Name: Une méthode simple pour lextraction des échantillons deau automatisée en phase solide pour immunologique analyse des petits polluants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Découvrez une méthode automatisée d'extraction en phase solide pour pré-concentrer les polluants organiques dans les échantillons d'eau. Cette technique améliore l'analyse immunologique des micropolluants avec une faible consommation de solvant.

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Ce travail a été financé par le septième programme-cadre FP7/2007-2013 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 265721. Les auteurs remercient le RIKILT Institute for Food Safety (NL) pour son soutien dans ce projet.

Remarque: Le protocole suivant décrit la SPE effectué sur 100 ml d&#39;eau échantillon avec C18 sorbant et l&#39;élution avec 50% v / v de methanol. L&#39;échantillon enrichi est dilué pour atteindre 10% v / v de méthanol avant l&#39;analyse avec un immuno-enzymatique (ELISA) kit. 1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer les échantillons d&#39;eau <ol><li> Avant toute autre étape, filtrer chaque échantillon de 100 ml d&#39;eau avec des filtres de taille de 0,2 um des pores. </li><li> Addition de l&#39;échantillon avec une concentration souhaitée par dilution volume approprié de solution de référence dans un volume d&#39;eau. Par exemple, préparer 100 ml d&#39;échantillon d&#39;eau avec 100 ng / L de E2 par dilution de 3,3 ul de solution de référence E2 à une concentration de 300 ug / L. Diluer cette solution dix fois pour obtenir un échantillon enrichi avec 10 ng / L E2. Diluer celui-ci encore dix fois pour obtenir un échantillon de 100 ml à 1 ng / L E2. </li><li> Placer l&#39;échantillon filtré (non modifiée ou pointes) dans une bouteille en verre avec GFil L45. Utilisation de l&#39;échantillon sur le même jour. Prenez une petite fraction à analyser avec le test ELISA pour estimer la concentration initiale. </li></ol></li><li> Préparer 300 ul d&#39;éluant par dilution dans du methanol (di) de l&#39;eau désionisée à 50% v / v dans un tube étanche. </li></ol> 2. Préparation de la colonne SPE <ol><li> Préparer une 20 mg / ml de suspension les particules de sorbant octadécyl-silice en ajoutant 1600 ul de premiers méthanol puis 400 ul de di-eau à 40 mg d&#39;agent de sorption en phase inverse. Bien refermer le couvercle et agiter avec un vortex. </li><li> Installation de la membrane inférieure dans la colonne <ol><li> Sélectionnez une membrane en nylon avec la taille des pores 11 um et le placer sur une double couche de tissu anti-poussière. Avec un poinçon de diamètre 3 mm, couper deux petites pièces dans la membrane. </li><li> Prenez l&#39;une des petites membranes avec un plat de gamme pince de filtre et le placer sur un côté de la colonne. </li><li> Vissez le connecteur à fond plat avec le tube et serrer. La membrane est un groupe now en place et l&#39;adsorbant, peut être ajouté en toute sécurité. Dessiner une flèche sur le corps de la colonne pointant vers l&#39;extrémité où la membrane a été placée. </li></ol></li><li> Préparation de la colonne de sorbant emballé <ol><li> Fixer la colonne sur le support avec la flèche pointant vers le bas. La colonne doit être réglé le plus verticalement possible. </li><li> Fixer un vide de 10 ml seringue à usage unique à l&#39;extrémité du tube de la colonne, à l&#39;aide des connecteurs Luer-Lock. </li><li> Préparer une micro-pipette avec une pointe 20-200 pi, réglez le volume à 100 pi. Ce format d&#39;embout de pipette est adaptée à la taille de la colonne de sorbant à préparer. La procédure serait plus difficile avec de plus grandes pointes de pipettes, tels que ceux utilisés avec des pipettes de 1 ml. </li><li> Agiter la suspension de sorbant avec un vortex, et pipeter rapidement 100 pi dans le centre de la colonne. Tout en injectant, aspirer délicatement toute la solution pipetté cuvette de la membrane en utilisant la seringue avec l&#39;autre main. A ce stl&#39;âge, la solution de remplissage de la seringue doit être claire de particules, et un lit de particules peut éventuellement être observé dans la colonne. </li><li> Répétez ce processus 2 fois plus en agitant la suspension entre toutes les étapes de pipetage pour assurer suspension homogène des particules dans la solution. La colonne résultant contient 6 mg de sorbant. </li><li> Lorsque 300 ul de suspension ont été chargés et séché par aspiration avec la seringue, la seringue maintenir en position et placer la seconde membrane en nylon sur le dessus à l&#39;aide de la pince de l&#39;autre main. </li><li> Visser la deuxième connecteur avec tube et jetez la seringue. La colonne SPE est prêt à l&#39;emploi. </li></ol></li></ol> 3. Préparation du système <ol><li> Serrer la colonne SPE sur le dispositif en utilisant les luer-lock. La flèche doit pointer vers la même direction que celle indiquée sur l&#39;appareil. </li><li> Connectez la bouteille contenant l&#39;échantillon à l&#39;appareil en vissant