Name: Développement dune bande de test immunochromatographique à base dor colloïdal pour la détection des Cétacés myoglobine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Découvrez le développement d'une bandelette immunochromatographique à or colloïdal pour détecter la myoglobine des cétacés. Cette méthode rapide permet un dépistage sur le terrain en 5 à 10 minutes.

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Nous remercions les collègues de la Société des cétacés de Taïwan, du Centre de biologie marine et de recherche sur les cétacés de l’Université nationale de Cheng Kung, du Farglory Ocean Park et du Centre de diagnostic des maladies animales de l’Université nationale de Chiayi pour la collecte d’échantillons. Ce projet a été financé par une subvention accordée à WCY par le Conseil de l’agriculture de Taïwan (100AS-02.1-FB99).

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<li>Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoglobin+in+pelagic+small+cetaceans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myoglobin in pelagic small cetaceans.</a> J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

En utilisant un peptide synthétique conjugué à la protéine porteuse est remarquablement plus efficace par rapport à sa protéine apparentée. Pour une technique fondée sandwich, parce que l&#39;anticorps monoclonal est développé en utilisant des épitopes avec des emplacements relatifs connus, les deux mAb dans cette étude ne sont pas susceptibles d&#39;interférer avec l&#39;interaction mutuelle avec l&#39;épitope de l&#39;antigène cible. En outre, la réactivité entre la protéine native et l&#39;anticorps de souris immunis...

Historiquement, la viande de cétacé a été consommée dans de nombreuses régions du monde et cette consommation continue aujourd’hui1. En raison du niveau trophique des cétacés, on sait que des niveaux élevés de mercure et d’autres toxines sont présents dans leur viande2. Par conséquent, la consommation de viande de cétacé pourrait entraîner un problème de santé non seulement pour les groupes à haut risque tels que les femmes enceintes, mais aussi pour la population générale3. En outre, la contamination de la viande de cétacé par des agents pathogènes zoonotiques ou potentiellement zoonotiques peut également se produire lors de sa transformation et de son stockage4. Il est difficile, même pour des agents expérimentés, d’identifier les viandes de cétacés par leur seule apparence. Par conséquent, une méthode d’identification scientifique fiable est nécessaire pour différencier la viande de cétacé des autres viandes. Cela permettrait de limiter la consommation de viande de cétacés.
Les méthodes actuelles d’identification des espèces comprennent des techniques moléculaires et des méthodes immunologiques. Les techniques moléculaires, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et le séquençage de l’ADN, peuvent être utilisées pour identifier des échantillons non seulement de viande crue5 et d’échantillons décomposés6, mais aussi d’aliments transformés tels que les saucisses cuites et les aliments pour animaux7,8. Les méthodes immunologiques, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA), sont couramment utilisées dans la production alimentaire pour détecter la teneur en viande, par exemple, du porc9, du bœuf10 et du poisson-chat11. L’analyse de l’ADN par PCR pour l’identification de la viande de cétacé est disponible12 et a contribué à prévenir le commerce international illégal de viande de cétacé au Japon, en Corée du Sud, aux Philippines, à Taïwan, à Hong Kong, en Russie, en Norvège et aux États-Unis1. Ces méthodes sont efficaces et fiables, mais elles peuvent prendre des heures ou des jours et impliquer des étapes laborieuses. L’identification de la viande des cétacés est généralement basée sur des techniques moléculaires et il n’existe actuellement aucune méthode immunologique. Pour les organismes de réglementation, il est hautement souhaitable de mettre au point une technique fiable et rapide qui puisse être utilisée sur le terrain pour identifier les viandes de cétacés. 
Les bandelettes immunochromatographiques sont utilisées comme outils de détection avec l’avantage de produire un résultat rapide via un protocole simple et adapté à une utilisation sur le terrain. Les principes de la bandelette immunochromatographique et de l’ELISA sont très similaires et comprennent des anticorps, des antigènes et des marquages. De nombreux marqueurs différents tels que l’or colloïdal, le carbone et le latex ont été utilisés dans le développement de bandes immunochromatographiques. À l’heure actuelle, cette méthode est couramment utilisée pour détecter les antibiotiques, les toxines, les bactéries et les virus13, mais elle est rarement utilisée pour identifier les protéines dans la viande14,15. Ici, nous proposons un dosage immunoenzymatique par chromatographie à flux latéral pour la détection rapide de la myoglobine (Mb) des cétacés.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Protéine G HP SpinTrap&nbsp ;</td><td>GE&nbsp ; Healthcare</td><td>28-9031-34</td><td>Colonne de spin contenant la protéine G Sepharose</td></tr><tr><td>IsoStrip Kit d’isotypage d’anticorps monoclonaux de souris</td><td>Roche</td><td>11493027001</td><td>Strips d’isotypage, pré-enrobés d’anticorps anti-Ig de souris spécifiques à la sous-classe et à la chaîne légère</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps solution bloquante&nbsp ;</td><td>LTK BioLaboratories</td><td></td><td>Pour minimiser les interactions de liaison non spécifiques des IgG non spécifiques dans les échantillons</td></tr><tr><td>substrat de la phosphatase BCIP/NBT.</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de protéines HRP Microwell Kit, Anti-souris</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Immunoplate MaxiSorp Plaque ELISA Thermo</td><td>&nbsp ; Fisher Scientific</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan&nbsp ; Lecteur EX ELISA&nbsp ;</td><td>Thermo&nbsp ; Électron&nbsp ; Solution</td><td>d’or</td> colloïdal (40 nm) de Corporation 51118170 <td></td></tr><tr><td></td><td>REGA biotechnologie inc.</td><td></td><td>40-50 nm est approprié pour l’immunostrip</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr><tr><td>Test rapide imprimante immno-strip</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td>AGISMART RP-1000&nbsp ;</td><td>Convient uniquement à la production à petite échelle d’immunostrips à des fins de recherche et développement</td></tr><tr><td>Composants de bande (membranes CN, tampons d’échantillons (verre #33, S& S), coussinets conjugués (#16S, S& S) et des tampons absorbants (CF6, Whatman))</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund' s adjuvant et incomplet Freund' s adjuvant&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881, F5506</td><td>Utilisé pour produire des émulsions eau-dans-huile d’immunogènes</td></tr><tr><td>Acrylamide, tampon de gel, persulfate d’ammonium (APS), tétraméthyléthylènediamine (TEMED)&nbsp ;</td><td>Préparation de gel Protech</td><td></td><td>pour SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Coomassie bleu brillant R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td>Coloration des protéines dans les gels SDS-PAGE</td></tr><tr>,<td>le tampon d’échantillon Laemmli et le 1610737 de &bêta ;-mercaptoéthanol</td><td>Bio-Rad</td><td>, 1610710</td><td>Diluer les échantillons de protéines avant le chargement sur les gels SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

