Développement d'une bande de test immunochromatographique à base d'or colloïdal pour la détection des Cétacés myoglobine

L’objectif global de cette bandelette de test immunochromatographique en or colloïdal est de différencier la myoglobine des cétacés de celle des phoques et d’autres animaux. Cette méthode permet un dépistage rapide et sur place de la viande de cétacés, limitant ainsi son commerce et sa consommation illégaux. Le principal avantage de cette technique est qu’un résultat réussi peut être observé directement en cinq à dix minutes après homogénéisation de 03 grammes de muscle, avec une spécificité et une sensibilité exceptionnelles.

Cette méthode permet donc de détecter rapidement la viande de cétacé sur le terrain. Il peut également être appliqué à d’autres viandes telles que la viande de cheval ou le porc. Pour concevoir des peptides synthétiques permettant de lever des anticorps monoclonaux avec une réactivité envers la myoglobine des cétacés, les séquences d’acides aminés des régions réactives antigéniques de la myoglobine de divers animaux sont analysées.

Commencez par récupérer à partir de GenBank les séquences d’acides aminés de la myoglobine du thon, du poulet, de l’autruche, des mammifères domestiques, du phoque et de 18 espèces de cétacés. Ensuite, alignez les séquences à l’aide du logiciel approprié. Lancez l’explorateur d’alignement en sélectionnant l’option Aligner, modifier/construire l’alignement dans la barre de lancement.

Sélectionnez Créer un alignement, puis cliquez sur OK. Une boîte de dialogue s’affichera vous demandant si vous construisez un alignement de séquence d’ADN ou de protéine. Cliquez sur le bouton Protein, sélectionnez Data Open Retrieve sequences from File (Ouvrir les données) Récupérer les séquences à partir du fichier, puis sélectionnez Fichier de séquence. Sélectionnez la commande de menu Modifier tout pour sélectionner tous les sites pour chaque séquence de l’ensemble de données afin de créer un alignement de plusieurs séquences.

Sélectionnez Alignement Aligner par ClustalW dans le menu principal. Sélectionnez BLOSUM comme matrice de poids des protéines, puis cliquez sur le bouton OK. La troisième étape consiste à analyser l’alignement de la séquence.

Concentrez-vous sur cinq sites réactifs antigéniques et trouvez le fragment conservé parmi les cétacés. Un astérisque symbolise le consensus dans l’alignement et indique une position qui a un seul résidu entièrement conservé. Deux fragments conservés chez des cétacés ont été trouvés.

Des fragments de séquence candidats sont ensuite synthétisés et utilisés pour élever des anticorps monoclonaux. Commencez cette procédure en déterminant le pH optimal pour la solution d’or colloïdal, défini comme le pH minimum qui maintient le mélange d’anticorps monoclonaux et de solution d’or colloïdal de couleur rouge pendant deux heures. Ajoutez 0,15 microgramme d’anticorps monoclonal purifié à 100 microlitres de solution d’or colloïdal avec des valeurs de pH variant de cinq à neuf.

Pour les besoins de cette démonstration, le pH six et le pH huit sont testés. Le pH huit a été considéré comme le pH optimal par cette étape d’optimisation. Ensuite, déterminez la concentration optimale de l’anticorps monoclonal en ajoutant différentes quantités d’anticorps monoclonaux de détection purifiés à 100 microlitres de solution d’or colloïdal à pH huit.

La concentration optimale, qui est de six microgrammes par millilitre dans cette étude, maintiendra la couleur du mélange rouge sans précipité noir. Sur la base des résultats des étapes d’optimisation, ajouter 60 microgrammes d’anticorps monoclonaux de détection purifiés goutte à goutte à 10 ml de solution d’or colloïdal. Émulsionnez doucement le mélange à température ambiante pendant une dizaine de minutes.

Ajoutez deux millilitres d’une solution de PBS à 5 % BSA au mélange et émulsionnez doucement à température ambiante pendant 15 minutes pour réduire les interférences de fond. Centrifugez le mélange à 10 000 fois g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirer soigneusement le surnageant contenant l’anticorps non conjugué et suspendre la pastille obtenue dans 4 ml de PBS-T contenant 1 % BSA et 0,1 % de Tween-20.

Répétez la centrifugation et la suspension une ou deux fois. Suspendre les précipités finaux dans 1 mL de PBS-T et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Un graphique de la conception de la bande immunitaire est présenté ici.

Les dimensions du carton, des tampons et de la membrane de nitrocellulose sont indiquées dans le texte du protocole. Pour prolonger la durée de conservation, les bandelettes immunitaires doivent être préparées et assemblées dans un environnement de laboratoire à faible humidité. À l’aide d’une micropipette, ajoutez la solution d’anticorps monoclonaux colloïdales marqués à l’or dans le tampon conjugué pour le saturer, puis séchez le tampon à 37 degrés Celsius pendant une heure avant de l’assembler.