lefourni bouchon de sécurité GL45 sur elle. </li><li> Chargez 200 pi d&#39;éluant dans le réservoir &#39;éluant. </li><li> Charge 800 pi de di-eau dans le réservoir »de dilution». </li><li> Placer une bouteille à la sortie de déchets pour recueillir l&#39;eau traitée lors de l&#39;étape d&#39;extraction. Le format n&#39;a pas d&#39;importance, mais le volume doit être suffisamment grand par rapport au volume de l&#39;échantillon. </li><li> Placer une petite fiole à la sortie du capteur avec la capacité du volume minimum de 1,5 ml. Un volume maximal de 1 ml sera trop petite que des bulles se forment à cette sortie lors de la collecte éluant enrichi et le tampon de dilution. </li><li> Vérifiez que le régulateur de pression est en position fermée en tournant manuellement, inversez-horaire jusqu&#39;à nouvel mouvement est pas possible. </li></ol> 4. SPE avec le Prototype <ol><li> Allumez le prototype en appuyant sur le bouton situé à l&#39;arrière. </li><li> Préparation de l&#39;interface utilisateur et en sélectionnant le programme <ol><li> Ouvrir l&#39;interface utilisateur. Sélectionnerle port de communication de l&#39;ordinateur auquel l&#39;appareil est connecté à partir de la liste, et cliquez sur le bouton &#39;Suivant&#39;. </li><li> Entrez les valeurs de 580 pour pset et 30 pour dpset. La pompe sera ajustée pour maintenir la pression dans le système sous pression et des réservoirs à 580 ± 30 mbar lors de l&#39;exécution. </li><li> Sélectionnez le mode automatisé. </li><li> Dans le coin en mode automatisé, charger le fichier de programme dans le &#39;chemin du fichier de configuration &quot;boîte. </li></ol></li><li> Réglage du régulateur de pression <ol><li> Démarrer la pompe. </li><li> Tournez manuellement le régulateur de pression jusqu&#39;à ce que la valeur lue pour preg est inférieure mais proche de 320 mbar. </li><li> Arrêtez la pompe. </li></ol></li><li> Démarrage de la procédure SPE <ol><li> Appuyez sur &#39;Start&#39; dans le coin en mode automatisé. La pompe se met en marche et de l&#39;extraction, élution et de dilution étapes sera automatiquement suivre un autre. L&#39;ensemble de la procédure pour un échantillon de 100 ml est réalisée en 50 min. </li><li>Vérifiez la valeur de preg. Il doit être dans la gamme de 320 à 350 mbar lors de l&#39;étape d&#39;extraction pour assurer un débit optimal. </li><li> Fermez le petit flacon et stocker à 4-5 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à l&#39;analyse. Effectuer l&#39;analyse dans le 30 heures suivantes afin d&#39;éviter la dégradation de l&#39;analyte. </li><li> Éliminer l&#39;eau traitée. </li></ol></li><li> Nettoyage du système Remarque: après chaque procédure d&#39;extraction a besoin le système à être nettoyée pour empêcher la contamination croisée. <ol><li> Préparer une solution à 10 ml de methanol à 70% v / v dans une bouteille en verre GL 45. </li><li> Débranchez la colonne SPE et branchez le tube avec connecteurs. </li><li> En mode automatique, sélectionnez le fichier «nettoyage» et démarrer avec les mêmes réglages de pression. </li></ol></li></ol> 5. La détection de la concentration d&#39;estradiol avec ELISA <ol><li> Préparer les échantillons d&#39;étalonnage ayant des concentrations comme indiqué dans le protocole fourni avec le kit ELISA qui est utilisé. Préparer un Calibration ensemble avec la même matrice que l&#39;échantillon, et un calibrage avec du méthanol à 10% v / v. </li><li> Verser la quantité nécessaire d&#39;échantillon dans les puits de la plaque, selon les instructions du fabricant. Utiliser des échantillons d&#39;étalonnage, les échantillons non modifiés et enrichis eau qui ont été filtrés mais pas traitées avec SPE, et enrichi des échantillons dans le méthanol à 10% v / v. Utilisez 3 puits par échantillon pour réduire l&#39;erreur associée à l&#39;essai. </li><li> Suivre les indications du protocole qui est fourni avec le kit de réactifs de l&#39;addition, le temps d&#39;incubation, le lavage et la réaction ultérieure avec l&#39;enzyme. </li><li> Lire le signal optique dans chaque puits selon les instructions du fabricant de la trousse avec un instrument de lecture de plaque et recueillir les données. </li><li> Utiliser le logiciel de l&#39;instrument de lecteur de plaque pour être compatibles avec les courbes d&#39;étalonnage et déterminer la concentration de E2 dans l&#39;échantillon initial avec la même matrice, et dans les échantillons enrichis avec du methanol 10% v / v. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un nouveau procédé pour la préparation d&#39;échantillons d&#39;eau suivie d&#39;une analyse immunologique utilisant a été proposé. L&#39;instrument permet d&#39;effectuer extraction en phase solide de manière automatisée et conviviale. La filtration de l&#39;échantillon d&#39;eau avant son injection dans le système est critique. Toutes les particules encore présentes dans la solution seraient potentiellement provoquer l&#39;obstruction du réseau fluidique et obstruer la colonne SPE. Une aut...

