Protocoles pour analyser le rôle des cellules de Paneth dans la régénération de l'intestin murin utilisant conditionnelle Cre-lox Modèles de souris

L’objectif global de cette procédure de dissection est de démontrer comment isoler et préparer l’intestin de souris pour les techniques de caractérisation ultérieures. Cette méthode pourrait être utilisée pour étudier la capacité des cellules souches intestinales à repeupler l’intestin à la suite d’une procédure expérimentale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée à la suite de n’importe quelle technique ou procédure ou après manipulation génétique. Utilisation de la technologie des serrures de cray Commencez par placer une souris adulte euthanasiée en position couchée et mouillez la fourrure avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, à l’aide de ciseaux, ouvrez la cavité intrapéritonéale longitudinalement le long de la ligne médiane et fixez l’estomac avec une pince. Ensuite, coupez la connexion à l’œsophage et tirez doucement sur l’estomac pour retirer l’intestin grêle jusqu’à l’appendice. Ensuite, tirez doucement sur l’appendice pour retirer le gros intestin jusqu’à l’anus.

Une fois que les intestins ont été isolés, retirez l’estomac de l’appendice et utilisez une seringue équipée d’une pointe de pipette à extrémité émoussée pour rincer les intestins avec du PBS immédiatement après le rinçage, coupez l’intestin en trois sections de taille égale, proximale, médiane et distale. Ensuite, coupez chaque section en morceaux d’un centimètre et placez trois à cinq fragments de tissu au milieu d’un morceau de ruban chirurgical de deux centimètres sur deux. Dans une formation pyramidale, lorsque tous les tissus ont été attachés, scellez le ruban autour des pièces longitudinalement pour créer un tas de bûches.

Ensuite, placez le ruban dans un récipient à fond plat contenant au moins 10 fois le volume de neutre, tamponné, formel et fixateur par rapport au volume de tissu, et stockez les échantillons à quatre degrés Celsius avant de les enrober et de les sectionner. Après la fixation, transférez le tissu dans un récipient à fond plat contenant au moins 10 fois le volume d’éthanol à 70 % du volume de tissu pour fixer le tissu dans Metcon immédiatement après le rinçage. Coupez l’intestin en trois sections de taille égale comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, placez chaque section côte à côte sur un morceau de papier filtre de 15 x 15 centimètres et utilisez des ciseaux à arc à ressort pour ouvrir les sections sur FOSS lorsque toutes les sections ont été divisées. Transférez le papier filtre dans un plat en verre contenant du Metcon fraîchement préparé pendant trois à 24 heures à température ambiante à la fin de la fixation, utilisez une pince pour ramasser l’extrémité de chacun des morceaux d’intestin un par un et enroulez les tissus autour de la pince pour former des rouleaux suisses individuels. Fixez chaque rouleau en ouvrant légèrement la pince et en insérant une aiguille de calibre 25 dans le tissu.

Ensuite, placez les mouchoirs roulés dans un récipient à fond plat contenant au moins 10 fois le volume de la formule tamponnée neutre et fixatrice que les mouchoirs pendant au moins une heure avant de traiter pour une visualisation complète du monticule lâche de l’éclatement tissulaire. Versez de la cire brute fondue mélangée à de l’huile minérale dans des boîtes de Pétri de 15 centimètres. Ensuite, immédiatement après avoir rincé les intestins avec du PBS glacé, rincez les tissus avec 25 millilitres de fixateur glacé hors calc

Après la fixation, coupez les intestins en trois à cinq sections égales et placez chaque section sur l’une des plaques de cire refroidies. Épinglez chaque extrémité de manière à ce que les sections soient légèrement étirées avec les lignes mésentériques au sommet des plaques. Coupez tout excès de mésentère.

Ensuite, utilisez des ciseaux à arc à ressort pour couper les boyaux longitudinalement, en les épinglant lorsqu’ils sont ouverts lorsque toutes les sections ont été épinglées. Inondez les plaques avec suffisamment de fixateur xal pour couvrir tous les tissus après au moins une heure à quatre degrés Celsius. Utilisez une pipette de 25 millilitres ou une seringue pour retirer le fixateur et lavez les mouchoirs une fois avec 30 millilitres de PBS.

Recouvrez ensuite les sections de 30 millilitres de solution unifiante DTTD pour une incubation de 30 à 60 minutes à température ambiante avec balancement. À la fin de l’incubation, retirez la solution déifiante à l’aide d’une pipette ou d’une seringue de 25 millilitres et inondez les tissus avec 30 millilitres supplémentaires de PBS. Ensuite, utilisez une pipette postérieure pour retirer le mucus avec le PBS après le lavage.

Remplacez le PBS par 30 millilitres de xal pour une coloration de nuit à température ambiante dans l’obscurité avec une légère agitation sur une plate-forme à bascule le lendemain matin. Si les sections ont développé une tache bleu-vert, remplacez le xal par 30 millilitres de PBS. Après trois minutes d’agitation douce, faites des rouleaux suisses comme nous venons de le démontrer et placez les mouchoirs dans un récipient à large ouverture et à fond plat contenant au moins 10 fois le volume de fixateur approprié que le volume de tissu à quatre degrés Celsius pendant au moins 24 heures avant l’enrobage et la section.

À l’aide du rapporteur conditionnel ROSA 26 R Laxy, une recombinaison à 100 % peut être observée trois jours après l’induction dans l’intestin grêle à l’aide de l’ADN extrait des berceaux recombinés. La QPCR pour les allèles recombinés a démontré une augmentation non significative de la recombinaison dans le système de pli VI, potentiellement due à la recombinaison dans les cellules de paneth non observée. En utilisant le système de pliage à l’aide du rapporteur laxy, les deux systèmes ont également démontré une perte complète de cellules recombinées trois jours après l’induction.

Les données sur la mitose et la hauteur cellulaire de la crypte K indiquaient que le système ah H Cree pouvait se rétablir, probablement en raison du repeuplement par des cellules souches intestinales non combinées. À l’opposé, le méchant Cree n’a pas réussi à se rétablir malgré la conservation des cellules de la crypte épithéliale. De plus, les cellules cryptiques des souris floquées vi Cree Cantin B étaient non prolifératives et manquaient d’expression du marqueur des cellules souches intestinales.

EM quatre. Contrairement aux cryptes des souris ah cre, les cellules PTH n’ont subi d’apoptose après la délétion de Caden b que dans le système VI Cree. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en 10 minutes environ.

Il est important de minimiser les délais pour éviter la dégradation des tissus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de retirer l’intestin d’une souris pour une analyse en aval.