Name: Développement dune bande de test immunochromatographique à base dor colloïdal pour la détection des Cétacés myoglobine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Découvrez le développement d'une bandelette immunochromatographique à or colloïdal pour détecter la myoglobine des cétacés. Cette méthode rapide permet un dépistage sur le terrain en 5 à 10 minutes.

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Nous remercions les collègues de la Société des cétacés de Taïwan, du Centre de biologie marine et de recherche sur les cétacés de l’Université nationale de Cheng Kung, du Farglory Ocean Park et du Centre de diagnostic des maladies animales de l’Université nationale de Chiayi pour la collecte d’échantillons. Ce projet a été financé par une subvention accordée à WCY par le Conseil de l’agriculture de Taïwan (100AS-02.1-FB99).

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

En utilisant un peptide synthétique conjugué à la protéine porteuse est remarquablement plus efficace par rapport à sa protéine apparentée. Pour une technique fondée sandwich, parce que l&#39;anticorps monoclonal est développé en utilisant des épitopes avec des emplacements relatifs connus, les deux mAb dans cette étude ne sont pas susceptibles d&#39;interférer avec l&#39;interaction mutuelle avec l&#39;épitope de l&#39;antigène cible. En outre, la réactivité entre la protéine native et l&#39;anticorps de souris immunis...