La préparation des échantillons est une étape importante dans tout processus analytique. En particulier, l&#39;élimination des effets de matrice, la diminution des interférences, et l&#39;enrichissement de l&#39;analyte sont nécessaires pour obtenir des résultats précis et d&#39;atteindre de faibles limites de détection. Perturbateurs endocriniens (PE) sont particulièrement préoccupantes en raison de leur action sur les organismes vivants, même si les niveaux actuels à de très faibles dans l&#39;environnement. L&#39;hormone naturelle 17β-estradiol est présent sur la pollution de l&#39;eau de l&#39;UE Watch List et sujettes à être ajouté à la liste des substances prioritaires réglementés en vertu de la directive-cadre européenne sur l&#39;eau. Extraction en phase solide (SPE) est couramment appliquée pour l&#39;analyse des petits polluants dans l&#39;eau, à la fois chimique 1-5 (chromatographie, spectrométrie de masse) et immunologiques 6-9 méthodes de détection. Ce dernier a gagné un intérêt dans le domaine de la surveillance de l&#39;environnement, comme les immunoessais sont disponibles en grande variété de formats, sont spécifiques à la TArget analyte, et d&#39;atteindre de faibles limites de détection. 6, 7, 10, 11 divers liés à une enzyme dosages immuno (ELISA) sont commercialement disponibles et permettent d&#39;analyser plusieurs échantillons à la fois sur une plaque multi-puits. La procédure consiste dans les étapes de réaction successives qui peuvent prendre quelques heures. Le produit final de réaction peut être détecté optiquement pour déterminer la concentration de la molécule cible sur la base d&#39;une courbe d&#39;étalonnage. SPE procédures classiques comprennent sorbant pré-conditionné, l&#39;extraction de l&#39;échantillon, le lavage, élution et concentration par évaporation de l&#39;éluant. Le solvant utilisé pour la dilution de cet extrait est choisie en fonction de la méthode de détection. Pour les méthodes immunologiques, la quantité d&#39;influences de solvants organiques fortement la sensibilité de la méthode. 12 En plus de la récupération et les performances de pré-concentration, la méthode doit également être simple et rentable. Automatisation de la procedure contribue à réduire les erreurs humaines liées. Dans nos travaux précédents 13 nous avons présenté notre prototype pour SPE automatisée, et de notre méthode a été appliquée à l&#39;analyse de l&#39;hormone naturelle 17β-estradiol dans des échantillons d&#39;eau de mer. Avec la présente vidéo, nous tenons à souligner les avantages techniques de notre méthode par rapport à hors ligne traditionnelle et en ligne SPE, et notamment sa compatibilité avec détection par immuno-réactions. Nous décrivons le protocole appliqué à des échantillons d&#39;eau pour la détection de 17β-estradiol. SPE est réalisée avec octadécyl-silice (C18) et phase de sorbant élution est réalisée avec du methanol dilué.