Une fois que le tampon conjugué est sec, utilisez du ruban adhésif double face pour coller d’abord la membrane de nitrocellulose sur le carton. À l’aide d’une imprimante à immunobandes, répartissez l’anticorps monoclonal spécifique capturant l’antigène et l’IGG anti-souris rapide sur la zone de test et la zone de contrôle, respectivement, sur la membrane de nitrocellulose. Maintenez une distance de plus de cinq millimètres entre les deux zones.

Collez ensuite le tampon conjugué d’un côté de la membrane de nitrocellulose et le tampon absorbant de l’autre côté, en chevauchant les tampons de chaque côté d’environ deux millimètres. Placez le tampon d’échantillon sur le tampon conjugué de deux millimètres et collez-le sur le carton. Utilisez un coupe-papier pour créer des bandes de six millimètres de large.

Emballez les bandes dans un sac en papier d’aluminium avec dessicant et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour préparer un échantillon pour le test de réactivité croisée, ajoutez 1 ml de PBS contenant 0,1 % de BSA à 0,03 gramme de muscle brut. Et utilisez un bâton de bambou ou une tige de broyage pour homogénéiser l’échantillon.

Tenez la bandelette immunitaire par l’extrémité opposée à la zone de test et trempez la partie du tampon d’échantillon dans l’échantillon pendant cinq à dix minutes. Observez directement le résultat. Testez plusieurs échantillons de muscle en trois exemplaires.

La ligne de test T est conçue pour montrer un signal positif lorsque les deux anticorps monoclonaux détectent la myoglobine des cétacés. Étant donné que la myoglobine provenant d’animaux non cétacés ne peut être détectée que par l’un de ces deux anticorps monoclonaux, la ligne de test montre un résultat négatif lorsque des échantillons musculaires d’autres animaux sont testés. La ligne de contrôle C doit toujours montrer un résultat positif car l’IGG anti-souris rapide se lie à l’anticorps de détection colloïdal marqué à l’or.

Un résultat négatif dans la ligne Contrôle indique que la qualité des matériaux sur la bande est médiocre. L’analyse sanguine occidentale utilisant des surnageants d’hybridomes montre que l’anticorps monoclonal CGF5H9 détecte les cétacés et autres mammifères sous la forme d’une seule bande colorée à une masse moléculaire prédite d’environ 17 kDa. Le petit rorqual commun présente une bande comparativement plus faible que les bandes des autres cétacés.

Les bagues sont absentes pour le thon, le phoque et le poulet. Alors qu’une bande d’environ 50 kDa est observée pour le porc. Des résultats identiques sont obtenus par l’analyse de sang par points.

Bien que l’analyse sanguine occidentale utilisant l’anticorps monoclonal CSF1H13 montre plusieurs bandes non spécifiques pour le porc et le thon, CSF1H13 est très spécifique car il ne réagit qu’avec les cétacés. Et le phoque a une bande à une masse moléculaire estimée d’environ 17 kDa. Des résultats identiques sont obtenus par l’analyse de sang par points.

Les résultats de l’ELISA indirect d’extraits musculaires de différentes espèces à l’aide de CGF5H9 purifié montrent des signaux positifs pour la vache, la chèvre, le chien, le lapin et les cétacés, un signal positif faible pour le porc et des signaux négatifs pour le thon, le poulet et le phoque. CSF1H13 montre une grande affinité pour les cétacés et les phoques. Les deux anticorps monoclonaux peuvent réagir fortement avec les quatre espèces de cétacés qui appartiennent à des familles différentes, ce qui indique leur grande réactivité à diverses espèces de cétacés.

La spécificité de la bande d’or colloïdale immunitaire est démontrée par ces résultats représentatifs. L’utilisation d’échantillons de muscles non cétacés permet d’obtenir une seule bande sur la ligne de contrôle. Cependant, lorsque des échantillons de muscles de cétacés sont utilisés, les bandes de signal sont présentes à la fois sur la ligne d’essai et sur la ligne de contrôle.

Une fois maîtrisée, la préparation des anticorps marqués et cette construction de bandelettes peuvent se faire en quatre heures si elle est bien réalisée. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de concevoir le peptide avec soin. Utilisez plusieurs méthodes pour dépister les anticorps monoclonaux appropriés.

Et utilisez une haute qualité d’or colloïdal pour préparer des anticorps marqués. Suite à ces procédures, d’autres méthodes telles que l’analyse de l’ADN basée sur la PCR peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l’espèce de cétacé et son origine. L’anticorps monoclonal CSF1H13, qui est fort et présente une affinité uniquement pour les mammifères marins, peut être utilisé dans divers formats d’ELISA qui offrent de nombreuses autres possibilités pour étudier les aspects biologiques, physiologiques et chimiques de la myoglobine chez les mammifères marins.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer des anticorps monoclonaux spécifiques et de les appliquer ensuite sur une bandelette de test rapide.