Historiquement, la viande de cétacé a été consommée dans de nombreuses régions du monde et cette consommation continue aujourd’hui1. En raison du niveau trophique des cétacés, on sait que des niveaux élevés de mercure et d’autres toxines sont présents dans leur viande2. Par conséquent, la consommation de viande de cétacé pourrait entraîner un problème de santé non seulement pour les groupes à haut risque tels que les femmes enceintes, mais aussi pour la population générale3. En outre, la contamination de la viande de cétacé par des agents pathogènes zoonotiques ou potentiellement zoonotiques peut également se produire lors de sa transformation et de son stockage4. Il est difficile, même pour des agents expérimentés, d’identifier les viandes de cétacés par leur seule apparence. Par conséquent, une méthode d’identification scientifique fiable est nécessaire pour différencier la viande de cétacé des autres viandes. Cela permettrait de limiter la consommation de viande de cétacés.
Les méthodes actuelles d’identification des espèces comprennent des techniques moléculaires et des méthodes immunologiques. Les techniques moléculaires, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et le séquençage de l’ADN, peuvent être utilisées pour identifier des échantillons non seulement de viande crue5 et d’échantillons décomposés6, mais aussi d’aliments transformés tels que les saucisses cuites et les aliments pour animaux7,8. Les méthodes immunologiques, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA), sont couramment utilisées dans la production alimentaire pour détecter la teneur en viande, par exemple, du porc9, du bœuf10 et du poisson-chat11. L’analyse de l’ADN par PCR pour l’identification de la viande de cétacé est disponible12 et a contribué à prévenir le commerce international illégal de viande de cétacé au Japon, en Corée du Sud, aux Philippines, à Taïwan, à Hong Kong, en Russie, en Norvège et aux États-Unis1. Ces méthodes sont efficaces et fiables, mais elles peuvent prendre des heures ou des jours et impliquer des étapes laborieuses. L’identification de la viande des cétacés est généralement basée sur des techniques moléculaires et il n’existe actuellement aucune méthode immunologique. Pour les organismes de réglementation, il est hautement souhaitable de mettre au point une technique fiable et rapide qui puisse être utilisée sur le terrain pour identifier les viandes de cétacés. 
Les bandelettes immunochromatographiques sont utilisées comme outils de détection avec l’avantage de produire un résultat rapide via un protocole simple et adapté à une utilisation sur le terrain. Les principes de la bandelette immunochromatographique et de l’ELISA sont très similaires et comprennent des anticorps, des antigènes et des marquages. De nombreux marqueurs différents tels que l’or colloïdal, le carbone et le latex ont été utilisés dans le développement de bandes immunochromatographiques. À l’heure actuelle, cette méthode est couramment utilisée pour détecter les antibiotiques, les toxines, les bactéries et les virus13, mais elle est rarement utilisée pour identifier les protéines dans la viande14,15. Ici, nous proposons un dosage immunoenzymatique par chromatographie à flux latéral pour la détection rapide de la myoglobine (Mb) des cétacés.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Protéine G HP SpinTrap&nbsp ;</td><td>GE&nbsp ; Healthcare</td><td>28-9031-34</td><td>Colonne de spin contenant la protéine G Sepharose</td></tr><tr><td>IsoStrip Kit d’isotypage d’anticorps monoclonaux de souris</td><td>Roche</td><td>11493027001</td><td>Strips d’isotypage, pré-enrobés d’anticorps anti-Ig de souris spécifiques à la sous-classe et à la chaîne légère</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps solution bloquante&nbsp ;</td><td>LTK BioLaboratories</td><td></td><td>Pour minimiser les interactions de liaison non spécifiques des IgG non spécifiques dans les échantillons</td></tr><tr><td>substrat de la phosphatase BCIP/NBT.</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de protéines HRP Microwell Kit, Anti-souris</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Immunoplate MaxiSorp Plaque ELISA Thermo</td><td>&nbsp ; Fisher Scientific</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan&nbsp ; Lecteur EX ELISA&nbsp ;</td><td>Thermo&nbsp ; Électron&nbsp ; Solution</td><td>d’or</td> colloïdal (40 nm) de Corporation 51118170 <td></td></tr><tr><td></td><td>REGA biotechnologie inc.</td><td></td><td>40-50 nm est approprié pour l’immunostrip</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr><tr><td>Test rapide imprimante immno-strip</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td>AGISMART RP-1000&nbsp ;</td><td>Convient uniquement à la production à petite échelle d’immunostrips à des fins de recherche et développement</td></tr><tr><td>Composants de bande (membranes CN, tampons d’échantillons (verre #33, S& S), coussinets conjugués (#16S, S& S) et des tampons absorbants (CF6, Whatman))</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund' s adjuvant et incomplet Freund' s adjuvant&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881, F5506</td><td>Utilisé pour produire des émulsions eau-dans-huile d’immunogènes</td></tr><tr><td>Acrylamide, tampon de gel, persulfate d’ammonium (APS), tétraméthyléthylènediamine (TEMED)&nbsp ;</td><td>Préparation de gel Protech</td><td></td><td>pour SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Coomassie bleu brillant R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td>Coloration des protéines dans les gels SDS-PAGE</td></tr><tr>,<td>le tampon d’échantillon Laemmli et le 1610737 de &bêta ;-mercaptoéthanol</td><td>Bio-Rad</td><td>, 1610710</td><td>Diluer les échantillons de protéines avant le chargement sur les gels SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

développement d&#39;une bande de test immunochromatographique à base d&#39;or colloïdal pour la détection des cétacés myoglobine