<table><tbody><tr><td>Membrane filtrante 0.2 &mu ; m taille des pores</td><td>Merck Millipore</td><td>GNWP04700</td><td>Pour la filtration des échantillons</td></tr><tr><td>Membrane en nylon 11 &mu ; m taille des pores</td><td>Merck Millipore</td><td>NY1104700</td><td>Pour colonne SPE</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie jetable 5 mm</td><td>Budget médical</td><td>39302439</td><td></td></tr><tr><td>Nucleodur C18 ec&nbsp ;</td><td>Macherey Nagel</td><td>713550.01</td><td>50 &mu ; m diamètre des particules</td></tr><tr><td>Eau de mer synthétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SSWS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17bêta-estradiol étalon</td><td>Enzo Life Science</td><td></td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>17bêta-estradiol ELISA kit</td><td>Enzo Life Science</td><td>ADI-900-008</td><td>96 puits, plage 30 - 3 000 ng/L</td></tr></tbody></table>

une méthode simple pour l&#39;extraction des échantillons d&#39;eau automatisée en phase solide pour immunologique analyse des petits polluants

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Une nouvelle méthode pour l&#39;extraction en phase solide (SPE) des échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement est proposé. Le prototype développé est rentable et conviviale, et permet d&#39;effectuer des SPE rapide, automatisée et simple. La solution de pré-concentré est compatible avec l&#39;analyse par immuno-essai, avec une faible teneur en solvant organique. Un procédé est décrit pour l&#39;extraction et la pré-concentration de l&#39;hormone naturelle 17β-oestradiol dans les échantillons d&#39;eau de 100. SPE en phase inverse est effectuée avec sorbant octadécyl-silice et l&#39;élution est effectuée avec 200 ul de methanol à 50% v / v. Eluant est dilué par addition de di-eau pour réduire la quantité de methanol. Après avoir préparé manuellement la colonne SPE, la procédure globale est effectuée automatiquement dans 1 h. A la fin du procédé, la concentration en estradiol est mesurée en utilisant un dosage immuno-sorbant lié à une enzyme du commerce (ELISA). Pré-concentration 100 fois et on obtient la teneur en méthanol dans seulement 10% v / v. Recouvrements complets de la moléculesont atteints avec 1 ng / L échantillons enrichis déminéralisée et synthétiques eau de mer.

La reproductibilité de la garniture de matière de sorption a été évaluée par séchage et pondérer le sorbant pipeté dans des flacons en verre et le résultat est montré sur la figure 1. La reproductibilité du moment de l&#39;injection a été testé pour 100 ml d&#39;échantillons, comme représenté sur la Figure 2. Concentration initiale et pré- concentré échantillons enrichis ont été déterminées en utilisant un kit ELISA commercial pour 17β-e...

Un protocole d’extraction et de pré-concentration d’œstradiol à partir d’échantillons d’eau à l’aide d’un système automatisé et miniaturisé est présenté.

Une méthode simple pour l&#39;extraction des échantillons d&#39;eau automatisée en phase solide pour immunologique analyse des petits polluants

