs de souris néonatales isolés.

Couper chaque cœur en quatre morceaux encore faiblement connectés. Transférer les cœurs dans un tube conique de 15 millilitres contenant huit millilitres de trypsine EDTA à 0,05 % tiède et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après l'incubation, éliminer la trypsine EDTA et ajouter cinq millilitres de collagénase de type II tiède ; vortexer pendant une minute à vitesse moyenne, puis incuber le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.

Ensuite, vortexer le tube pendant une minute. Laisser les morceaux de tissu se déposer et recueillir le surnageant dans un nouveau tube contenant cinq millilitres de milieu FB froid. Ajouter cinq millilitres de collagénase de type deux fraîche aux morceaux de tissu et répéter les étapes de vortex et d'incubation.

Combiner tous les surnageants contenant des cellules en les filtrant à travers un tamis cellulaire de 40 microns. Centrifuger ces cellules à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Suite à l'une des deux méthodes d'isolement des fibroblastes cardiaques.

Lavez le culot cellulaire final une fois avec 10 millilitres de tampon de tri magnétique activé par cellules ou de tampon max. Prélevez 10 microlitres pour le décompte des cellules viables et centrifugez les cellules restantes à 200 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour moins de 1 × 10⁷ cellules. Resuspendez le culot cellulaire avec 10 microlitres de microbilles magnétiques conjuguées à thigh 1.2 dans 90 microlitres de tampon max refroidi et mélangez.

Incuber correctement les billes à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour faire tomber les cellules en culot, ajouter 10 millilitres de tampon max et centrifuger les échantillons à 200 ×g pendant cinq minutes. Laver une fois avec 10 millilitres de tampon max et resuspendre le culot cellulaire dans un volume total de deux millilitres dans une hotte de culture cellulaire.

Installez un séparateur max et ajoutez une colonne LS. Équilibrez la colonne avec trois millilitres de tampon max. Faites passer la suspension cellulaire à travers la colonne LS et rincez trois fois avec deux millilitres de tampon max.

Ensuite, retirez la colonne LS du séparateur et éluerez trois fois avec deux millilitres de tampon max. Ramassez l'EIT dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez l'EIT à 200 × g pendant cinq minutes.

Ré-suspendez les fibroblastes isolés dans 10 millilitres de milieu FB et comptez les cellules ; ensemencez les cellules dans des boîtes de culture tissulaire à des densités appropriées dans une plaque 24 puits pré-enduite de gélatine pour reprogrammer les fibroblastes cardiaques. Ajoutez 500 microlitres de milieu de cardiomyocyte induit ou milieu ICM contenant du poly cerveau dans chaque puits de la plaque 24 puits contenant les cellules. Ajoutez 10 microlitres du rétrovirus dans chaque puits contenant les fibroblastes isolés.

Incuber la plaque avec les particules rétrovirales pendant 24 à 48 heures dans une étuve à culture cellulaire. Remplacer ensuite le milieu contenant le virus par 500 microlitres de milieu ICM frais, en changeant le milieu tous les deux à trois jours. Commencer la sélection positive des cellules transduites par le virus en complétant le milieu ICM avec deux microgrammes par millilitre de purémycine.

Après trois jours de sélection, changer le milieu pour une dose d'entretien d'un microgramme par millilitre de pur mycine afin de visualiser la conversion des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes. Observer les plaques sélectionnées avec la pur mycine pour l'expression de la GFP en utilisant un microscope inversé. Enfin, 14 jours après le traitement viral, remplacer le milieu ICM par le milieu B 27.

Des foyers cellulaires présentant un battement spontané modéré peuvent apparaître entre trois et quatre semaines après la transduction virale, avec l'expression de marqueurs cardiaques, notamment la troponine T cardiaque et l'alpha-actinine. Cette dernière peut être détectée par immunochimie entre le 10ᵉ et le 14ᵉ jour. Ici, l'expression de la troponine T cardiaque est observée dans les CMIs obtenus à partir de fibroblastes exprimant la GFP. L'expression de l'alpha-actinine dans les CMIs est visible ici.

L'analyse par cytométrie en flux montre des augmentations similaires de l'expression de la troponine T cardiaque, en particulier après la sélection par la puromycine des cardiomyocytes induits. La méthodologie décrite ici permet une génération efficace de cardiomyocytes induits basée sur la livraison rétrovirale de facteurs de transcription NGT au sein d'un seul construct.