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Ce protocole décrit le développement d’une bandelette de test immunochromatographique en or colloïdal basée sur le format sandwich qui peut être utilisée pour différencier la myoglobine (Mb) des cétacés de celle des phoques et d’autres animaux. La bande permet un dépistage rapide et sur place de la viande de cétacés, limitant ainsi son commerce et sa consommation illégaux. Deux anticorps monoclonaux (mAbs) ayant une réactivité envers le Mb des cétacés ont été développés. Les séquences d’acides aminés des régions réactives antigéniques Mb de divers animaux ont été analysées afin de concevoir deux peptides synthétiques (un peptide général et un peptide spécifique) et d’élever ensuite les mAbs (sous-classe IgG1). Les anticorps monoclonaux ont été sélectionnés à partir d’hybridomes criblés par ELISA indirect, western blot et dot blot. CGF5H9 était spécifique aux Mbs des lapins, des chiens, des porcs, des vaches, des chèvres et des cétacés, tandis qu’il montrait une faible ou aucune affinité avec les Mbs des poulets, des thons et des phoques. CSF1H13 peut lier les phoques et les cétacés avec une forte affinité, mais n’a montré aucune affinité avec d’autres animaux. Des échantillons de cétacés de quatre familles (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae et Kogiidae) ont été utilisés dans cette étude, et les résultats ont indiqué que ces deux anticorps monoclonaux ont une large capacité de liaison aux MBS de différents cétacés. Ces anticorps monochimiques ont été appliqués sur une bandelette de test immunochromatographique d’or colloïdal de type sandwich. CGF5H9, qui reconnaît de nombreuses espèces, a été marqué à l’or par des colloïdes et utilisé comme anticorps de détection. CSF1H13, qui a été enduit sur la zone d’essai, a détecté la présence de Mbs de cétacés et de phoques. Des échantillons de muscles de thon, de poulet, de phoque, de cinq espèces de mammifères terrestres et de 15 espèces de cétacés ont été testés en trois exemplaires. Tous les échantillons de cétacés ont montré des résultats positifs et tous les autres échantillons ont montré des résultats négatifs.

Caractéristiques des anticorps monoclonaux Nous avons développé deux IgG 1 mAb (CGF5H9 et CSF1H13) reconnaissant deux peptides synthétiques (MKASEDLKKHGNTVLC et AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivement, de cétacé Mb, et ceux - ci ont été utilisés pour construire un or colloïdal bande de test immunochromatographique de type sandwich pour la détection rapide de Mb cétacé. la figure 2 montre que CGF5H9 détecte cétacés et autres mammifères c...

Ce protocole décrit le développement de deux anticorps monoclonaux (mAbs) de classe IgG fortement réactifs à la myoglobine des cétacés. Ces anticorps monoclonaux sont appliqués sur une bandelette de test immunochromatographique en or colloïdal basée sur le format sandwich pour différencier le Mb des cétacés des phoques et d’autres animaux.

Développement d&#39;une bande de test immunochromatographique à base d&#39;or colloïdal pour la détection des Cétacés myoglobine