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

L'objectif général de cette méthode de préparation d'échantillons est de préconcentrer de manière automatisée, conviviale et rentable les polluants organiques de petite taille présents dans des échantillons d'eau. Cette méthode peut remplacer les procédés standards de SPE lors de l'étude de la contamination d'échantillons d'eau par des méthodes d'immunodétection, telles que les immunoessais en microplaque ou les biocapteurs. Les principaux avantages de cette technique sont l'automatisation de la procédure SPE ainsi qu'une empreinte réduite et un coût inférieur des instruments par rapport aux approches traditionnelles.En outre, les performances du processus d'enrichissement répondent aux exigences d'analyse des immunodosages, tant en termes de faible teneur en solvant qu'en efficacité de préconcentration. Tout d'abord, filtrer un échantillon d'eau de 100 millimètres à l'aide d'un filtre de taille de pore de zéro virgule deux micromètre. Placer l'échantillon filtré dans un flacon en verre doté d'un filetage GL 45.Préparez 300 microlitres d'éluant en diluant du méthanol dans de l'eau déionisée à 50 pour cent en volume dans un tube hermétique. Ensuite, préparez une suspension de 20 milligrammes par millilitre de particules de sorbant en silice octadécyle en ajoutant 1 600 microlitres de méthanol suivis de 400 microlitres d'eau déionisée à 40 milligrammes de sorbant en phase inversée dans un flacon en verre. Fermez hermétiquement le couvercle et agitez à l'aide d'un vortex. Placer une membrane en nylon de taille de pore de 11 micromètres sur une double couche de papier anti-poussière. Découper deux petits morceaux dans la membrane à l’aide d’un poinçon de trois millimètres de diamètre. Ensuite, saisir l’un des petits morceaux de membrane à l’aide de pinces plates pour filtres et le placer sur un côté de la colonne.Ensuite, vissez le raccord à fond plat avec le tube et serrez fermement. Puis, dessinez une flèche sur le corps de la colonne, pointant vers l'extrémité où la membrane a été placée. À ce stade, fixez la colonne sur le support avec la flèche orientée vers le bas.Fixez une seringue jetable vide de 10 millilitres à l'extrémité du tube de la colonne à l'aide des raccords de verrouillage inférieurs. Agitez la suspension de sorbant avec le mélangeur vortex et pipetez rapidement 100 microlitres au centre de la colonne. Pendant l'injection, aspirez doucement la solution pipetée à travers la membrane en utilisant la seringue de l'autre main.La préparation de la colonne SPE est très importante. Vous devez vous assurer d'aspirer correctement la solution à travers la membrane à l'aide de la seringue tout en injectant la suspension de particules dans la colonne. Sinon, les particules ne seront pas compactées de manière dense.Répétez le processus précédent deux fois de plus, en agitant la suspension mère entre chaque étape de pipetage, afin de garantir une suspension homogène des particules dans la solution. Une fois que toute la suspension a été chargée et séchée par aspiration à l’aide d’une seringue, maintenez la seringue en place et placez le deuxième membrane en nylon par-dessus à l’aide de la pince tenue de l’autre main. Ensuite, vissez le deuxième raccord muni d’un tube et jetez la seringue.À ce stade, resserrez la colonne sur le dispositif SPE en utilisant les connecteurs de verrouillage inférieurs. Connectez la bouteille contenant l'échantillon au dispositif en vissant le bouchon de sécurité GL 45 fourni. Ajoutez 200 microlitres d'éluant dans le réservoir d'éluant.Ensuite, chargez 800 microlitres d'eau déionisée dans le réservoir de dilution. Vérifiez que le régulateur de pression est en position fermée en le tournant dans le sens inverse des aiguilles d'une montre jusqu'à ce qu'aucun mouvement supplémentaire ne soit possible. Après avoir mis le prototype sous tension, saisissez les valeurs 580 pour pset et 30 pour delta pset.Pour régler le régulateur de pression, démarrez la pompe. Ensuite, tournez manuellement le régulateur de pression jusqu'à ce que la valeur lue pour preg soit inférieure mais proche de 320 millibars. Après avoir arrêté la pompe, démarrez la procédure SPE en appuyant sur démarrer dans le coin du mode automatisé.Une fois la procédure SPE terminée, fermez le petit flacon d'échantillon et conservez-le à quatre à cinq degrés Celsius à l'abri de la lumière jusqu'à l'analyse par ELISA. Pour nettoyer le système, préparez une solution de 10 millilitres de méthanol à 70 pour cent en volume dans un flacon en verre avec filetage GL 45. Débranchez la colonne SPE, puis obturez les tuyaux à l'aide de raccords.En mode automatisé, sélectionnez le fichier de nettoyage et démarrez-le avec les mêmes réglages de pression utilisés précédemment pour pset, delta pset et preg. La reproductibilité du tassage du sorbant a été évaluée par séchage et pesée du sorbant pipeté dans des vials en verre. La reproductibilité du temps d'injection a été testée sur des échantillons de 100 millilitres.Les concentrations des échantillons dopés initiaux et préconcentrés ont été déterminées à l’aide d’un kit ELISA commercial de 17 bêta-estradiol. Il ressort clairement des courbes d’étalonnage que le ratio de méthanol provenant de l’échantillon enrichi n’affecte pas la sensibilité du dosage immuno-enzymatique. Les rendements de récupération, calculés respectivement pour l’eau déionisée et l’eau de mer artificielle, étaient de 128 ± 22 % et de 107 ± 6 %.Une fois maîtrisée, la préparation d'une colonne SPE peut être effectuée en moins de cinq minutes, à condition d'être réalisée correctement. L'ensemble de la procédure SPE peut être terminé en moins d'une heure. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des sciences de l'environnement pour explorer l'élaboration de méthodes d'immunodétection destinées à la surveillance des polluants organiques de petite taille.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des échantillons d'eau à l'aide de notre instrument automatisé économique pour l'analyse de polluants par des immunodosages. N'oubliez pas que le travail avec des polluants organiques et des solvants peut présenter des risques, et que des précautions telles que le port de gants adaptés et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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