développement d&#39;une bande de test immunochromatographique à base d&#39;or colloïdal pour la détection des cétacés myoglobine

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Ce protocole décrit le développement d’une bandelette de test immunochromatographique en or colloïdal basée sur le format sandwich qui peut être utilisée pour différencier la myoglobine (Mb) des cétacés de celle des phoques et d’autres animaux. La bande permet un dépistage rapide et sur place de la viande de cétacés, limitant ainsi son commerce et sa consommation illégaux. Deux anticorps monoclonaux (mAbs) ayant une réactivité envers le Mb des cétacés ont été développés. Les séquences d’acides aminés des régions réactives antigéniques Mb de divers animaux ont été analysées afin de concevoir deux peptides synthétiques (un peptide général et un peptide spécifique) et d’élever ensuite les mAbs (sous-classe IgG1). Les anticorps monoclonaux ont été sélectionnés à partir d’hybridomes criblés par ELISA indirect, western blot et dot blot. CGF5H9 était spécifique aux Mbs des lapins, des chiens, des porcs, des vaches, des chèvres et des cétacés, tandis qu’il montrait une faible ou aucune affinité avec les Mbs des poulets, des thons et des phoques. CSF1H13 peut lier les phoques et les cétacés avec une forte affinité, mais n’a montré aucune affinité avec d’autres animaux. Des échantillons de cétacés de quatre familles (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae et Kogiidae) ont été utilisés dans cette étude, et les résultats ont indiqué que ces deux anticorps monoclonaux ont une large capacité de liaison aux MBS de différents cétacés. Ces anticorps monochimiques ont été appliqués sur une bandelette de test immunochromatographique d’or colloïdal de type sandwich. CGF5H9, qui reconnaît de nombreuses espèces, a été marqué à l’or par des colloïdes et utilisé comme anticorps de détection. CSF1H13, qui a été enduit sur la zone d’essai, a détecté la présence de Mbs de cétacés et de phoques. Des échantillons de muscles de thon, de poulet, de phoque, de cinq espèces de mammifères terrestres et de 15 espèces de cétacés ont été testés en trois exemplaires. Tous les échantillons de cétacés ont montré des résultats positifs et tous les autres échantillons ont montré des résultats négatifs.

Caractéristiques des anticorps monoclonaux Nous avons développé deux IgG 1 mAb (CGF5H9 et CSF1H13) reconnaissant deux peptides synthétiques (MKASEDLKKHGNTVLC et AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivement, de cétacé Mb, et ceux - ci ont été utilisés pour construire un or colloïdal bande de test immunochromatographique de type sandwich pour la détection rapide de Mb cétacé. la figure 2 montre que CGF5H9 détecte cétacés et autres mammifères c...

Ce protocole décrit le développement de deux anticorps monoclonaux (mAbs) de classe IgG fortement réactifs à la myoglobine des cétacés. Ces anticorps monoclonaux sont appliqués sur une bandelette de test immunochromatographique en or colloïdal basée sur le format sandwich pour différencier le Mb des cétacés des phoques et d’autres animaux.

Développement d&#39;une bande de test immunochromatographique à base d&#39;or colloïdal pour la détection des Cétacés myoglobine

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

L'objectif général de cette bandelette de test immunochromatographique à base d'or colloïdal est de différencier la myoglobine des cétacés de celle des phoques et d'autres animaux. Cette méthode permet un dépistage rapide et sur place de la viande de cétacé, contribuant ainsi à limiter son commerce et sa consommation illégaux. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'un résultat positif peut être observé directement cinq à dix minutes après homogénéisation de 0,3 gramme de muscle, avec une spécificité et une sensibilité remarquables.Ainsi, cette méthode peut permettre une détection rapide de la viande de cétacé sur le terrain. Elle peut également être appliquée à d'autres viandes, telles que la viande de cheval ou de porc. Pour concevoir des peptides synthétiques destinés à produire des anticorps monoclonaux réactifs contre la myoglobine des cétacés, les séquences d'acides aminés des régions antigéniques réactives de la myoglobine provenant de divers animaux sont analysées.Commencez par récupérer dans GenBank les séquences d'acides aminés de la myoglobine provenant du thon, du poulet, de l'autruche, de mammifères domestiques, du phoque et de 18 espèces de cét

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