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

L'objectif général de cette bandelette de test immunochromatographique à base d'or colloïdal est de différencier la myoglobine des cétacés de celle des phoques et d'autres animaux. Cette méthode permet un dépistage rapide et sur place de la viande de cétacé, contribuant ainsi à limiter son commerce et sa consommation illégaux. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'un résultat positif peut être observé directement cinq à dix minutes après homogénéisation de 0,3 gramme de muscle, avec une spécificité et une sensibilité remarquables.Ainsi, cette méthode peut permettre une détection rapide de la viande de cétacé sur le terrain. Elle peut également être appliquée à d'autres viandes, telles que la viande de cheval ou de porc. Pour concevoir des peptides synthétiques destinés à produire des anticorps monoclonaux réactifs contre la myoglobine des cétacés, les séquences d'acides aminés des régions antigéniques réactives de la myoglobine provenant de divers animaux sont analysées.Commencez par récupérer dans GenBank les séquences d'acides aminés de la myoglobine provenant du thon, du poulet, de l'autruche, de mammifères domestiques, du phoque et de 18 espèces de cétacés. Ensuite, alignez les séquences à l'aide du logiciel approprié. Lancez l'Alignment Explorer en sélectionnant Aligner Éditer/Construire un alignement dans la barre de lancement.Sélectionnez Créer un nouvel alignement, puis cliquez sur OK. Une fenêtre de dialogue apparaîtra avec la question suivante : créez-vous un alignement de séquence ADN ou protéique ? Cliquez sur le bouton intitulé Protéine, sélectionnez Données Ouvrir Récupérer les séquences à partir d'un fichier, puis sélectionnez le fichier de séquences. Sélectionnez la commande de menu Édition Tout sélectionner pour choisir tous les sites de chaque séquence du jeu de données afin de créer un alignement multiple de séquences.Sélectionnez l'option Alignement Aligner par ClustalW dans le menu principal. Choisissez BLOSUM comme matrice de pondération des protéines, puis cliquez sur le bouton OK. La troisième étape consiste à analyser l'alignement des séquences.Se concentrer sur cinq sites réactifs antigéniques et identifier le fragment conservé parmi les cétacés. Un astérisque symbolise la consensus dans l'alignement et indique une position possédant un seul résidu entièrement conservé. Deux fragments conservés chez les cétacés ont été identifiés.Des fragments de séquence candidats sont ensuite synthétisés et utilisés pour produire des anticorps monoclonaux. Commencez cette procédure en déterminant le pH optimal de la solution d'or colloïdal, défini comme le pH minimum permettant au mélange d'anticorps monoclonal et de solution d'or colloïdal de rester rouge pendant deux heures. Ajoutez 0,15 microgramme d'anticorps monoclonal de détection purifié à 100 microlitres de solution d'or colloïdal dont les valeurs de pH varient de cinq à neuf.Pour les besoins de cette démonstration, les pH six et huit sont testés. Le pH huit a été considéré comme le pH optimal lors de cette étape d'optimisation. Ensuite, déterminez la concentration optimale de l'anticorps monoclonal en ajoutant différentes quantités d'anticorps monoclonal de détection purifié à 100 microlitres de solution colloïdale d'or à pH huit.La concentration optimale, qui est de six microgrammes par millilitre dans cette étude, maintiendra la couleur rouge du mélange sans précipité noir. En se basant sur les résultats des étapes d'optimisation, ajouter goutte à goutte 60 microgrammes d'anticorps monoclonal de détection purifié à 10 mL de solution d'or colloïdal. Émulsionner doucement le mélange à température ambiante pendant dix minutes.Ajoutez deux millilitres d'une solution de BSA à 5 % dans du PBS au mélange et émulsifiez délicatement à température ambiante pendant 15 minutes afin de réduire les interférences de fond. Centrifugez le mélange à 10 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant contenant l'anticorps non conjugué et resuspendez le culot obtenu dans 4 mL de PBS-T contenant 1 % de BSA et 0,1 % de Tween-20.Répétez la centrifugation et la suspension une ou deux fois. Suspendez les précipités finaux dans 1 mL de PBS-T et conservez à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Un schéma du dispositif de bandelette immuno-réactive est présenté ici.Les dimensions du carton, des tampons et de la membrane en nitrocellulose sont indiquées dans le texte du protocole. Pour prolonger la durée de conservation, les bandes immunologiques doivent être préparées et assemblées dans un environnement de laboratoire à faible humidité. Utilisez une micropipette pour ajouter la solution d'anticorps monoclonal marquée à l'or colloïdal sur le tampon de conjugué afin de le saturer, puis faites sécher le tampon à 37 degrés Celsius pendant une heure avant l'assemblage.Une fois que le tampon de conjugaison est sec, utilisez du ruban adhésif double face pour fixer d'abord la membrane en nitrocellulose sur le carton. À l’aide d’une imprimante à bandelettes immunologiques, déposez l’anticorps monoclonal spécifique de capture de l’antigène sur la zone de test et l’anti-souris IGG rapide sur la zone de contrôle, respectivement, sur la membrane en nitrocellulose. Maintenez une distance supérieure à cinq millimètres entre les deux zones.Ensuite, fixez le tampon de conjugaison sur un côté de la membrane en nitrocellulose, et le tampon absorbant sur l'autre côté, en faisant chevaucher les tampons de chaque côté d'environ deux millimètres. Placez le tampon d'échantillonnage par-dessus le tampon de conjugaison de deux millimètres et fixez-le sur le carton. Utilisez un coupe-papier pour créer des bandes de six millimètres de large.Placer les bandes dans un sachet en aluminium avec un dessicant et conserver à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Pour préparer un échantillon destiné au test de réactivité croisée, ajouter 1 mL de PBS contenant 0,1 % de BSA à 0,03 gramme de muscle cru. Utiliser ensuite un bâtonnet en bambou ou une tige de broyage pour homogénéiser l'échantillon.Tenez la bandelette immunoanalytique par l'extrémité opposée à la zone de test et immergez la partie du tampon d'échantillonnage dans l'échantillon pendant cinq à dix minutes. Observez directement le résultat. Testez divers échantillons musculaires en triplicat.La ligne de test T est conçue pour afficher un signal positif lorsque les deux anticorps monoclonaux détectent la myoglobine de cétacés. Comme la myoglobine provenant d'animaux non-cétacés ne peut être détectée que par l'un de ces deux anticorps monoclonaux, la ligne de test affiche un résultat négatif lorsque des échantillons musculaires d'autres animaux sont analysés. La ligne de contrôle C doit toujours afficher un résultat positif, car l'anticorps anti-IgG de souris rapide fixe l'anticorps de détection marqué au colloïde d'or.Un résultat négatif sur la ligne de contrôle indique une mauvaise qualité des matériaux présents sur la bande. L'analyse sanguine par western blot à l'aide de surnageants d'hybridomes montre que l'anticorps monoclonal CGF5H9 détecte les cétacés et d'autres mammifères sous forme d'une seule bande colorée à un poids moléculaire prédit d'environ 17 kDa. La baleine commune (Minke) présente une bande relativement plus faible que celle des autres cétacés.Absence de bandes pour le thon, le phoque et le poulet. Une bande d'environ 50 kDa est en revanche observée pour le porc. Des résultats identiques sont obtenus par analyse sanguine en point.Bien que l'analyse sanguine par Western blot utilisant l'anticorps monoclonal CSF1H13 montre plusieurs bandes non spécifiques chez le porc et le thon, le CSF1H13 est hautement spécifique car il réagit uniquement avec les cétacés. De plus, le phoque présente une bande au poids moléculaire prédit d’environ 17 kDa. Des résultats identiques sont obtenus par analyse sanguine en point (dot blot).Les résultats du ELISA indirect réalisé sur des extraits musculaires de différentes espèces à l'aide de CGF5H9 purifié montrent des signaux positifs pour le bœuf, la chèvre, le chien, le lapin et les cétacés, un signal faiblement positif pour le porc, et des signaux négatifs pour le thon, le poulet et le phoque. CSF1H13 présente une forte affinité envers les cétacés et les phoques. Les deux anticorps monoclonaux réagissent fortement avec les quatre espèces de cétacés appartenant à différentes familles, indiquant leur réactivité étendue vis-à-vis de diverses espèces de cétacés.La spécificité de la bandelette immunologique au colloïde d'or est illustrée par ces résultats représentatifs. L'utilisation d'échantillons musculaires non issus de cétacés donne lieu à une seule bande au niveau de la ligne de contrôle. En revanche, lorsque des échantillons musculaires de cétacés sont utilisés, des bandes de signal apparaissent à la fois sur la ligne de test et sur la ligne de contrôle.Une fois maîtrisée, la préparation des anticorps marqués et la fabrication de ces bandes peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de concevoir soigneusement le peptide. Utilisez plusieurs méthodes pour sélectionner des anticorps monoclonaux appropriés.Et utilisez une colloïde d'or de haute qualité pour préparer les anticorps marqués. Après avoir suivi ces procédures, d'autres méthodes, telles que l'analyse d'ADN par PCR, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'espèce de cétacé et son origine. L'anticorps monoclonal CSF1H13, qui est puissant et présente une affinité spécifique uniquement envers les mammifères marins, peut être utilisé dans divers formats de ELISA, offrant ainsi de nombreuses autres possibilités pour étudier les aspects biologiques, physiologiques et chimiques de la myoglobine chez les mammifères marins.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de développer des anticorps monoclonaux spécifiques et de les appliquer par la suite sur une bandelette de test rapide.

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